一種多肽及其在製藥中的應用的製作方法

2023-09-21 06:25:05 2

專利名稱：一種多肽及其在製藥中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥及糖尿病領域，涉及一種多肽(NUCB2的肽段，例如=Pladin 或nesfatin-Ι)及其在製藥中的應用。
背景技術：
糖尿病的發病率在全世界範圍內正以一種驚人的速率增加，尤其是在發展中國 家。糖尿病人體內的過多血糖會損害血管、神經、眼部以及腎臟的機能，最終會導致嚴重的 心血管疾病、神經症、目盲和腎衰竭。因此，如何控制血糖是糖尿病治療中的需要面對的最 關鍵的問題。對於缺乏胰島素的I型糖尿病人而言，在食物攝入之前注射胰島素可以預防高血 糖症的發生。而對於體內胰島素表達量減少或胰島素耐受的病人，即II型糖尿病人而言， 血糖水平上升是引起發病和死亡的諸多複雜因素之一。現在有許多藥物被用來控制II型 糖尿病人的血糖水平，其中包括1)磺脲類，可以促進胰島釋放胰島素；2) 二甲雙胍，可以減 少肝臟的葡萄糖產生；3)格列酮類，作為過氧化物酶體增殖體活化受體-Y (PPAR-y)的激 動劑，可以刺激胰島素受體下遊的信號通路；4) α-葡萄糖苷酶抑制劑，可以幹擾腸對葡萄 糖的吸收；5)腸促胰島素，作為胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-lrec印tor)的激動劑可以促 進胰島素分泌；6) 二肽基肽酶-IV抑制劑(DPP-IV inhibitors)，可以抑制內源性GLP-I的 降解並增強胰島素分泌；最後，還有胰島素本身可以抑制葡萄糖的產生並提高葡萄糖的利 用率(Moller，2001)。但是，真正能治療II型糖尿病的藥物尚未被發現，因為上述藥物在使 用和功效上都有各自的限制。在研究中應用突變體小鼠有助於探明主導能量消耗的調控迴路，並進一步理 解肥胖症和糖尿病的病因。其中一個著名的實例是關於瘦素(Ieptin)的研究，缺失了 1印tin(l印_勺或1印tin受體(1印r+)的小鼠會產生肥胖、糖尿病、不育、攝食過度和乏力 等症狀(Chua et al.，1996)。下丘腦可以分泌表達一系列的分子參與對飲食行為的調控。核連蛋白 2(nucleobindin 2，NUCB2或稱為NEFA)就是一種由下丘腦分泌的包含396個胺基酸的蛋 白，在人類、小鼠與大鼠種群中高度保守。由NEFA基因編碼的多肽包含一個鈣離子結合結 構域(EF結構域)和一個DNA結合結構域。NEFA與nucleobindin具有高度的同源性，被認 為是能夠與鈣離子反應的DNA結合因子超家族(EF超家族)中的一員。NUCB2注射到大鼠腦部後會促進其食慾減退和體重下降。NUCB2在翻譯後期經過 激素原轉化酶的切割後會生成一個N端片段Nesfatin-1 (NEFA/nucleobindin2編碼的影 響食慾和肥胖的蛋白)和兩個C端肽段，Nesfatin-2和Nesfatin-3。Nesfatin-I保留了 NUCB2的所有引起食慾降低的性質。側腦室(i. c. v.)或腹腔(i. p.)注射Nesfatin-I都會 抑制食物的攝入並導致體重下降。在體內，NUCB2向Nesfatin-I的轉化對其活性而言是必 需的。Nesfatin-I被發現存在於下丘腦的離散的細胞核中，其很可能在此參與激活了一條 不依賴於1印tin的黑皮質素(melanocortin)信號通路。Nesfatin-I可以通過不飽和系統
3雙向出入血腦屏障(BBB)。NUCB2同樣也在脂肪組織細胞系3T3L1中表達，這意味著Nesfatin-I除了在腦部 和外周部分並影響腦功能以外還有其他作用。大鼠體內的Nesfatin-I可以刺激鈣離子的 注入並且與一個目前尚不明確的G蛋白偶聯受體發生相互作用。雖然纖溶酶原(plasminogen)系統的主要功能是使纖維蛋白降解，但是其在腦部 也具有一定的神經學功能。纖溶酶原及其激活劑(TPA和uPA)在發育中及成熟的腦部組織 中均有表達，包括在海馬椎體神經元和樹突中。有報導認為，纖溶酶(plasmin)參與了在中 腦垂體中源自前阿黑皮素前體(POMC precursor)的激素的形成過程(Selvarajanet al.， 2001)。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有降血糖和/或降血脂作用的多肽。本發明的另一個目的是提供上述多肽在製藥中的應用。在先前的報導中，Nesfatin-I被認為是一種通過下丘腦中的melanocortin信號 影響食慾從而抑制食物攝入的分子。在此本發明提出，在db/db小鼠模型中，Nesfatin-I 除了抑制食慾之外，還能從外周改善糖尿病症狀。我們假設Nesfatin-I是plasmin的一種 可能的底物，基於這一假設，我們設計了 plasminogen、Ieptin受體和1印tin基因雙缺失 的小鼠模型來研究肥胖(ob/ob)和糖尿病(db/db)動物體內Nesfatin-I增加所產生的影 響。在db/db和ob/ob動物模型中，基因雙敲除的小鼠與對照組相比下丘腦的Nesfatin-I 表達量顯著增加、食物攝入明顯減少，體重增加。纖溶酶原缺失後，db/db小鼠的高血糖和 高胰島素水平也趨於正常。我們發現，Nesfatin-I在血清中的含量高於在下丘腦中，並且 在自由進食時高於空腹時。有趣的是，我們還發現腦部的組織型纖溶酶原激活劑含量在自 由進食時低於空腹時，與Nesfatin-I的蛋白水解酶滅活作用相關。我們認為在外周血中的 Nesfatin-I能夠，至少是部分被plasmin降解，這主要是基於以下兩點發現其一是靜脈注 射的氨甲環酸(AMCA)和抑肽酶(aprotinin)對纖溶酶原基因敲除的db/db小鼠具有類似 的作用，其二是靜脈注射的Nesfatin-I在pig+小鼠中被清除的速率比在plgv+小鼠中慢 很多。給db/db小鼠外周注射Nesfatin-I可以顯著降低其血糖水平。由於Nesfatin-Ι的 作用是胰島素依賴性的，將其發展成一種新的治療II型糖尿病的藥物是非常有希望的。本發明還發現了一種天然存在的含有69個胺基酸的NUCB2肽段(命名為Pladin， 源自 plasma anti-diabetic nucb2 peptide or plasmin related anti-diabetic nucb2 peptide)。Pladin在plasminogen、1印tin受體和1印tin基因雙缺失的小鼠血清中的水平 均有所上升，在纖溶酶原缺失時具有抗糖尿病的作用。給db/db小鼠靜脈注射重組Pladin 可以顯著降低其血糖水平。Pladin的抗高血糖作用對於時間、劑量以及胰島素都呈現依賴 性，並且只在外周起作用。通過定點突變的研究表明，plasmin在Pladin的滅活過程中具 有重要作用。與Nesfatin-I—樣，重組Pladin也具有抑制食慾的作用。為了避免神經心 理學方面的影響，我們還設計了一種具有長期作用的Pladin，其在體內並不會進入腦部。我 們認為，Pladin作為一種新型的胰島素輔助藥物，將會帶給我們新的II型糖尿病的治療方 案。本發明的目的是通過下列技術方案實現的
一種(a)或(b)的多肽(a)由SEQ ID NO 22所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有降 血糖和/或降血脂作用的由(a)衍生的多肽。所述的多肽，該多肽是SEQ ID NO :22除Ser19以外的位點經過取代、缺失或者添加 一個或幾個胺基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(a)衍生的多肽。所述的多肽，該多肽是由SEQ ID NO :24所示的胺基酸序列組成的多肽。一種多肽，該多肽是胺基酸序列包含(a)或(b)所述多肽的胺基酸序列且具有降 血糖和/或降血脂作用的多肽。所述的多肽，該多肽是(C)或(d)的多肽(c)由 SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO :25所示的胺基酸序列組成的多肽。(d)在(C)中的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有降 血糖和/或降血脂作用的由(C)衍生的多肽。所述的多肽，該多肽為是SEQ ID NO :23除Ser65以外的位點經過取代、缺失或者添 加一個或幾個胺基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由SEQ ID NO 23衍生的多肽。所述的多肽，該多肽為SEQ ID NO :23 中發生 Arg13 — Ala、Lys28 — Ala、 Lys43Lys46 — Ala、Lys67 — Ala、Lys2 — Ala 或 Arg53Arg56 — Ala 取代的胺基酸序列組成的多 肽。以上任一多肽、該多肽(即以上任一多肽)的乙醯化產物、該多肽與白蛋白的複合 物、該多肽降解水解酶的抑制物、或者含有該多肽及其降解水解酶抑制物的組合物在製備 降血糖藥物和/或降血脂藥物中的應用。所述的應用，其中降血糖藥物為治療糖尿病的藥物；降血脂藥物為降低血液中甘 油三酯、總膽固醇或低密度脂蛋白的藥物。所述的應用，其中糖尿病為I型或II型糖尿病。所述的應用，其中該多肽降解水解酶的抑制物為纖溶酶抑制物，優選抑肽酶、氨甲 環酸、氨基己酸或它們的類似物。以下是本發明的詳細說明接下來的內容用來描述本發明。用來的描述本發明的術語如果缺少明確的定義， 應給出其通俗意思以被該領域的普通讀者所理解。本文中的「Pladin」是一段自然存在的含有69個胺基酸的nUcb2多肽片段 [取 ρlasmaanti-diabetic nucb2 peptide 或 plasmin related anti-diabetic nucb2 peptide (抗糖尿病或與抗糖尿病相關的nucb2多肽)的詞頭而命名為Pladin]，這在本次 應用中首次發現。本文的nucleobindin是一類含有可結合Ca2+的EF手型構象的多功能蛋白 質。迄今為止，已有兩類nucleobindin被確定，分別為NUCBl和NUCB2。這裡的NUCB2即 nucleobindin 2，也叫 NEFA (DNA binding/EF-hand/acidic protein)。儘管 NUCBl 和 NUCB2 分別被兩個單獨的互不相聯的基因所表達，但二者具有高度同源性，胺基酸序列相似度達 62%。NUCBl和NUCB2的主要特徵是含有很多功能區，包括一個信號肽，一個亮氨酸/異亮
5氨酸富含區，一個推測的核定位信號區以及一個DNA結合區，兩個可結合Ca2+的EF手型構 象和一個亮氨酸拉鏈區。本文利用纖溶酶原缺失的db/db或ob/ob小鼠揭示了纖溶酶原/纖溶酶對代謝平 衡如食慾，體重和血糖的直接影響。更為重要的是，基於這些發現，我們利用比較血漿蛋白 組學的方法找到了一個存在於血漿的抗糖尿病的多肽pladin。由於pladin的活性主要被 纖溶酶所抑制，因此它被認為是纖溶酶原缺失的db/db小鼠具有抗糖尿病的主要原因。相比於其它所有的抗高血糖的藥物，pladin無疑是一類新的胰島素輔助劑。在 模擬II型糖尿病的高血糖db/db小鼠中，靜脈注射IOnmol rPladin可以顯著維持6小時 的低血糖而不需要藉助任何的胰島素。其作用是劑量，時間和胰島素依賴的，並且是在外 周血中。Nesfatin-I是之前報導過的一個含82個胺基酸的可以抑制飲食的nucb2多肽 (SEQID NO 18)，我們通過靜脈注射，腹腔注射和側腦室注射rPladin發現具有同樣的抑制 飲食的效果。相反，我們還發現在db/db小鼠上靜脈注射nesfatin-Ι可以降低血糖，這和 rPladin相似。Nesfatin-I被推測是位於nucb2上一段可以被激素原轉化酶酶解的位置。 Nesfatin-I的降糖作用在以往的報導中被忽視了，原因可能是採用的是腹腔注射和非高血 糖動物。雖然Pladin可以在腦內作用影響飲食，但它的抗高血糖作用卻發現僅僅在外周。 在db/db小鼠上限制卡路裡和側腦室注射rPladin均不能影響血糖和胰島素水平。另外， 飢餓不會影響db/db小鼠血液內的胰島素水平。Nesfatin-I的半衰期為9到10分鐘中，同樣，我們發現rPladin在血液循環中的 半衰期也低於10分鐘。然而，其抗高血糖作用卻可以維持6小時以上(圖13A)，說明了它 的的胞內信號可以持續很久。雖然Pladin抗高血糖的細胞內機制還不清楚，但肯定和胰島 素的信號通路有關。在一個體外實驗中，我們發現rPladin的抗高血糖作用可以被PPAR-γ 的抑制劑(GW9662)和AMPK抑制劑(Compound C)所阻斷，PPAR- γ和AMPK是胰島素信號 通路中的兩個關鍵元素。我們將Pladin乙醯化或者將Lys或Arg突變為Ala以避免被纖 溶酶酶解，發現這樣的pladin在血液循環中的半衰期可以顯著延長，這個結果吻合了我們 認為pladin的活性主要被纖溶酶抑制的推測。同時，將pladin和血清蛋白偶聯可以顯著 防止血管外排斥，儘管該偶聯沒有使pladin的蛋白水解活性失活。在本文提到的實驗中， 通過乙醯化和偶聯化，rPladin的活性可以上升到36小時，這兩個反應可以通過重組技術 實現，用來提高Pladin的穩定性。此外，由於AMCA(氨甲環酸)在臨床上可以減少手術中的失血並且在高糖的db/ db小鼠上能夠有效模擬pladin的作用(圖12A-E)，因此AMCA被成功應用於術後高血 糖症。在4位術後血糖為10-12mmol/L的病人上使用10mg/kg的AMCA，血糖快速下降至 6.8-9. 2mmol/L0雖然pladin被發現天然存在於血液循環中，但並不清楚它是如何從它的前體 nUCb2轉化而來並釋放到血液中的。Nucb2的mRNA及其相關蛋白已發現存在於胃黏膜，旁 心室，丘腦下部的視上核以及胰島中(Gonzalez et al.，2009 ；Oh-I et al.，2006 ；Stengel et al.，2009)，當動物飢餓時在丘腦下部的含量會下調(0h_I et al.，2006)。我們發現在 野生型和db/db小鼠中，相對於自由餵食，飢餓可以顯著降低血漿中pladin的水平，這和之 前的發現一致。Pladin和胰島素的作用類似，密切調節血糖的代謝和飲食，這說明了它在機 體代謝調控中的重要性。因此，對pladin更深入的研究將有助於我們更好的了解能量代謝
6和對II型糖尿病的創新性治療。本文提出了一個通過使用有效劑量的多肽如Nesfatin-1，pladin(plasma anti-diabeticnucb2 ρ印tide)，或其中的功能等價體，用於製備治療糖尿病的藥物。一 般而言，給藥方式可包括靜脈注射，皮下注射或者口服。在一實驗方案中，多肽來自於人 源或齧齒目動物。Nesfatin-I和pladin的功能等價體就是指能體現它們功能的東西，比 如Nesfatin-I的同源肽，pladin的同源肽，或者其中的一段衍生肽等，但並不局限於這 些。利用標準方法學，利用一個很常見的技術便可以很容易地測定Nesfatin-I或pladin 的功能片段。比如通過重組技術獲得切割過的Nesfatin-I或pladin或者Nesfatin-I或 pladin的部分片度，然後利用本文前面介紹的檢測方法來檢測它們的抗糖尿病活性。此外， Nesfatin-I或pladin的突變體同樣可以檢測。本實驗方法中使用的分子包括Nesfatin-I 或pladin的完整肽段，部分片段和突變體。在一實驗方案中，pladin, nesfatin-Ι和二者 的功能等價體均包括了 SEQ IDNO :22或者SEQ IDNO :24的胺基酸序列。在另一實驗方案 中，pladin突變了 Arg13或Lys28。然而在另一實驗方案中，多肽是一個偶聯分子用來提高 分子量。一個很常見的技術即通過偶聯常見的載體蛋白如血清蛋白，免疫球蛋白，Fc段，載 脂蛋白等很容易地構建一個高分子量的nesfatin-Lpladin或二者的功能等價體。這樣偶 聯的nesfatin-Ι或pladin可以降低血糖但不會穿過血腦屏障。另外，多肽還可以被修飾， 如pladin被乙醯化等。本文同時提出了一個通過使用有效劑量的多肽如Nesfatin-1， pladin (plasmaanti-diabetic nucb2 ρ印tide)，或其中的功能等價體，從而降低血液中甘 油三脂，總膽固醇或LDL的方法。多肽的描述和應用案例已經在上面闡述過。以上方法(上述降低血液中血糖，甘油三脂，總膽固醇或LDL的方法)可用於治療 II型糖尿病，也可以用於治療I型糖尿病，但對於I型糖尿病則需要胰島素(insulin)的輔 助治療。另外，以上方法同樣可以降低體重或抑制飲食。本文同樣提出了一個通過使用有效劑量的纖溶酶抑制劑，以提高外周Nesfatin-I 或pladin (plasma anti-diabetic nucb2 peptide)的水平，從而治療糖尿病的方法。纖溶 酶抑制劑有抑肽酶，AMCA (氨甲環酸)，EACA ( ε -氨基己酸)或其類似物，但並不局限於這些。本文還提出了一個通過使用有效劑量的纖溶酶抑制劑，以提高外周Nesfatin-I 或pladin (plasma anti-diabetic nucb2 peptide)的水平，從而降低血液中甘油三脂，總 膽固醇或LDL的方法。纖溶酶抑制劑有抑肽酶，AMCA(氨甲環酸)，EACA( ε-氨基己酸)或 其類似物，但並不局限於這些。本文同時還提出了多肽作為藥物治療糖尿病或降低血液中甘油三脂，總膽固醇或 LDL的用途。這些多肽已經在前面討論過，其用途可用於治療II型糖尿病，或者聯合胰島素 治療I型糖尿病。本發明還提供了將纖溶酶抑制劑製備成治療糖尿病或者降低血液中甘油三酯、 膽固醇或低密度脂蛋白的藥物的用途。纖溶酶抑制劑有例如抑肽酶，AMCA(氨甲環酸)， EACA( ε -氨基己酸)以及它們的類似物，但並不僅限於這些。本發明還提供了一種纖溶酶原基因純合阻斷的轉基因糖尿病或者肥胖鼠類，相比 纖溶酶原基因沒有被阻斷的糖尿病或者肥胖鼠類，這些鼠血糖血糖較低或者體重較輕。在
7一個實施例中，這些轉基因鼠類還包含有純合的瘦素或者瘦素受體基因阻斷。在一個實施 例中，這些轉基因鼠類是小鼠。這種轉基因動物在藥物篩選、以及nesfatin-Ι或paldin的 清除實驗等一系列研究中將會起到很大作用。本發明還提供了一種用於篩選能夠提高外周血或者腦中nesfatin-Ι或paldin含 量的試劑的方法，該方法包括如下步驟(1)給實驗對象注射待篩選的試劑；(2)從實驗對 象收集血液或者腦組織樣本；(3)檢測樣本中的nesfatin-Ι或者pladin，如果相比取自用 對照物質處理的實驗對象的樣本，nesfatin-Ι或者pladin的含量有增加，則指示該待篩選 試劑能夠提高外周血或者腦中nesfatin-Ι或paldin的含量。在一個實施例中，該篩選方 法中所用的實驗對象是上面述及的轉基因鼠類。在一個實施例中，nesfatin-Ι或paldin 的含量是利用下面描述的高效液相色譜法來測定的。在另外一個實施例中，nesfatin-Ι或 paldin的含量是通過一系列利用抗nesfatin-Ι或paldin的抗體的實驗方法(例如酶聯免 疫吸附法)來測定的。H了一禾中;白勺 pladin (plasma anti-diabetic nucb2 peptide)
與其功能相同的物質。在一個實施例中，Pladin或者其功能相同物質包含有SEQ ID NO 19-25中的任意一個序列。在另一個實施例中，pladin的序列在第13位的精氨酸或者第28 位的賴氨酸處有突變。本申請書中引用了大量的參考文獻，這些參考文獻的引用，是為了更好地描述本 發明所處的技術發展水平。本發明的有益效果本發明提供的一系列多肽、該多肽的乙醯化產物、該多肽與白蛋白的複合物、該多 肽降解水解酶的抑制物、或者含有該多肽及其降解水解酶抑制物的組合物等具有較好的降 血糖和/或降血脂的作用，可用於製備降血糖和/或降血脂的藥物，尤其可用於製備治療糖 尿病的藥物，具有很好的應用前景。


圖中的數據均以圖例說明中指出的平均值士標準偏差(SEM)體現。所有數據均 代表至少三次不同實驗。不同組數據間的比較均依照學生T檢驗雙尾法進行，當ρ值小於 0. 05時認定組別差異顯著。圖1表示(a)小鼠Nesfatin-Ι的胺基酸序列。箭頭所示之處為可能的plasmin 酶切位點。(b)Nesfatin-Ι被plasmin完全消化2小時後的片段。圖2表示用HPLC檢測下丘腦中Nesfatin-Ι的含量，其中表示(a)各小鼠基因型 中，(b)表示空腹時與自由進食時。數據以平均值士標準偏差(SEM)體現，平行樣本數為 四(每個樣本含4份下丘腦樣品)。圖3表示plg+Ι印r+小鼠比對同窩小鼠(包括plgv+l印r+)的下丘腦中編碼 神經肽的mRNA的表達量。所有檢測均採用定量實時PCR進行，並對mRNA的表達量採用 gadph(其中(a)為agrp，(b)為npy，(c)為pome)歸一化處理。數據以平均值士標準偏 差(SEM)體現，平行樣本數為三。圖4表示(a)小鼠下丘腦組織抽提物的SDS-PAGE明膠酶譜 control-TPA(tissueplasminogen activator，組織型纖溶酶原激活劑)標準品，ff-自由
8進食，f_空腹；(b)小鼠的血清Nesfatin-I水平；(c)注射Nesfatin-I或緩衝鹽溶液之後的 小鼠的血糖水平；(d)靜脈注射的Nesfatin-I的劑量依賴性；(e)靜脈注射的Nesfatin-I 的時間依賴性；(f)野生型小鼠的靜脈葡萄糖耐量試驗(IGTT) ； (g)Nesfatin-I對鏈脲黴素 (Streptozotocin)誘導的I型糖尿病C57BL/6J小鼠的影響，每組含4隻雄性小鼠。數據以 平均值士標準偏差(SEM)體現(*表示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0. 01)，小鼠的數量標註在 括弧中，saline (生理鹽水，下同)。圖5表示(a)給db/db小鼠靜脈注射AMCA和aprotinin 30分鐘後的血清 Nesfatin-I水平。圖5a中顯示的「saline」組的Nesfatin-I水平低於「ff db/db」組是因 為注射後血液稀釋所導致的。(b)靜脈注射3天AMCA(15mg/日)後的體重下降情況。(c) 靜脈注射3天AMCA(15mg/日)後的食物攝入量變化。小鼠的數量標註在括弧中。圖6表示弓狀核AgRP的免疫組織化學結果，其中(a)為plg+Al印rv+小鼠；(b)為 plg+Ι印小鼠；(c)為plg+Ι印r+小鼠；(d)為plg"+l印r+小鼠。圖7表示缺失纖溶酶原時db/db小鼠和ob/ob小鼠的體重與食物攝入減少情況， 以及歸一化的db/db小鼠的血糖和血清胰島素水平。其中(A，C)為plg/1印r小鼠和(B，D) 為plg/1印小鼠在24周飼料餵養後的體重情況，及其在5、10、15、20周齡時的每日食物攝 入情況；(E)為空腹的超齡小鼠血糖水平；(F)為12周齡的小鼠血清胰島素水平；(G) 16 18周齡的小鼠在腹膜葡萄糖耐量試驗(IP-GTT)中的血糖水平。數據以平均值士標準偏 差(SEM)體現(*表示p<0.05，**表示p<0.01，對照於肥胖小鼠)，小鼠的數量標註在 括弧中。圖8表示重組Pladin的抗高血糖作用的時間、劑量及胰島素依賴性，其中㈧為 plg+Ι印r+小鼠和plgv+l印r+小鼠的血清Pladin水平；⑶為注射了重組Pladin的小鼠 血糖水平；(C)為靜脈注射的重組Pladin的劑量依賴效應；(D)為靜脈注射的重組Pladin 的時間依賴效應；(E)為靜脈注射重組Pladin後的野生型小鼠的靜脈注射葡萄糖耐量試 驗(IV-GTT)結果；(F)為重組Pladin對鏈脲黴素(Str印tozotocin)誘導的I型糖尿病 C57BL/6J小鼠的影響，每組含4隻雄性小鼠。數據以平均值士標準偏差(SEM)體現(*表 示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0.01)，小鼠的數量標註在括弧中。圖9表示對重組Pladin的結構鑑定，其中(A)用RP-C18-HPLC分析血清Pladin 水平，樣本為自由餵食的野生型小鼠的25 μ L血清；(B)用MALDI-T0F測定Pladin的相對 分子質量；(C)用MALDI-T0F/T0F測定酶切Pladin肽段並推導其胺基酸序列。圖10表示重組Pladin的減少食慾的作用與其抗高血糖的作用不相關。(A)側腦 室(i. C. V.)和腹腔(i. P.)注射Nesfatin-I或重組Pladin的大鼠0-3小時內的食物攝入 情況。(B)側腦室(i. c. v.)、腹腔(i. p.)以及靜脈(i. v.)注射Nesfatin-I或重組Pladin 的db/db小鼠的血糖水平。(C)限制熱量攝入超過7周的db/db小鼠的空腹血糖水平。(D) 限制熱量攝入超過7周的db/db小鼠的血清胰島素水平。數據以平均值士標準偏差(SEM) 體現(*表示p<0. 05)，小鼠的數量標註在括弧中。圖11表示Pladin在體外被plasmin滅活。(A)小鼠Pladin的胺基酸序列。箭 頭所示之處為可能的plasmin酶切位點。(B)重組Pladin及其變體被plasmin完全消化。 (C)用重組Pladin和plamin消化過的重組Pladin注射db/db小鼠後的血糖水平。數據以 平均值士標準偏差(SEM)體現(*表示ρ <0.05)，小鼠的數量標註在括弧中。
圖 12 表示 AMCA、GW9662、複合物 C(Compound C)、羅格列酮(rosiglitazone)、纖 溶酶原基因敲除(Plg+)以及空腹對血清Pladin水平的影響。(A)靜脈注射15mgAMCA10 分鐘後db/db小鼠的血清Pladin水平。圖12A中顯示的「saline」組的Pladin水平低於 "free fed db/db」組是因為注射後血液稀釋所導致的。(B)靜脈注射3天AMCA(15mg/日) 後的體重下降情況。(C)靜脈注射3天AMCA (15mg/日)中第三天的食物攝入情況。(D)從 2周齡起連續每日注射AMCAlO周后的db/db小鼠的空腹血糖水平，以緩衝鹽溶液為對照。 (E)靜脈注射IOnmol的重組PladinlO分鐘後的野生型及plgv_鼠的血清Pladin水平。(F) 注射重組Pladin、GW9662、Compound C和rosiglitazone3小時後的db/db小鼠的血糖水 平。自由進食和空腹的野生型和db/db小鼠的血清Pladin水平。數據以平均值士標準偏 差(SEM)體現(*表示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0. 01)，小鼠的數量標註在括弧中。圖13表示plasmin抵抗突變體、第65位絲氨酸、乙醯化作用以及與白蛋白偶聯 對重組Pladin的抗高血糖活性的影響，用(A)重組Pladin、(B-H)各種突變體、(I)重組 Pladin-白蛋白、(J)乙醯化重組Pladin以及(K)乙醯化重組Pladin-白蛋白靜脈注射db/ db小鼠後的血糖水平，每組含5隻db/db小鼠。數據以平均值士標準偏差(SEM)體現(* 表示 ρ < 0. 05) ο圖14表示plasmin抵抗突變體(A90、A91和A92)對重組Pladin的抗高血糖活性 的影響，用IOnmol的重組Pladin及突變體靜脈注射db/db小鼠後的血糖水平，每組含5隻 db/db小鼠。圖15是注射Nesfatin-I顯著降低血液中甘油三酯，總膽固醇和低密度脂蛋白而 非高密度脂蛋白含量的數據。圖中84p是nesfatin-Ι的代號。取各小鼠血清，送南京大學 校醫院測量血脂指標，包括甘油三酯，總膽固醇，高密度脂蛋白總膽固醇，低密度脂蛋白總 膽固醇。圖中標為standard數據表示的是人正常血清中的含量的正常值的上限。比較ob/ ob組總給藥與不給藥情況，發現，84P(nesfatin-l)對於甘油三酯，和總膽固醇的改善比較 明顯。圖中各組別括號內數據為小鼠周齡。圖16表示給db/db小鼠分別注射IOnmol/只rNesfatin_l、0. 45 μ g/克體重的 GW9662.20 μ g/克體重的Compound C、10 μ g/克體重的羅格立酮後三小時的血糖值。數據 以平均值士標準偏差(SEM)體現(*表示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0. 01)，小鼠的數量標註 在括弧中。圖17靜脈注射白蛋白-nesfatin-Ι偶聯物在6小時內顯著降低了 db/db小鼠 的血糖水平(P < 0.01)。圖中「BSA+84P」代表白蛋白與nesfatin-Ι單體偶聯物。圖中 「BSA+n84p」代表白蛋白與nesfatin-l多體偶聯物。db/db小鼠周齡為12-16周，每實驗組 5隻小鼠。測量藥物注射後三小時的血糖值。圖18表示給每隻db/db小鼠分別靜脈注射生理鹽水、IOnmol rPladin、30nmol的 合成多肽(SEQ ID NO 22)、30nmol的合成多肽(SEQ ID NO 24)、5nmol的78個胺基酸的重 組蛋白質多肽(SEQ ID NO 25)後三小時的血糖值(ρ < 0. 01)。數據以平均值士標準偏 差(SEM)體現。db/db小鼠周齡為12-16周，每實驗組6隻小鼠。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明進行進一步闡述，使得本發明更容易被理解，但並
10不限制本發明。以下實施例中沒有詳細描述的實驗操作步驟均系本領域技術人員熟悉的操作步
馬聚ο實施例1 =Nesfatin-I介導纖溶酶原在肥胖及糖尿病動物體內的作用Nesfatin-I是一段假設來自於NUCB2的多肽片段，在近期被鑑定為一種與下丘腦 中黑皮質素信號相關聯的食慾減退因子。在腦室或者腹腔中注射nesfatin-Ι能夠減少進 食，進而降低體重。nesfatin-Ι的胺基酸序列，從小鼠到人，都是高度保守的，並且擁有幾個 公認的纖溶酶的酶切位點(圖la)。因此，nesfatin-Ι被假設能夠介導纖溶酶原在肥胖及 糖尿病動物體內的作用。為了證明這個假設，我們利用基因工程化的大腸桿菌表達並純化了重組的 nesfatin-Ι。將其與纖溶酶共同孵育，如預期般nesfatin-1被迅速降解了(圖lb)。有趣 的是，相比基因型為plg+Ι印r+的非肥胖的同窩對照，基因型為plgv+l印r+的動物下丘 腦中nesfatin-Ι的濃度顯著偏低(圖2a)，說明纖溶酶原或者纖溶酶至少在一定程度上導 致了 nesfatin-Ι的減少。plg+Ι印r〃_動物下丘腦中nesfatin-l的濃度與該動物的進食 和體重情況是相關聯的。相比自由進食的小鼠，飢餓小鼠下丘腦中nesfatin-1的濃度往往 更低(圖2b)。此外，纖溶酶原的缺失，為研究因攝食過度而肥胖的動物體內濃度長期偏高 的nesfatin-1所帶來的影響提供了一條獨特的途徑，因為nesfatin-l在體內半衰期很短 暫，通過腦室或者腹腔注射無法達到這一目的。隨後又發現，相比基因型為的 動物，基因型為plg+1印r+的動物體內agrp和npy減少了，pome則增加了(圖3)，這與 先前關於腦室注射nesfatin-1不改變pomc，npy和agrp表達的報導並不一致。而該研究 組最近報導，腹腔注射nesfatin-1能夠上調pome的表達，這與目前的發現是一致的。就邏輯而言，nesfatin-Ι的水解減少需要纖溶酶的生成。當實驗動物從自由進 食狀態改變為飢餓狀態時，下丘腦中組織型纖溶酶原激活劑(TPA)的活性確實增加了(圖 4a)，與下丘腦中nesfatin-1濃度的變化具有很好的關聯性(圖2)。這是第一次顯示TPA/ 纖溶酶原系統與飲食習慣有關，之前該系統被認為與學習過程相關。人們普遍認為餵食能 夠有效地促進動物的學習過程。Nesfatin-I似乎將大腦的這兩個重要功能聯繫了起來。如上所述，db/db小鼠的糖尿病症狀在plg+Ι印r+基因型的小鼠中被消除了，這 一點令人驚嘆，但這並不能用nesfatin-Ι的食慾減退作用來解釋。db/db小鼠，無論是通過 飢餓、熱量攝入限制還是腦室注射nesfatin-Ι，都很少能夠使得糖尿病症狀得到改善。因 此，纖溶酶原缺失帶來的抗糖尿病作用也許是在發生在外周血中的，而並不是通過神經系 統。靜脈注射100 μ g nesfatin-1能顯著降低自由進食的db/db小鼠的血糖濃度，但是對 飢餓的db/db小鼠和瘦的野生型小鼠沒有作用(圖4c)。這個抗糖尿病效果是呈劑量和時 間依賴性的(圖4d，e)。雖然nesfatin-1在循環血液中的半衰期僅有10分鐘，但是它的作 用能持續6小時以上，暗示存在著一種持久的胞內機制。在用野生型小鼠進行的IGTT實驗 中，靜脈注射1. 5g/kg葡萄糖後，IOOyg nesfatin-1能顯著增強血糖的吸收，而在注射Ig/ kg葡萄糖的小鼠上沒有這個現象(圖4f)。因為nesfatin-1隻能對足以誘導胰島素分泌 的高血糖起作用，所以它的降糖作用或許是胰島素依賴性的。而事實上，在鏈脲黴素誘導的 I型糖尿病小鼠中，只有當同時皮下注射胰島素的時候，nesfatin-1才能起到降糖作用(圖 4g)。
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T _ Φ會目_鄉千___隨_i普翻丨#如之前報導2的一樣，下丘腦中TPA (組織型纖溶酶原激活劑)的活性通過酶譜法 來檢測。從飢餓或者非飢餓的小鼠上取出下丘腦，勻漿，離心。將含有相同蛋白量的上清與 樣品緩衝液混合製備成樣品，在含有3mg/ml酪蛋白和4. 5mg/ml纖溶酶原的密度為10%的 SDS-PAGE 膠中電泳分離。陽性對照為 0. Ing 的人源 TPA(Genentech，San Francisco, CA)。 電泳後，將膠浸泡在復性緩衝液(0. 02% NaN3，200mM NaCl, 50mM Tris-HCl,2. 5% Triton X-100，pH 8.3)中室溫孵育30分鐘，然後在反應緩衝液(0.02% NaN3, 200mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 8. 3)中37。C反應18小時。為了使TPA的條帶清晰可見，反應後的膠用考馬 斯亮藍R-250染色，然後脫色直至空白條帶在藍色背景上顯現出來。高效液相餼譜法檢測血清中nesfatin-1將下丘腦勻漿，勻漿緩衝液為含有蛋白酶抑制劑cocktail (Roche, Indianapolis, IN)的乙酸，超聲處理勻漿液破碎成團的核酸後，95°C加熱15分鐘。然後在4°C將樣品以 13，200rpm 的轉速離心 30 分鐘。收集上清，以 Bradford 法(Thermo-Fisher Sci. Rockford, IL)測定蛋白濃度。小鼠眼球取血，分離血清。利用Waters Delta 600E/2487/717高效液 相色譜系統對下丘腦勻漿液或者血清樣本進行分析，上樣量分別為下丘腦勻漿液約IOOmg 蛋白或者血清25 μ L，所用的分析柱為C18反相柱(4. 6x250mm/5 μ m, Hambon，張家港，中 國)。梯度洗脫Nesfatin-I，時間梯度為0分鐘-20分鐘，相應的濃度梯度為20% -40%溶 劑B (溶劑A 0. 1 %三氟乙酸的水溶液，溶劑B 0. 1 %三氟乙酸的乙腈溶液)，洗脫液流速為 Iml每分鐘。以純化的nesfatin-Ι為標準品來確認nesfatin-l在柱上的保留時間並繪製 標準曲線。收集對應保留時間的洗脫液後進行質譜分析。鏈脲黴素誘導的I型糖尿病小鼠實驗採用10周齡的雄性C57BL/6J小鼠，連續兩天腹腔注射鏈脲黴素的檸檬酸鈉 溶液(pH 4.5)，劑量為100!1^/1^/(1對。尾靜脈取血，用葡糖氧化酶法檢測血糖濃度。當小 鼠早晨時的血糖濃度大於16mM時，認為糖尿病模型造模成功。如果小鼠血糖高於30mM，則 給每隻小鼠注射16ng豬胰島素(萬邦，徐州，中國)以防止血糖過高帶來危險。胰島素每 兩天注射一次，保持血糖在16-30mM的範圍內，並同時防止小鼠過度消瘦。實驗時，每隻鏈 脲黴素誘導的I型糖尿病小鼠尾靜脈注射100 μ g Nesfatin-I或同時合併2ng胰島素皮下 給藥。實施例2 尾靜脈注射纖溶酶抑制劑對血液中nesfatin-Ι濃度的影響Nesfatin-Ι在外周血中被清除的方式現在並不清楚。先前報導過外周血中有微量 的纖溶酶生成，並在我們的實驗中被證實了。通過尾靜脈給db/db小鼠注射AMCA和抑肽酶 這兩種纖溶酶的抑制劑，外周血中nesfatin-Ι濃度增加的同時，小鼠的進食減少，體重降 低了(圖5)。另外，尾靜脈注射的nesfatin-Ι在pig+基因型的小鼠外周血中清除速率要 明顯慢於plg+/+的小鼠。因此，我們認為外周血中的nesfatin-Ι至少有部分是由纖溶酶降 解的。與nesfatin-Ι能夠穿透血腦屏障的報導相一致，AMCA也能帶來食慾減退作用，說明 大腦中的nesfatin-Ι至少部分來自於外周血。Nesfatin-Ι能夠增加大鼠的緊張和恐懼相 關行為，證實其對大鼠的神經有影響。但是注射白蛋白-nesfatin-Ι融合蛋白在有效降低 血糖的同時，並不影響大鼠的行為，證明該融合蛋白不能通過血腦屏障進入大腦。儘管之前曾經發現TPA/纖溶酶原系統能夠影響脂肪細胞的分化，但這是第一次
12通過水解nesfatin-Ι使其失活進而直接影響食慾、體重和血糖濃度等一系列 關係到體內能量穩態的方面。更重要的是，在這裡列出的數據表明，外周血中的nesfatin-1 有顯著的抗糖尿病作用，這將為今後II型糖尿病的治療提供新的方法。實施例3 神經肽的定量PCR檢測對神經肽mRNA定量PCR (q-PCR)的檢測，使用CFX96TM實時系統(BiO-Rad， Hercules,CA)和SYBR Green I螢光染料的檢測方法。簡而言之，將24小時禁食的小鼠的 下丘腦組織取出勻漿，使用RNAiso試劑(TaKaRa，Dalian, CN)提取總RNA，並逆轉錄成單 鏈cDNA。我們利用下丘腦cDNA的標準曲線確定神經肽mRNA的相對表達量，並通過qPCR 對總RNA和gadph RNA進行調整。實時RT-PCR使用的引物如下agrp正向引物5' -TGT GTA AGG CTG CAC GAG TC (SEQ ID NO 10) ；agrp 反向引物5' -GGC AGTAGC AAA AGG CAT TG (SEQ ID NO 11) ；agrp Tm :61°C;npy 正向引物5' -AGG CTTGM GAC CCT TCC AT (SEQ ID NO 12) ；npy 反向引物5' -ACA GGC AGA CTG GTTTCA GG(SEQ ID NO 13) ；npy Tm :61°C ； pome 正向引物5' -CGC CCG TGT TTC CA(SEQ ID NO 14) ；pome 反向引物5' -TGA CCC ATG ACG TAC TTC C(SEQ ID NO 15) ；pome Tm :58°C ；gadph 正向引物5' -AAC GAC CCC TTC ATT GAC(SEQ ID NO 16) ；gadph 反向引物5' -TCC ACG ACA TAC TCA GCA C(SEQ ID N0 17) ；gadph Tm:60°C。全部樣品均做三個平行樣，結果取平均值。實施例4 下丘腦AgRP的免疫組織化學小鼠經過48小時禁食後，用戊巴比妥鈉深度麻醉，並先後用20mL緩衝液和4% 多聚甲醛(溶於PBS，pH7.4)進行心臟灌流。取出大腦後固定過夜，然後保存於含30% 蔗糖的PBS中。為檢測AgRP的免疫螢光，將20 μ m的冰凍切片固定於多聚甲醛中，在含
BSA的PBS中孵育20分鐘，然後在同樣溶劑的兔源AgRP抗體(1 4000, Phoenix Pharmaceuticals，Burlingame，CA)中4°C孵育1天。用PBS洗滌三次後，切片在Cy2_偶聯 的羊抗兔IgG(l 250，Jackson, West Grove, PA)中室溫孵育2小時，然後PBS洗滌三次， 用甘油緩衝(PH8.5)封片。如圖6所示，與plg+/+l印r-/-相比，plg-/-l印r-/-中下丘腦 agrp禾口 npy表達下調，而pome表達上調。實施例5 提高外周或腦nesfatin-Ι物質的高效液相餼譜法篩選試驗血樣和腦組織樣品取自注射過多種藥物的小鼠(例如化合物，蛋白，肽類或核 酸)，然後如上所述進行高效液相色譜分析，測量並記錄樣品中的nesfatin-Ι含量。當發現 某個樣品中的nesfatin-Ι比對照組高20%時，該組別小鼠所注射的物質將被認為能夠提 高外周和腦部nesfatin-Ι的含量。實施例6 利用纖溶酶或纖溶酶原激活物滅活Nesfatin-I給病人每天靜脈注射高於5mg纖溶酶或纖溶酶原激活物(例如組織纖溶酶原激活 物，尿激酶型纖溶酶原激活物，鏈激酶或葡激酶)。該病人血液或腦部的nesfatin-Ι的含量 可能降低或失去活性，其攝食量、食慾、血糖或體重可能升高。實施例7 注射Nesfatin-Ι顯著降低血液中甘油三酯，總膽固醇和低密度脂蛋白 而非高密度脂蛋白的含量給ob/ob小鼠尾靜脈注射100 μ g Nesfatin-Ι，3小時後取其血樣進行血脂分析。 注射nesfatin-Ι小鼠血液中的甘油三酯，總膽固醇和低密度脂蛋白均有不低於5 %的降 低，而高密度脂蛋白卻不受影響(圖15)。
實施例8 由PPAR-Gamma和AMPK介導Nesfatin-Ι的抗糖尿病作用將PPAR-Gamma的不可逆抑制劑GW9662以每克體重0. 45 μ g的劑量尾靜脈注射於 db/db小鼠。30分鐘後，再尾靜脈注射IOOyg neSfatin-l，6小時內檢測其血糖水平。注射nesfatin-Ι前注射過GW9662的小鼠血糖水平沒有下降。相反，沒有預先注射 GW9662的db/db小鼠，注射nesfatin-1後其血糖水平顯著降低(見上文)。因此，在db/db 小鼠中GW9662完全抑制了 nesfatin-Ι的抗糖尿病作用，表明nesfatin-Ι的抗糖尿病作用 是由PPAR-Gamma介導的(圖16)。Compound C是5』-單磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)的專一性抑制劑。將其以 每千克體重20mg的劑量腹腔注射於db/db小鼠，接著尾靜脈注射100 μ g nesfatin-1，6小 時內檢測其血糖水平。注射nesfatin-Ι前注射過化合物C的小鼠血糖水平沒有下降。相反，沒有預先注 射化合物C的db/db小鼠，注射nesfatin-Ι後其血糖水平顯著降低。因此，在db/db小鼠 中化合物C完全抑制了 nesfatin-Ι的抗糖尿病作用，表明nesfatin-Ι的抗糖尿病作用也 能由AMPK介導(圖16)。實施例9 =Nesfatin-I大分子量類似物人們發現nesfatin-Ι能夠在神經心理學方面影響大鼠，這體現在增加其焦慮感 和恐懼相關的行為。有效降低血糖水平卻無法穿透血腦屏障(BBB)的大分子量nesfatin-1 類似物的製備方法如下。例如，我們可將nesfatin-Ι和白蛋白經化學偶聯製得大分子化合 物。白蛋白-nesfatin-Ι偶聯物的合成20mg nesfatin-1 (0. 002mmol)溶解於 5mL 0. IM PBS(pH7. 2)形成澄清溶液， 4mg(0.01mmol)SMPT(4-琥珀醯亞胺氧羰基-a-甲基-[2-硫代吡啶]甲苯)溶解於乙腈至 10mg/ml的濃度。將SMPT溶液逐滴加入nesfatin-Ι溶液中，同時快速攪拌。該混合物室溫 攪拌過夜，然後對0. IM PBS和IOmM EDTA透析出去多餘的物質並改換溶液體系。84mg牛 血清白蛋白(0. 0013mmol)溶解於8mL PBS-EDTA溶液，然後加入到處理過的nesfatin-1溶 液中。利用分光光度計測量離去基團吡啶-2-硫酮(343nm處最大吸收)來衡量偶聯效果。 室溫反應48小時後，多餘的吡啶-2-硫酮用0. 4mg半胱氨酸中和。經尺寸排阻色譜去除遊 離的和修飾的nesfatin-Ι，即得到偶聯物。在整個反應過程中，用10% SDS-PAGE檢測對偶 聯反應進行的程度。儘管SMPT分子的摩爾數多出4倍，分析高效液相色譜依然在溶液中檢測出約 20-30%游離的nesfatin-1。48小時後，偶聯反應基本停止，此時343nm處光吸收沒有顯著 增加。SDS-PAGE結果同樣顯示，48小時反應後沒有明顯變化。從SDS-PAGE結果估算，白蛋 白-nesfatin-Ι偶聯產物的產率約50-60%。實施例10 大分子量nesfatin-Ι類似物能夠不穿透血腦屏障降低血糖水平將I125標記的白蛋白-nesfatin-Ι偶聯產物靜脈注射於db/db小鼠和C57B1/6J小 鼠體內。在注射後的0、3、5、10、30和60分鐘時取出腦組織，用伽瑪計數器測量其放射性。 相同量的放射性NaI125作為陽性對照。將250yg白蛋白-nesfatin-Ι偶聯產物尾靜脈注射於db/db小鼠。6小時內 檢測其血糖水平。在任意時間點均未在小鼠腦部測得放射性。相反，在腦部注射NaI125
14的小鼠中，3-30分鐘時腦部能檢測到放射性，隨時間推移逐漸降低。上述結果表明，白 蛋白-nesfatin-Ι偶聯產物不能穿過血腦屏障從循環系統進入腦部。靜脈注射白蛋 白-nesfatin-Ι偶聯產物在6小時內顯著地將db/db小鼠的血糖水平降低50% (圖17)。實施例11 實驗操作程序動物飼養C57BLKS/J Lepr+/"小鼠，C57B1/6J pig+ 和 1 印 + 小鼠購自 Jackson 實驗室 (BarHarbor，ME)。所有的實驗動物均飼養於無特定的病原體(SPF)的環境中，12小時明暗 周期，自由攝食。在動物實驗中的所有程序都符合美國國立衛生研究院(OTH)動物飼養指 南，並經實驗動物倫理委員會的批准。plg+Ι印r+、plg+1印+小鼠的建立和基因分型將ρ 1 g+/-小鼠與1印和1印+小鼠雜交生成ρ 1 印和ρ 1 g^lep^小 鼠。這些小鼠將用於在db/db和ob/ob小鼠中建立纖溶酶原缺陷型，即plg+Ι印r+和 plg+Ι印+小鼠。小鼠剪尾，提取基因組DNA，PCR，將小鼠基因型分為1印r野生型、1印r突變型、 Iep野生型、Iep突變型、纖溶酶原野生型和纖溶酶原突變型。引物序列如下1 印r-wild-type-F :5 『 -TAC ATT TTG ATG GAG GG-3 『 (SEQ ID NO 1)； lepr-mutant-F 5' -TACATT TTG ATG GAG GT-3(SEQ ID NO 2) ；lepr-same-R 5' -GGA ATC TAA TAT GGA AG-3' (SEQ ID NO 3) ；lep-wild-type-F 5' -TGA CCT GGA GAA TCT CC-3' (SEQ ID NO 4) ； 1 印-mutant-F -TGA CCT GGA GM TCT CT-3' (SEQ ID NO 5)； 1 印-same-R:5' -CAT CCAGGC TCT CTG GC-3' (SEQ ID NO 6) ；plg-wild-type-F 5' -TGT GGG CTC TAA AGA TGGAAC TCC-3' (SEQ ID NO 7) ；plg-mutant-F 5' -GTG CGA GGC CAG AGG CCA CTT GTGTAG CG-3' (SEQ ID NO 8) ；plg-same-R 5' -TGT GGG CTC TAA AGA TGG AACTCC-3' (SEQ ID NO :9)。體重、進食量、空腹血糖及血清胰島素測定將斷奶後的小鼠飼養在標準飲食環境中，並監控至少24周。每周進行體重測定， 每日記錄飲食量，並且在5、10和15周齡時計算該周的平均值。在小鼠8、16和24周齡時 進行18小時的禁食，尾靜脈取血，用血糖儀(Roche，Indianapolis, IN)測定空腹血糖。用 ELISA(ALPC0, Salem, NH)測定血清胰島素水平。每種基因型(plg"+l印r"_、plg^leprv\ plg+/+lepr+/\and pig+印r+A)的兩種性別至少各8隻小鼠將用於研究。葡萄糖耐受性試驗(GTT)在腹腔葡萄糖耐受性試驗(IP-GGT)中(Zheng et al，2004)，12周齡小鼠置於潔 淨的籠盒中，於下午4點禁食，次日上午10點按每克體重Img的劑量靜脈注射葡萄糖，測定 注射前以及注射後的第10、20、30、60、90、120和180分鐘的血糖水平。在靜脈葡萄糖耐受性試驗(IV-GGT)中，小鼠按每克體重Img或1. 5mg的劑量靜脈 注射葡萄糖並置於潔淨籠盒中，測定注射前以及注射後的第5、10、20、30、60和120分鐘的 血糖水平。用高效液相色譜分離Pladin採用眼球摘除術取血製備新鮮小鼠血清。將glg+Ι印r+和db/db小鼠血清直接 利用Waters Delta 600E/2487/717高效液相色譜分離系統，利用C18反相柱(4. 6x250mm,5 μ m，Hambon, Zhangjiagang, CN)進行分析，用 20% -40% 乙腈(含 0. 1 % TFA)以 Iml/ 分 鐘的流速線性梯度洗脫20分鐘(Enriori et al.，2007)。從plg+Ι印r+小鼠血清洗脫得 到的與db/db小鼠相比不同組分被收集並用Applied Biosystems 4800蛋白質組學分析儀 (AppliedBiosystems)進行分子量測定。採用分子量3000至20000道爾頓的範圍進行線性 模式分析獲得質譜結果。蛋白質質譜鑑定HPLC-C18分離得到的樣品用15% SDS-PAGE進一步分離。每個樣品的整條泳道被 切割成1.5mm寬的凝膠片，用胰蛋白酶消化後通過串聯質譜用Applied Biosystems 4800 蛋白質組學分析儀進行分析。在反射模式下，對其進行肽質量指紋圖譜分析(PMF)就二級 串聯質譜分析(MS/MS)。利用MASCOT對蛋白序列資料庫進行搜索確定目標蛋白(http:// www.matrixscience.com/Matrix Science)。搜索參數如下允許誤差-0. 3Da ；修飾類 型-氧化(M)脲甲基化(C)；酶-胰蛋白酶。腦室(i.e.v.)注射實驗動物先預置一安全留置針，並在腦室注射前進行至少一周的清洗。未經麻醉， 在5分鐘內將總共5 μ L待測物質如nesfatin-1 (25pmol)或rPladin (25pmol)注入第三腦 室。該實驗在黑暗期(18:00點)開始時進行，動物自由攝食飲水。腦室注射3小時後進行 進食量檢測。靜脈(i. v.)或腹腔(i. p.)注射未經麻醉，小鼠放置於固定管中，將總共150 μ L的待測物質如nesfatin-Ι或 rPladin尾靜脈注射。放回籠盒中，自由攝食飲水。在腹腔注射實驗中，將總體積為200 μ L 的待測物質直接腹腔注射於未經麻醉的小鼠體內。鏈脲菌素(STZ)誘導的1型糖尿病小鼠10周齡的雄性C57BL/6J小鼠，連續兩天以100 μ g/g/day的劑量腹腔注射鏈脲菌 素(溶於lOOmmol/L檸檬酸鈉(pH 4.5))。尾靜脈取血，用葡萄糖氧化酶實驗測量血糖水 平。在注射鏈脲菌素後，當空腹血糖讀數超過16mmol/L時，該小鼠被認為是1型糖尿病的 小鼠。如果血糖水平高於30mmol/L，則立即對該鼠注射16ng豬胰島素(萬邦，徐州，中國) 避免血糖過高帶來的危險。對STZ誘導的1型糖尿病小鼠靜脈注射rPladin (IOnmol/只)， 或靜脈注射同劑量rPladin的同時皮下注射胰島素(2ng/只)。熱量限制將8周齡db/db小鼠分成以下兩組，熱量限制(CR)和自由攝食飲水組。對比於後 者的自由攝食，CR組逐漸進行30%的熱量限制如前所述(Miller等，2002)，第一周熱量攝 入為對照組的90%，第二周80%，剩餘時間均為70%。重組Pladin的定點突變和基因表達利用E.coli的優化密碼子，根據pladin的胺基酸序列合成編碼pladin的 cDNA，並插入表達His標記的載體pladin-pET28a。構建的載體轉染到Ε. coli菌株 Rosetta細胞中。在10升細菌培養物中加入lmmol/L IPTG誘導蛋白表達。通過Ni-NTA Superflow(QIAGEN)親和層析將His標記的rPladin從可溶性裂解物中純化出來。腸激酶 切割之後，rPladin用反相-C18柱高效液相色譜法進一步純化。rPladin的定點突變是以 pladin-pET28a質粒作為模板，用突變BEST試劑盒(TaKaRa)。對重組nesfatin-Ι也進行
16同樣的操作。乙醯化和白蛋白偶聯用N-乙醯基咪唑乙醯化rPladin(Furth and Hope，1970)，經製備型反相_C18_高 效液相色譜純化後用質譜進行鑑定。同時，rPladin和乙醯化rPladin通過SMPT與牛血清 白蛋白進行偶聯(Ding et al.，2003)。偶聯物通過排阻色譜純化並通過10% SDS-PAGE和 凝膠過濾高效液相色譜法進行分析鑑定。PPAR- γ拮抗劑GW9662和AMPK抑制劑化合物C對rPladin降血糖作用的影響將16 到 18 周齡的 db/db mice 靜脈注射 0. 45 μ g/g 的 GW9662 (Sigma, St. Louis, MO)或腹腔注射 20 μ g/g 的羅格列酮(Sigma, St. Louis, MO)或化合物 C (Sigma，St. Louis, M0)，然後隨機靜脈注射IOnmol rPladin或相同體積的緩衝液。注射後3小時，用血糖儀 (Roche, Indianapolis, IN)檢測血糖水平。統計分析如圖表說明所述，數據表示為平均數士平均標準差(士SEM)的形式。所有數據均 代表至少兩次不同實驗。用雙尾學生t檢驗對單個數據點進行比較。當P值小於0.05時， 認為有統計學意義上的顯著差異。實施例12 =Plasminogen(纖溶酶原)缺陷型的db/db與ob/ob小鼠血糖與血清中 胰島素含量正常，小鼠體重減少曾有報導纖溶酶原缺陷的小鼠與同齡野生型小鼠比較體重略有下降 (Hoover-Plow etal.，1999)。雖然體重差別並不明顯，但這個結果仍然引起了我們的關 注。我們將瘦素基因敲除的ob/ob小鼠與瘦素受體基因敲除db/db小鼠又進行了纖溶酶 原的基因敲除，以此來觀察纖溶酶原缺陷對肥胖小鼠是否也存在體重的影響。瘦素或其受 體基因敲出後的小鼠具有肥胖，糖尿病症狀，不育，貪食以及活動少等特徵(Chua et al., 1996)。這篇專利中我們發現纖溶酶原敲除後不僅這兩種小鼠的體重有明顯下降，db/db小 鼠的糖尿病症狀也得到顯著改善。plg+1印r+與plg+Ι印+小鼠的體重及食物的攝取與 同齡的plg+/+l印r+及原型db/db肥胖小鼠相比明顯下降。1印r+db/db小鼠的高血糖與 高胰島素特徵經纖溶酶原敲除後趨向正常(見圖7)。在腹腔葡萄糖耐受實驗(IP-GTT)中， plg+lepr+小鼠與plgv+l印r+相比對腹腔注射葡萄糖反應有較好的耐受性。實施例13 =Pladin的發現在plg+Ι印r+的db/db小鼠的血清中，我們發現了一個天然的與一般的db/db 小鼠的血清比較含量高出很多的多肽(見圖8A)。通過HPLC C18柱純化後(見圖9A)，經 MALDI-T0F質譜鑑定其分子量為8，119Dalt0n(見圖9B)。經胰蛋白酶酶解及MALDI-T0F 二 級質譜鑑定其序列為 TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYLKQVIEVLETDPHFREKLQKADIEEIRS GRLSQELDLVSHKVR(SEQ ID NO :23)(見圖9C-E)。通過Blast軟體分析發現這個多肽是 nucb2(nucleobindin-2)的片段序列。我們把它取名為 Pladin，是 Plasmin anti-diabetic 抗糖尿病(或與抗糖尿病相關)的nucb2多肽的縮寫。Pladin在正常小鼠，大鼠，兔子 及人的血漿中均存在。之前有報導nucb2片段含82個胺基酸殘基的多肽nesfatin-1， nesfatin-1被推斷為nucb2在激素原轉換酶蛋白水解作用下的產物(0h_I et al.，2006)。 作為一個影響食慾的分子，nesfain-Ι從沒有被報導過對糖代謝有影響，而這82個氨基 酸序列中包含有pladin中的69個胺基酸殘基。為了進一步研究這些nucb2多肽，我們
17以pET28a為載體在大腸桿菌中表達製備重組的pladir^rPladin)與nesfatin-1，並通過 HPLC-C18純化。(重組和純化的技術為本領域技術人員熟知的技術)實施例14 :rPladin的降血糖作用是時間，劑量與胰島素依賴的自由餵養的db/db小鼠的血糖可高達25mmol/L.靜脈注射IOmmol的rPladin能 明顯降低db/db這類小鼠的血糖，但對瘦的野生型鼠或是飢餓狀態的db/db鼠卻沒有顯著 作用(見圖8B)。另外這種降血糖的作用是劑量與時間依賴的(見圖8C，D)。在做野生型 老鼠的靜脈注射葡萄糖耐受實驗中發現IOnmmol rPladin能明顯提高注射1. 5g/kg小鼠 葡萄糖的血糖吸收，卻不能提高注射1.0g/kg小鼠葡萄糖的血糖吸收(見圖8E)。靜脈注 射rPladin不能明顯地影響小鼠包括db/db在內的血中胰島素含量。從這些結果我們推測 rPladin的降血糖作用是胰島素依賴的。事實證明，在不分泌胰島素的鏈脲佐菌素(STZ)誘 導的I型糖尿病模型鼠中靜脈注射rPladin不能降血糖，但皮下注射胰島素後，rPladin的 降血糖作用變得明顯(見圖8F)。實施例15 :rPladin減少食慾的作用與降血糖活性不相關與nesfatin-Ι相似，每隻大鼠30nmol的腹腔注射或25pmol的腦室注射rPladin 或nesfatin-Ι能明顯降低大鼠的食慾(見圖10A)，有趣的是我們首次發現靜脈注射 IOnmol的nesfatin-Ι能降低db/db小鼠的血糖濃度，而腹部注射卻沒有此功能(見圖 10B)。將25pmol的rPladin或nesfatin-Ι腦室注射到db/db小鼠，小鼠進食量明顯減 少，而小鼠的高血糖並沒有降低(見圖10B)。結果說明降血糖作用是外周性的而不是神經 性的，與降低食慾的作用沒有關係。實施例16 熱量限制不能使db/db小鼠的血糖降低因為纖溶酶原缺陷db/db小鼠血清中pladin含量較高，在改善糖尿病症狀的同時 能明顯減少食物的攝取(見圖8A)，是否是因為進食量的減少而導致血糖降低？實驗證明 db/db小鼠的熱量限制不能改變血中高血糖與血清中的胰島素含量(見圖10C，D)。這也意 味著進食量的減少不是導致纖溶酶原缺陷降血糖功能的關鍵因素。實施例17 纖溶酶能使Pladin失活仔細觀察pladin的胺基酸序列，我們可以發現有幾個可能可以被纖溶酶酶切的 位點(見圖11A)。當rPladin與纖溶酶在體外溫育一段時間，rPladin迅速降解(見圖11B) 同時降血糖的作用也消失了(見圖11C)。另外pladin中賴氨酸被丙氨酸取代的兩個變體 A4(Lys28 — Ala)，A5 (Lys28 — Ala)以及乙醯基化後的rPladin能抵抗纖溶酶的降解作用 (見圖11B)。從圖11的數據中我們推測plasmin會使rPladin失活，這可能是導致纖溶酶原缺 陷的db/db小鼠的血糖正常的部分原因。儘管plasmin被公認為是在外周生成(Cushman etal.，1999 ；Folsom et al.，2001 ；Sakkinen et al.，1999)，但不能確定除了 finbin 外血 液中是否還存在plasmin的其他底物。為了證明plasmin會使rPladin失活這一假設，我 們做了以下實驗。首先，氨甲環酸(AMCA)作為一個plasmin的特異性抑制劑用來模仿纖溶酶原缺陷 的db/db小鼠模型。小鼠靜脈注射15mg的氨甲環酸10分鐘後，血清中pladin的含量提高 了(見圖12A)，而同樣的量連續注射三天後，小鼠的食物攝取與體重減少(見圖12BC)。在
18db/db小鼠兩周齡時每天注射一次15mg氨甲環酸，連續注射10周後，小鼠在禁食狀態下血 糖也有明顯的下降(見圖12D)。其二，rPladin靜脈注射纖溶酶原缺陷的db/db小鼠後清除得很慢，而靜脈注射正 常小鼠卻清除得很快(見圖12E)，說明plamsin可能是導致rPladin在體內降解的酶。其三，乙醯基化rPladin的製備，與未修飾的rPladin相比乙醯基化的rPladin分 子量增加了 252(8，369versus 8，117Dalton)，它在280nm波長處沒有任何吸收。因此推測 有三個Tyr與三個Lys被乙醯基化。乙醯基化的rPladin仍然有降血糖活性而且保持活性 的時間較未修飾的rPladin長，從6小時延長到12小時(見圖13A，J)。體外實驗也證明 了乙醯基化的r-Pladin能抵制plasmin的酶降解作用。這些結果說明被乙醯基化的氨基 酸對pladin降血糖作用沒有影響(但降血糖時間延長了)，而plasmin對這些賴氨酸位點 的酶降解作用是導致Pladin失活的重要原因。最後，為了降低plasmin對rPladin的降解作用，我們合成了一系列將蛋白中的精 氨酸與賴氨酸取代為丙氨酸的位點突變體。13位的精氨酸與28位的賴氨酸被丙氨酸取代 的突變體能明顯地延長體內的活性，它們能將活性時間從6小時分別延長到12小時與18 小時(見圖13BC)。體外實驗證明它們能抵制plasmin的酶降解作用(見圖11B)。53位 的精氨酸與56位的精氨酸被丙氨酸取帶後，其抗血糖的活性減低至五分之一，說明了多肽 片段RSGRLS (53-58)是pladin的降血糖作用所需要的區域之一(見圖13E)。其他的突變 體如2位，43位，46位與67位的賴氨被丙氨酸取帶後，它們對pladin的活性改變並不明顯 (見圖 13D，G，H)。總結這些數據，我們得出結論pladin是被plasmin或是plasmin類似的對鹼性 胺基酸有特異性識別的蛋白水解酶降解導致失活。顯然纖溶酶原缺陷的db/db小鼠之所以 能有正常的血糖是因為plasmin降解Pladin的作用消失所致。實施例18 =Ser65是降血糖功能的關鍵位點65位的絲氨酸被丙氨酸取代後，rPladin的降血糖作用完全消失，可能意味著65 位絲氨酸的磷酸化與去磷酸化過程與胰島素的信號轉導有重要的關聯作用(見圖13F)。實施例19 乙醯化Pladin與白蛋白的偶聯物不能進入腦部卻能有效地降低血糖因為nesfatin-Ι被認為是通過神經性途徑來影響大鼠增加其焦慮感與恐懼感 (Meraliet al.，2008)，我們將白蛋白與乙醯基化的rPladin偶聯，偶聯後的產物能有效地 降低血糖並能將降血糖的有效時間延長到36個小時(見圖13K)，而偶聯物並不進入腦部 (數據未列出)。有趣的是，當白蛋白與未修飾的Pladin偶聯後，活性的有效時間與Pladin 本身沒有區別(見圖131)，這說明pladin與白蛋白的偶聯並沒有起到降低蛋白酶降解 Pladin的作用。實施例20 羅格列酮不影響rPladin體內的降血糖作用，但GW9662與Compound C 會消除其降血糖作用若小鼠預先注射PPAR- γ拮抗劑GW9662與AMPK抑制劑Compound C，rPladin的 降血糖作用就會消失。而預先注射PPAR-γ激動劑羅格列酮卻對rPladin的降血糖作用沒 有影響(見圖12F)。這說明了 rPladin的降血糖作用與胰島素的信號轉導有密切聯繫。實施例21 :rPladin突變體rPladin的突變體A90可顯著增加體內降血糖作用的持續時間。A90的體內活性
19作用時間由6小時顯著增加至24小時以上(圖14)。A90TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYAKAAAAALETDPHFREKLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR (SEQ ID NO 19)rPladin的突變體A91可顯著增加體內降血糖作用的持續時間。A91的體內活性 作用時間由6小時顯著增加至24小時以上(圖14)。A91TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYSAAAALETDPHFREKLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR(S EQ ID NO 20)rPladin的突變體A92可顯著增加體內降血糖作用的持續時間。A92的體內活性 作用時間由6小時增加至12小時以上(圖14)。A92TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYMLETDPHFREKLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR (SEQ ID NO 21)實施例22 =Pladin降血糖作用的關鍵序列一段含有 20 個胺基酸 ADIEEIRSGR LSQELDLVSH (SEQ ID NO 22)的合成多肽，即 pladin的C末端序列，具有降血糖作用。當通過靜脈注射給予db/db小鼠時，它的降血糖活 性是等摩爾的rPladin的1/3 (圖18)。實施例23 —段和Pladin關鍵序列(20個胺基酸殘基)具有同源性的NUCBl多 肽一段含有 20 個胺基酸 ANAEDIKSGKLSQELDFVSH(SEQ ID NO :24)的合成多肽，即 NUCBl的一段序列，被發現同pladin的關鍵序列(SEQ ID NO :22)具有高度同源性。它具 有降血糖作用，當通過靜脈注射給予db/db小鼠時，同等摩爾的關鍵序列多肽(SEQ ID NO 22)的降血糖活性相同(圖18)。它們的胺基酸序列排列如下ADIEEIRSGR LSQELDLVSH(SEQ ID NO 22)ANAEDIKSGK LSQELDFVSH(SEQ ID NO 24)實施例24 =NUCBl的降血糖作用基於實施例23中的實驗結果，表達了一段含有78個胺基酸的重組蛋白質多肽 (SEQID NO 25)，即NUCBl的N末端序列，此段序列包括了 SEQ ID NO :24。它也具有降血糖作 用，當通過靜脈注射給予db/db小鼠後3小時內，它的降血糖活性至少是等摩爾的rPladin 或 nesfatin-Ι 的 2 倍(圖 18)。SEQ ID NO :25 同 pladin 具有 68% 的同源性。VPVDRAAPPQ EDSQATETPD TGLYYHRYLQ EVINVLETDG HFREKLQAANAEDIKSGKLS QELDFVSHNV RTKLDELK(SEQ ID NO 25)pladin (SEQ ID NO 23)與 NUCBl 肽段(SEQ ID NO 25)的序列對比—TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYLKQVIEVLETDPHFRE(來源於 SEQ IDNO 23)VPVDRAAPPQEDSQATETPDTGLYYHRYLQEVINVLETDGHFRE(來源於 SEQ IDNO 25)KLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR(來源於 SEQ ID NO 23)KLQAANAEDIKSGKLSQELDFVSHNVRTKLDELK(來源於 SEQ ID NO 25)參 考文獻
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權利要求
一種(a)或(b)的多肽(a)由SEQ ID NO22所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(a)衍生的多肽。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於該多肽是SEQID NO :22除Ser19以外的位 點經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(a)衍 生的多肽。
3.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於該多肽是由SEQID N0:24所示的胺基酸 序列組成的多肽。
4.一種多肽，其特徵在於該多肽是胺基酸序列包含權利要求1所述多肽的胺基酸序列 且具有降血糖和/或降血脂作用的多肽。
5.根據權利要求4所述的多肽，其特徵在於該多肽是(c)或(d)的多肽(c)由SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 23 或SEQ ID NO :25所示的胺基酸序列組成的多肽。(d)在(c)中的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有降血糖 和/或降血脂作用的由(C)衍生的多肽。
6.根據權利要求5所述的多肽，其特徵在於該多肽為是SEQID NO :23除Ser65以外的 位點經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由SEQ ID NO: 23衍生的多肽。
7.根據權利要求6所述的多肽，其特徵在於所述多肽為SEQID N0:23中發生 Arg13 — Ala、Lys28 — Ala、Lys43Lys46 — Ala、Lys67 — Ala、Lys2 — Ala 或 Arg53Argre — Ala 取代的胺基酸序列組成的多肽。
8.權利要求1 7中任一多肽、該多肽的乙醯化產物、該多肽與白蛋白的複合物、該多 肽降解水解酶的抑制物、或者含有該多肽及其降解水解酶抑制物的組合物在製備降血糖藥 物和/或降血脂藥物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於降血糖藥物為治療糖尿病的藥物；降血脂 藥物為降低血液中甘油三酯、總膽固醇或低密度脂蛋白的藥物。
10.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於糖尿病為I型或II型糖尿病。
11.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於該多肽降解水解酶的抑制物為纖溶酶抑 制物，優選抑肽酶、氨甲環酸、氨基己酸或它們的類似物。
全文摘要
本發明屬於生物製藥及糖尿病領域，公開了一種多肽及其在製藥中的應用。該多肽是(a)或(b)(a)是由SEQ ID NO22所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)是在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(a)衍生的多肽。該多肽及其纖溶酶抑制物具有降血糖以及降低血液中甘油三酯、總膽固醇或低密度脂蛋白的作用，可用於製備降血糖的藥物或降血脂的藥物，尤其是製備治療糖尿病的藥物。
文檔編號A61K38/17GK101914150SQ20101014787
公開日2010年12月15日 申請日期2010年3月12日 優先權日2009年3月12日
發明者劉建寧 申請人:劉建寧