一種石蒜中加蘭他敏的提取方法

2023-09-09 22:41:00

一種石蒜中加蘭他敏的提取方法
【專利摘要】本發明提供了一種石蒜中加蘭他敏的提取方法，包括步驟一、色譜條件的確定：色譜柱：Kromasil100-5C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-磷酸緩衝液(17：83)，柱溫：35℃，進樣量20μL，檢測波長：290nm；磷酸緩衝液為2.72g磷酸二氫鉀溶於100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值為7.02；步驟二、標準曲線的製備：按步驟一色譜條件建立回歸方程；步驟三、加蘭他敏的提取：稱取石蒜粉末2.0g，加入纖維素酶和果膠酶，加入pH＝4.5的水溶液在一定溫度條件下浸提一定時間，5000r/min離心20min，取上清液，採用色譜測定，計算石加蘭他敏得率。本發明提取成本低、提取時間短，工藝簡單，對環境無汙染，提取得率較高。
【專利說明】一種石蒜中加蘭他敏的提取方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種加蘭他敏提取方法，特別涉及一種石蒜中加蘭他敏的提取方法。

【背景技術】
[0002] 石蒜（Lycoris radiate. Herb)是石蒜科（Amaryllidaceae)石蒜屬（Lycoris)的 多年生草本植物，主要分布在亞洲，我國有17種，在我國湖南、湖北、江蘇、浙江、福建等省 均有分布。石蒜屬植物具有較高的觀賞價值，被譽為"中國鬱金香"，石蒜鱗莖富含澱粉，如 將其磨碎後用大量水淘洗，脫毒後食用，味如糯米粉，《救荒本草》中記載，可將其炒熟，水浸 過食。石蒜性味辛、甘、溫，具有消腫、殺蟲的作用，其所含豐富的生物鹼也得到廣泛應用， 尤其是加蘭他敏，隨著人口老齡化的嚴重加劇，阿爾茨海默病（AD)造成的疾病負擔日益增 力口，而石蒜鱗莖中的加蘭他敏因毒副作用小、療效顯著的優勢是目前被美國FDA認可的抗 AD藥物之一，國內外需求量巨大；其次，它還可用於閉角型青光眼、術後腸肌麻痺、脊髓灰 質炎引起的癱瘓、重症肌無力的治療。石蒜是加蘭他敏原料藥的植物來源之一，但含量低， 其提取通常採用溶劑的抽提方法，提取較為耗時，並且資源浪費、環境汙染嚴重，因此提供 一種新的加蘭他敏的提取方法就顯得尤為重要。


【發明內容】

[0003] 為解決上述現有技術的問題，本發明提出一種石蒜中加蘭他敏的提取方法，為達 到上述目的，本發明的技術方案為：
[0004] 一種石蒜中加蘭他敏的提取方法，包括如下步驟：
[0005] 步驟一、色譜條件的確定：色譜柱：Kromasill00_5C18反相柱（250mmX4. 6mm, 5ym);流動相：乙腈-磷酸緩衝液（17 : 83)，柱溫：35°C，進樣量20yL，檢測波長：290nm; 磷酸緩衝液為2. 72g磷酸二氫鉀溶於100mL水中加入1. 4mL三乙胺定溶至1L，其pH值為 7. 02 ；
[0006] 步驟二、標準曲線的製備：分別稱取25mg加蘭他敏及25mg石蒜鹼標準品，定容， 配成1. Omg/mL的加蘭他敏及1. Omg/mL的石蒜鹼標準溶液，各取0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2、 5mL加蘭他敏及石蒜鹼標準溶液定容於10mL容量瓶中配成質量濃度為0. 005、0. 01、0. 02、 0. 05、0. 1、0. 2、0. 5mg/mL的混合標準溶液，用0. 45 μ m的微孔濾膜過濾後，按上述色譜條件 測定，得回歸方程；
[0007] 步驟三、加蘭他敏的提取：稱取石蒜粉末2. 0g，加入纖維素酶和果膠酶，加入pH = 4. 5的水溶液在一定溫度條件下浸提一定時間，5000r/min離心20min，取上清液，採用色譜 測定，計算加蘭他敏得率。
[0008] 步驟三中，所述加蘭他敏得率的計算公式為 CV
[0009] y =一xl00〇/o 仍〇
[0010] 式中：c為加蘭他敏的質量濃度Amg/mL) ;V為提取液定容體積/mL為為石蒜粉 末的質量/mg。
[0011] 步驟三中加蘭他敏的提取條件為：浸提溫度50°C、浸提時間2. Oh、加酶量4%、提 取劑選取pH = 4. 5的水溶液。
[0012] 相對於現有技術，本發明的有益效果為：本發明採用pH為4. 5的水作為提取溶劑， 提取溶劑中加入4%的纖維素酶與果膠酶的複合酶，通過浸提法得到加蘭他敏提取得率為 0. 0294%。該工藝石蒜加蘭他敏提取成本低、提取時間短，工藝簡單，對環境無汙染，提取得 率較高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1酶種類對得率的影響，其中1纖維素酶、2半纖維素酶、3果膠酶。
[0014] 圖2pH對得率的影響。
[0015] 圖3酶用量對得率的影響。
[0016] 圖4浸提時間對得率的影響。
[0017] 圖5溫度對得率的影響。
[0018] 圖6料液比對得率的影響。

【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體附圖及試驗例對本發明方法做進一步詳細說明：
[0020] 1材料與方法
[0021] 1.1材料與試劑
[0022] 石蒜於2012年3月採自湖南省懷化市沅陵縣官莊。
[0023] 加蘭他敏標準品（純度> 98% )中國食品藥品鑑定研究院；石蒜喊標準品（純度 >98%)上海金穗生物科技有限公司；纖維素酶淮安市百麥綠色生物能源有限公司果膠酶 如吉生物科技甲醇、乙腈（均為色譜純）美國Tedia公司；濃硫酸、磷酸二氫鉀、三乙胺均為 分析純。
[0024] 1. 2儀器與設備
[0025] Agilentl260高效液相色譜儀美國Agilent公司；數顯水浴鍋金壇富華儀器有限 公司。
[0026] 1. 3 方法
[0027] 1. 3. 1色譜條件
[0028] 色譜柱：Kromasill00_5C18 反相柱（250mmX4. 6mm，5 μ m);流動相：乙腈-磷酸緩 衝液（17 :83)，柱溫：35°C，進樣量20 μ L，檢測波長：290nm。磷酸緩衝液為2. 72g磷酸二氫 鉀溶於100mL水中加入1.4mL三乙胺定溶至1L，其pH值為7. 02。
[0029] 1. 3. 2標準曲線的製備
[0030] 分別稱取25mg加蘭他敏及25mg石蒜鹼標準品，定容，配成1. Omg/mL的加蘭他敏 及1. Omg/mL的石蒜鹼標準溶液，各取0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、l、2、5mL加蘭他敏及石蒜鹼標準 溶液定容於l〇mL容量瓶中配成質量濃度為0. 005、0. 01、0. 02、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5mg/mL的 混合標準溶液，用〇. 45 μ m的微孔濾膜過濾後，按上述色譜條件測定，得回歸方程。
[0031] 1.3. 3加蘭他敏的提取
[0032] 稱取石蒜粉末2. Og，加入纖維素酶和果膠酶，加入pH = 4. 5的水溶液在一定溫度 條件下浸提一定時間，5000r/min離心20min，取上清液。採用色譜測定，計算加蘭他敏得 率。
[0033] 7 = -xl00%
[0034] 式中：c為加蘭他敏的質量濃度Amg/mL) ;V為提取液定容體積/mL卿為石蒜粉 末的質量/mg。
[0035] 1. 3. 4提取工藝優化
[0036] 1. 3. 4. 1單因素試驗
[0037] 按1. 3. 3節方法，分別考察酶的種類、提取劑pH、酶用量、浸提時間、浸提溫度和料 液比對加蘭他敏得率的影響，確定各個單因素的最佳水平。
[0038] 1. 3. 4. 2 正交試驗
[0039] 在單因素試驗的基礎上，選取浸提溫度（A)、浸提時間（B)、酶用量（C)、提取劑 pH(D) 4項考察因素，每個因素選取3個水平，以加蘭他敏得率為考察指標，採用L9 (34)正交 表進行試驗。
[0040] 2結果與分析
[0041] 2.1加蘭他敏的檢測
[0042] 以1. 3. 1節所示色譜條件進行檢測，加蘭他敏的出峰時間約在10. lmin。以標準 品的含量為橫坐標（X)，以峰面積為縱坐標（Y)，進行線性回歸。加蘭他敏的回歸方程：Y = 8968. 6X+4. 5795, r = 0. 9999。取同一個試樣，在上述色譜條件下，連續進樣6次，經計算加 蘭他敏峰面積的相對標準差（RSD)為1.35%。取同一個試樣，在上述色譜條件下，每隔2h 進樣1次，共進樣6次，經計算加蘭他敏峰面積的相對標準差（RSD)分別為1. 66%，這說明 該檢測方法精密度良好，方法穩定可靠。
[0043] 2. 2單因素試驗
[0044] 2. 2. 1酶的篩選
[0045] 以pH = 4. 5的水為提取劑在料液比1 : 10,加入3%的不同酶（1纖維素酶、2半 纖維素酶、3果膠酶、4纖維素酶+半纖維素酶、5纖維素酶+果膠酶、6半纖維素酶+果膠酶、 7纖維素酶+半纖維素酶+果膠酶）50°C浸提2. 0h，離心，過濾，HPLC檢測。考察不同酶種 類對加蘭他敏得率的影響，結果見圖1。
[0046] 圖2顯示了各種酶對加蘭他敏提取效果的影響，纖維素酶和果膠酶的的混合酶效 果最好。
[0047] 2· 2· 2pH 的影響
[0048] 加入3%的纖維素酶和果膠酶的混合酶，按料液比1 :10,分別加入pH= 1. 5、3、4、 4. 5、5、6、7. 5的水溶液，50°C浸提2. 0h，離心，過濾，HPLC檢測。考察pH對加蘭他敏得率的 影響，結果見圖2。
[0049] 由圖3可知在1?4. 5範圍內加蘭他敏的得率隨著pH的升高而提高，但pH超過 4. 5後得率隨pH的升高而降低，最佳pH為4. 5。
[0050] 2. 2. 3酶用量的影響
[0051] 加入一定量的纖維素酶和果膠酶的混合酶，按料液比1 : 10,加入pH = 4. 5的水 溶液，50°C浸提2. 0h，離心，過濾，HPLC檢測。考察酶用量對蘭他敏得率的影響，結果見圖3。
[0052] 圖4結果表明，酶用量在0?3%，加蘭他敏得率隨酶用量的增加而增加，超過3% 後得率隨時間的增加呈下降趨勢。酶用量為3%時提取效果最佳。
[0053] 2. 2. 4浸提時間的影響
[0054] 按料液比1 : 10加入pH = 4. 5的水溶液，加入3%的纖維素酶和果膠酶，50°C浸 提2. 0h，離心，過濾，HPLC檢測。結果見圖4。
[0055] 由圖5得出，加蘭他敏得率隨浸提時間的增長而增加，浸提1. 5h，得率達最大值， 隨後下降。浸提時間應在1. 5h時提取效果最佳。
[0056] 2. 2. 5溫度的影響
[0057] 按料液比1 : 10加入pH = 4. 5的水溶液，加入3%的纖維素酶和果膠酶，不同溫 度下浸提2. 0h，離心，過濾，HPLC檢測。結果見圖5。
[0058] 圖6結果顯示，一定範圍內加蘭他敏得率隨溫度增加而上升，當溫度為50°C時，力口 蘭他敏得率最高。
[0059] 2. 2. 6料液比的影響
[0060] 按一定料液比加入pH = 4. 5的水溶液，分別加入3 %的纖維素酶和果膠酶，在 50°C浸提2. 0h，離心，過濾，HPLC檢測。結果見圖6。
[0061] 由圖6可知，加蘭他敏得率在1 : : 10時得率最高。
[0062] 2. 3正交試驗
[0063] 在單因素試驗的基礎上，選取浸提溫度、浸提時間、酶用量、提取劑pH為考察因 素，進行正交試驗。結果見表1、表2。
[0064] 表1正交試驗設計與結果
[0065] Tablel Scheme and results of orthogonal array design
[0066]
[0067]

【權利要求】
1. 一種石蒜中加蘭他敏的提取方法，其特徵在於，包括如下步驟： 步驟一、色譜條件的確定：色譜柱：Kromasill00-5C18反相柱（250mmX4. 6mm，5ym);流 動相：乙腈-磷酸緩衝液（17 :83)，柱溫：35°C，進樣量20μ L，檢測波長：290nm ;磷酸緩衝液 為2. 72g磷酸二氫鉀溶於lOOmL水中加入1. 4mL三乙胺定溶至1L，其pH值為7. 02 ; 步驟二、標準曲線的製備：分別稱取25mg加蘭他敏及25mg石蒜鹼標準品，定容，配成 1. Omg/mL的加蘭他敏及1. Omg/mL的石蒜鹼標準溶液，各取0· 05、0. 1、0. 2、0. 5、l、2、5mL加 蘭他敏及石蒜鹼標準溶液定容於10mL容量瓶中配成質量濃度為0. 005、0. 01、0. 02、0. 05、 0. 1、0. 2、0. 5mg/mL的混合標準溶液，用0. 45μηι的微孔濾膜過濾後，按上述色譜條件測定， 得回歸方程； 步驟三、加蘭他敏的提取：稱取石蒜粉末2. 0g，加入纖維素酶和果膠酶，加入pH = 4. 5 的水溶液在一定溫度條件下浸提一定時間，5000r/min離心20min，取上清液，採用色譜測 定，計算加蘭他敏得率。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟三中，所述加蘭他敏得率的計算公式為 7 = -xl〇〇〇/" mo 式中：C為加蘭他敏的質量濃度Amg/mL) ;V為提取液定容體積/mL ;m(l為石蒜粉末的 質量/mg。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟三中加蘭他敏的提取條件為：浸提溫度 50°C、浸提時間2. Oh、加酶量4%、提取劑選取pH = 4. 5的水溶液。
【文檔編號】C07D491/107GK104059078SQ201310712971
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】田春蓮, 王鵬, 劉小攀, 肖卓炳 申請人:吉首大學