具有改良生長特性的木本植物及其產生方法

2023-09-09 22:11:05

專利名稱：具有改良生長特性的木本植物及其產生方法
技術領域：
本發明一般地涉及分子生物學領域，涉及用於改良植物生長特性的方法。更具體地說，本發明涉及用於從表型上改良植物和轉基因植物的方法，所述植物中在木質形成不同階段特異性表達之基因的表達發生了改變，從而導致改良的生長表型。本發明還提供了本發明方法中使用的構建體。
背景技術：
當前，林木改造和分子育種的主要目標是改進樹木的質量和產量。全球對木材製品的需求正以每年約1. 7%的速度增長，而這種木材消耗的增長是在已達到或超過世界森林中的最高可持續收穫率的情況下發生的。因此，需要在世界範圍內提高栽植木材的產量。森林栽植還可具有作為碳匯作物(carbon sequestration crop)應對大氣CO2增加的優點。類似地，也需要提高來自非木本植物的生物量產生，例如為了滿足對能源生產原材料的需求。因此，對高等物種細胞發育期間特定過程的改良是具有巨大商業價值的，這不僅包括改良樹木的特性，還包括對其它植物的改良。依靠頂端分生組織進行的植物生長導致了一系列初生組織的發育以及莖和根的伸長。除了這種初生生長之外，樹木種類還會經歷次生生長並產生來自形成層的次生組織「木質」。所述次生生長增加了莖和根的周長。Sterky 等 1998 (Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1998 (95)，13330-13335)已公布了針對兩個楊屬物種的大規模基因探索計劃的結果，包括來自歐洲山楊X美洲山楊(Populustremula L. Xtremuloides Michx.)和毛果楊(Populus trichocarpa 「Tfichobel，，)之木質形成組織的5，629個表達序列標籤(EST)。這些EST代表了針對兩個cDNA文庫的總共3，719種獨特的轉錄物，並且這些轉錄物中的2，245種具有推定的功能。作者表示，所展示的EST數據對於鑑定參與植物次生木質部和韌皮部形成的基因將具有價值，但對於如何進行鑑定則沒有給出清楚的指導。Sterky等1998的文章還揭示了一大批功能未知或未確定的EST的存在。在現有技術(例如Sterky等1998)中，從分離自活躍生長樹木的莖組織構建文庫。從多種組織的混合物製備形成層的文庫，包括歐洲山楊X美洲山楊的發育中的木質部、分生組織形成層以及發育中及成熟的韌皮部。這些形成層組織是通過剝離樹皮並用解剖刀刮擦兩個暴露表面而獲得的。從毛果楊製備發育中的木質部文庫。這些組織是通過剝離樹皮並刮擦暴露的木質部一側而獲得的。使用所述方法只可能建立分別代表完整形成層、發育中的木質部以及韌皮部(利用刮擦暴露的樹皮來製備)的三個不同文庫。現有技術對形成層中的基因表達與發育中木質部組織中的基因表達進行了比較。由於組織製備實驗操作帶來的局限性，該實驗只進行了粗略的比較。用於製備發育中木質部文庫的組織包含從擴大中的木質部細胞到晚期木質部發育的組織。還有一個問題是如何鑑定可能最具重要性的基因並將其與特定發育階段和細胞最終特性聯繫起來。另一問題是如何鑑定至今未知的基因，將其與植物中的特定細胞類型和/或功能聯繫起來。最後，一個特別的問題是如何發現參與細胞分裂、細胞擴大、細胞壁合成、凋亡和程序性細胞死亡以及與決定樹木生長和木質特性有關的其它重要過程的特定基因。 Hertzberg 等 2001 (Proc. Natl. Acad. Sc1. USA，2001 (98)，14372-14737)和Schrader等2005 (Plant Cell, (16)，2278-2292)已利用轉錄物特徵譜來揭示木質部發育期間數千種基因的轉錄層次，並提供了可有助於進一步闡明許多未知功能基因的表達數據(White 等 1999 (Science 1999(286)2187-2184) ；Aharoni 等 2000 (Plant Cell2000 (12) 647-662) ο然而，這對於木本植物(例如樹木)來說在技術上很複雜。Hertzberg等和Schrader等已研究了發育中的楊樹次生木質部，它是高度組織化的並且在不同發育階段中具有易識別且獨特的邊界。木質形成起始於維管形成層。形成層衍生物通過分裂、擴大、次生壁形成、木質化以及最終的程序性細胞死亡過程發育成木質部細胞。樹木中大尺寸的維管分生組織為通過切向冷凍切片獲取來自確定發育階段的樣品提供了特有的可能性(Uggla 等 1996Proc. Natl. Acad. Sc1. USA，1996 (93) ,9282-9286)。為了測定歐洲山楊 X美洲山楊(雜交山楊)中個體發育的木質形成期間特定階段的穩定狀態mRNA水平，收集貫穿木質發育區的30 μ m厚切片並隨後利用數個由來自雜交山楊的多達20，000個獨特EST組成的已點樣cDNA微陣列進行分析(Schena等1995Science 1995(270)467-470)。儘管從EST方法、基因組測序以及利用DNA陣列技術進行的表達研究顯然可證實基因在何處和何時表達，但是僅通過這些類型的分析工具不太可能闡明基因在生物學和/或技術上的功能。為了分析以及證實基因的功能，必須進行功能表徵，例如通過基因失活和/或基因過表達來實現。然而，為了能鑑定具有令人感興趣且經常難以預料之可商用特徵的基因，需要有新的分析平臺來基於多重標準評估候選基因。發明概述本發明涉及利用生物信息學工具、來自EST測序和DNA陣列的數據從鑑定得到的大批候選基因中選擇具有可商用表型之基因的一種新的應用廣泛的分析平臺。該分析平臺致力於基於多重標準的組合對生長行為進行分析。本發明提供了通過改變滿足所述標準的一種或多種基因的表達來產生轉基因植物的方法。因此，本發明的一方面提供了產生與其野生型相比生長有所提高的轉基因植物的方法，其包括改變植物中在樹木形成不同階段特異性表達的至少一種基因的基因產物水平。在本發明的一個具體實施方案中，所述至少一種基因的選擇滿足該基因的RNAi下調在一組3-8株轉基因植物中引起以下效果的標準當比較在18小時光周期、22°C/15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用I 100稀釋的Weibulls Rika S NPK 7_1_5的條件下於溫室中培育8周的所述一組轉基因植物與相同條件下培育的一組野生型植物時，a)在最終高度平均值(average final height, AFH)、最終高度最大值(maximumfinal height, MFH)、最大高度生長速率平均值(averagemaximum height growth rate,AMHGR)和最大高度生長速率最大值(maximum maximum height growth rate,MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(average final diameter,AFD)、最終直徑最大值(maximumfinal diameter, MFD)、直徑生長速率平均值(averagediameter growth rate, ADGR)和直徑係數最大值(maximum diametercoefficient, MDC)中具有5%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長速率最大值(MMHGR)和/或直徑係數最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；其中最大高度生長速率定義為以4個連續的高度數據點擬合的線性函數的斜率，高度生長速率值是以逐步的方式針對數據點1-4、數據點2-5等計算得到的，而最大高度生長速率值是針對每株植物計算得到的。利用該新分析平臺分析的許多基因顯示出令人感興趣且經常難以預料的可商用特徵。因此，本發明的另一方面涉及包含重組多核苷酸(DNA構建體)的轉基因植物，所述重組多核苷酸含有能夠改變植物中在樹木形成階段特異性表達的至少一種基因之基因產物水平的核苷酸序列，其中所述至少一種基因的選擇滿足該基因的RNAi下調在一組3-8株轉基因植物中引起以下效果的標準當比較在18小時光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/l、K 56g/l的條件下於溫室中培育8周的所述轉基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長速率平均值(AMHGR)和最大高度生 長速率最大值(MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長速率平均值(ADGR)和直徑係數最大值(MDC)中具有5%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長速率最大值(MMHGR)和/或直徑係數最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；其中最大高度生長速率定義為以4個連續的高度數據點擬合的線性函數的斜率，高度生長速率值是以逐步的方式針對數據點1-4、數據點2-5等計算得到的，而最大高度生長速率值是針對每株植物計算得到的。本發明的另一方面提供了根據本發明的轉基因植物並且包含重組多核苷酸的植物細胞或植物後代。本發明的又一方面提供了由具有上述特性的轉基因植物產生的木材。本發明的又一方面提供了包含至少一個如上所述序列的DNA構建體。最後，本發明的一個方面提供了包含本發明DNA構建體的植物細胞或植物後代。


圖1顯示了樹木形成的不同階段，其中(A)是用甲苯胺藍染色的雜交山楊莖橫切片。黑條指示採樣組織的位置。為了給出來自形成層的其它組織中基因表達的低解析度照片，因而包括了韌皮部樣品。(B)是維管發育期間不同細胞類型和階段的示意圖。棒狀圖表示不同發育階段的時間和程度以及主要細胞壁成分的出現。(C)顯示了在採樣組織中對具有差異表達的1791種選定基因的分級聚類分析。底部的顏色標度表示樣品之間的倍數變化。(D)(1-X)顯示了具有不同的差異表達模式的基因群以Iog2為刻度的表達比。樣品示於圖底部。圖2顯示了來自木質部差異數據的選定基因的表達模式。將選自Hertzberg等(2001)數據之基因的9種主要實例用於對雜交山楊進行功能分析。該樣品和圖與圖1D中相同。該圖顯示了覆蓋木質部差異區的那些基因的表達模式。表達比以log標度表示。圖3顯示了來自分生組織實驗數據的選定基因的表達模式。將選自Schrader等(2004)數據之基因的6種主要實例用於對雜交山楊進行功能分析。該樣品和圖與圖1D中相同。該圖顯示了覆蓋形成層區域的那些基因的表達模式。表達數據來自Schrader等2004的B輯。表達數值以log標度表示,用於歸一化和數據準備(參見Schrader等2004)。圖4顯示了用四個不同數據點的線性回歸線表示的高度生長曲線實例，黑色回歸線顯示出最大的高度生長速率。發明詳述定義在進一步詳細論述本發明之前，首先對以下術語和慣例進行定義術語「轉基因植物」是指含有在相同物種、品種和栽培變種的野生型植物中未發現的遺傳物質的植物。所述遺傳物質可包括轉基因、插入誘變事件(例如通過轉座子或T-DNA插入誘變來實現)、激活標記序列(activation tagging sequence)、突變序列、同源重組事件或者經嵌合修復(chimeraplasty)修飾的序列。通常，通過人為操作將外源遺傳物質引入植物中。該術語還指其中已插入行使選擇標記功能之遺傳物質的植物。這樣的選擇標記的實例包括卡那黴素、潮黴素、膦絲菌素(phosphoinotricin)、氯磺隆(chlorsulfron)、氨甲蝶呤、慶大黴素、壯觀黴素、咪唑啉酮類(imidazolinones)、d_胺基酸和草甘膦(glyphosate)。在本發明的上下文中，術語「生長」包括植物的初生生長(其包括莖和根的伸長)和次生生長(其包括從形成層生成次生組織「木質」以及莖和根周長的增加。因此，表述「「提高的生長」在本文中涉及在同樣的培養條件下培養時，相對於轉基因植物所來源之野生型植物而言的轉基因植物的生長提高。如下文所述，如果植物滿足下文實施例中所定義之「生長差異選擇標準」中的至少一條則認為轉基因植物生長有所提高。術語「表型」在本文中是指植物個體的總體自然表現，例如生長。本文中所用的不同生長表型的實例列於以下表1. 2中，包括例如稱為「ΑΠΓ (其指野生型種群及每種構建組種群的最終高度平均值)或「AFD」(其指野生型種群及每種構建組種群的最終直徑平均值)的表型。在本發明的上下文中，術語「木質形成階段」是指木質形成的時期，例如細胞分裂和細胞擴大，如以下文獻所定義Wilson, B. F.，ffodzicki, T. J.以及Zhaner，R. (1966)Differentiation Of cambial derivates Proposedterminology. Forest Science 12，438-440 頁。
當論及在木質形成的不同階段特異性表達的基因時，術語「特異性表達」用於表示在木質形成階段表達提高的基因。應當理解，在木質形成階段所述基因的表達可提高10%或更多，例如15%或更多、20%或更多、25%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、75%或更多、100%或更多、200%或更多、300%或更多、400%或更多、500%或更多、700%或更多或者1000%或更多。術語「基因」廣義上指與生物學功能相關的任何DNA片段。基因包括編碼序列和/或其表達所需的調控序列。基因還包括非表達的DNA核酸區段，例如，形成針對其它蛋白質的識別序列(例如啟動子、增強子或其它調控區)。基因可從多種來源獲得，包括從目的來源克隆或者根據已知或預測的序列信息合成，還可包括設計成具有所需參數的序列。術語「RNA幹擾」或「RNAi 」 一般是指雙鏈RNA分子或短髮夾RNA改變與其共有顯著或完全同源性之核酸序列的表達的過程。術語「RNAi下調」是指由一種或多種RNAi介導的核酸序列表達減少。術語「RNAi種類」是指引起RNAi的獨特RNA序列。術語「光周期」是指光照與黑暗的每日循環。術語「核酸構建體」、「DNA構建體」和「載體」是指用於轉化植物或其它生物的遺傳序列。核酸構建體或DNA構建體可以能夠在轉化植物中指導蛋白質或核酸序列(例如反義RNA)的表達。通常，這樣的核酸構建體或DNA構建體至少包含針對所需基因產物或所需核酸產物並與5』和3』轉錄調控元件有效連接的編碼區。在一些實施方案中，這樣的核酸構建體或DNA構建體是嵌合的，即由不同來源的序列混合組成。然而，非嵌合的核酸構建體或DNA構建體也可用於本發明中。在涉及例如細胞、核苷酸、載體、蛋白質或多肽時，術語「重組」通常表示已通過引入異源(或外源)核酸或通過改變天然核酸而對細胞、核苷酸或載體進行了修飾，或者通過引入異源胺基酸而對蛋白質或多肽進行修飾，或者所述細胞來源於經如此修飾的細胞。重組細胞表達在天然(非重組)形式細胞中未發現的核酸序列(例如基因)，或者表達在正常情況下會異常表達、低表達或者根本不表達的天然核酸序列(例如基因)。涉及細胞時術語「重組」表示所述細胞複製異源核酸，或表達由異源核酸編碼的肽或蛋白質。重組細胞可包含在天然(非重組)形式細胞中未發現的基因。重組細胞還可包含天然形式細胞中存在的基因，其中所述基因被修飾並通過人工手段被重新引入細胞中。該術語還包括含有細胞內源核酸的細胞，所述內源核酸被修飾而未從細胞中取出，所述修飾包括通過基因置換、定點突變和相關技術獲得的修飾。術語「核酸序列」是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合體。除非特別限制，否則該術語涵蓋包含天然核苷酸已知類似物的核酸序列，其具有與參照核酸類似的結合特性並且以與天然核苷酸類似的方式進行代謝。除非另外指明，否則一種具體的核酸序列還暗含其保守性修飾的變體(例如簡併密碼子替換)和互補序列以及明確指示的序列。「多核苷酸」是包含眾多聚合核苷酸殘基的核酸序列，例如至少約15個連續的聚合核苷酸殘基，任選地至少約30個連續的核苷酸，至少約50個連續的核苷酸。在許多情況下，多核苷酸包含編碼多肽(或蛋白質)或其結構域或片段的核苷酸序列。另外，多核苷酸可包含啟動子、內含子、增強子區、多腺苷酸化位點、翻譯起始位點、5』或3』非翻譯區、報告基因、選擇標記等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核苷酸任選地包含經修飾的鹼基或經修飾的主鏈。多核苷酸可以是例如基因組DNA或RNA、轉錄物(例如mRNA)、cDNA、PCR產物、克隆DNA、合成DNA或RNA等。多核苷酸可包含有義或反義方向的序列。術語「多肽」以廣義使用，用於定義胺基酸殘基的線性鏈，包括天然存在的及其合成類似物。在本發明的上下文中，「互補」是指在兩個核苷酸序列之間彼此精確配對的能力。例如，如果在寡核苷酸中某一位置的核苷酸能夠與某DNA或RNA分子相應位置的核苷酸以氫鍵結合，那麼該寡核苷酸與該DNA或RNA就被認為在所述位置彼此互補。當寡核苷酸中有足夠數目的核苷酸可與目標DNA或RNA中相應核苷酸形成氫鍵從而能夠形成穩定的複合物時，所述DNA或RNA鏈被認為是彼此互補的。因此，在本文上下文中表述「互補序列」或「互補」也指在嚴格條件下可與本發明核酸分子退火的核苷酸序列。術語「嚴格條件」是指具有高、弱或低嚴格性的一般條件。術語「嚴格性」是本領域眾所周知的在涉及實施核酸雜交時使用的條件(溫度、離子強度以及其它化合物例如有機溶劑的存在)。與「弱嚴格性」或「低嚴格性」相比，在「高嚴格性」條件下，核酸鹼基配對只會發生在具有高頻率互補鹼基序列的核酸片段之間。用於測試雜交的合適條件包括預浸泡於5XSSC中，然後在約40°C下、在含20%甲醯胺、5 X Denhardt 』 s溶液、50mM磷酸鈉(pH6. 8)和50mg經超聲變性處理的小牛胸腺DNA的溶液中預雜交I小時，隨後在約40°C下、在補充了 IOOmMATP的同樣溶液中雜交18小時，之後在40°C下(低嚴格性)將濾器用2XSSC、0.2% SDS漂洗30分鐘，共3次，優選在50°C下(中等嚴格性)，更優選在65°C下(高嚴格性)，更優選在約75°C下(極高嚴格性)。有關雜交方法的更多細節可參見 Sambrook 等，Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor,19890術語「雜交」和「使雜交」以廣義使用，用於指互補或部分互補核酸序列之間的結合，例如使其分離之變性過程的逆向過程。雜交通過氫鍵結合而發生，其可以是在互補核苷或核苷酸鹼基之間的Watson_Crick、Hoogsteen、反Hoogsteen氫鍵結合等。在DNA中常見的四種核酸鹼基是G、A、T和C，其中G與C配對，A與T配對。在RNA中，T被尿嘧啶(U)代替，而與A配對。參與標準雙鏈形成的核酸鹼基中的化學基團構成Watson-Crick面。幾年後，Hoogsteen顯示嘌呤核酸鹼基(G和A)除了其Watson-Crick面之外還具有Hoogsteen面，該Hoogsteen面可從雙鏈外側識別並用於通過氫鍵鍵合來結合嘧啶寡核苷酸，從而形成三螺旋結構。「子序列」或「片段」是完整序列的任一部分。因此，片段或子序列是指分別包含較長胺基酸(例如多肽)或核酸(例如多核苷酸)一部分的胺基酸或核酸序列。在本文中，兩個胺基酸序列間或兩個核苷酸序列間的同源性通過參數「序列同一性」來描述。術語「序列同一性」表示相等長度的兩個胺基酸序列之間或兩個核酸序列之間同源程度的定量測量。如果待比較的兩個序列不是等長的，則必須對其進行比對以得出最佳的可能匹配，其中允許插入空位或者截短多肽序列或核苷酸序列的末端。序列同一性可根據文獻 Fei ! Objekt kan inteskapas genom redigering aV f』iiltkodei*進行計算，其中Ndif是在比對時兩個序列中不一致殘基的總數，並且其中Nm是序列之一中的殘基數目。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC具有75%的同一性(Ndif = 2，Nref = 8)。空位作為不一致的具體殘基來計算，即，DNA序列AGTGTC與DNA序列AGTCAGTC具有75%的同一性
(Ndif = 2，Nref = 8)。在本發明涉及核苷酸序列的所有實施方案中，一個或多個序列之間的序列同一性百分比還可基於利用默認設置的clustalW軟體(http:/www. eb1. ac. uk/clustalff/index,html)進行的序列比對。對於核苷酸序列對比而言，這些設置為比對(Alignment)=3Dfull、空位(Gap Open) 10. 00、空位延伸(Gap Ext.) O. 20、空位間隔距離(Gap separationDist.)4、DNA 權重矩陣(DNA weight matrix):同一性(IUB)。或者，可使用 DNASISMax程序對序列進行分析，並可通過http://www. paraliRn. ors/網站進行序列比較。該服務基於稱為Smith-Waterman(SW)和ParAlign的兩種比較算法。第一種算法由Smith和Waterman(1981)發表,它是一種發現兩個序列的最佳局部比對的成熟方法。另一種算法ParAlign是用於序列比對的啟發式方法；該方法的詳細描述發表於RogneS(2001)中。使用了得分矩陣和空 位罰分以及E值的默認設置。在涉及兩個核酸或多肽的上下文中，短語「基本上一致」或「大致相同」是指當進行最大對應的比較和比對時，使用以下序列比較算法之一或通過直觀觀察來測量，兩個或多個序列或子序列分別具有至少約60 %、70 %、75 %，優選80 %或85 %，更優選90 %、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更大的核苷酸或胺基酸殘基百分比同一性。在一些方面，「基本上一致」存在於長度至少為50個殘基的胺基酸序列區域，例如，至少約 100、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160 或 165 個胺基酸殘基。在一些方面，「基本上一致」存在於長度至少約150個核酸殘基的核酸序列區域，例如至少約200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800 個核酸殘基，例如至少約900 個核昔酸，或例如至少約 lkb、1. lkb、1. 2kb、1. 3kb、1. 4kb、1. 5kb、1. 6kb、1. 7kb、1. 8kb、1.9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb、2. 4kb、2. 5kb、2. 6kb、2. 7kb、2. 8kb、2. 9kb,或者例如至少約3kb。在一些方面，胺基酸或核酸序列在全長多肽序列或相應編碼區的範圍內是基本上一致的。術語「保守替換」是在鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸)、芳族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小胺基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)的組內進行的。胺基酸替換通常不改變特定活性是本領域已知的並描述於例如，H. Neurath 和 R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, AcademicPress, New York。最常發生的更替是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/IIe、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly以及這些的反轉。本文使用的術語「保守替換變體」是指包含一個或多個保守替換的核苷酸序列變體。一般地以及在本文的上下文中，術語「沉默替換」是指不影響密碼子含義因而對多肽結構無影響的鹼基替換。如技術人員所知，遺傳密碼的簡併性使沉默替換成為可能。術語「保守結構域」是指多肽在多個物種之間相似的胺基酸序列或DNA或RNA中這樣的核苷酸序列。已知的保守序列集合通過共有序列來表示。胺基酸基序常由保守序列組成。此外，術語「保守序列」還指核酸序列分子中在整個進化中保持基本上未改變的鹼基序列或蛋白質中的胺基酸序列。「共有序列」定義為代表最經常出現於核酸序列中各位置的鹼基或最經常出現於蛋白質中各位置的胺基酸的理想序列。「共有序列」通過比對所有已知的核酸序列或蛋白質實例使其序列同一性最大化來鑑定。對於待承認為共有序列的序列而言，各具體鹼基或胺基酸必須在其位置相當佔優勢，並且絕大多數序列中須與共有序列一致而只有少量發生替換，例如I個或2個。本文中使用的術語「啟動子」是指位於基因轉錄起點上遊的序列決定區，並且其參與RNA聚合酶及其它蛋白質的識別和結合從而起始和調節轉錄。植物中可用的啟動子不一定是植物來源的。「基本啟動子(basalpromoter) 」是組裝轉錄起始所需之轉錄複合物所需的最小序列。基本啟動子常包含通常位於轉錄起始位點上遊15 35個核苷酸之間的「TATA盒」元件。基本啟動子有時還包含「CCAAT盒」元件(通常為CCAAT序列)和/或GGGCG序列，其通常位於轉錄起始位點上遊的40 200個核苷酸之間，優選60 120個核苷酸之間。本文中稱作「組成型啟動子」的啟動子在大多數(但不一定是所有的)環境條件以及發育或細胞分化狀態下活躍地啟動轉錄。組成型啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉錄起始區以及來源於根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) TDNA的I』或2』啟動子，以及技術人員已知的來自多種植物基因的其它轉錄起始區，例如玉米泛素(ubiquitin)-l啟動子。器官特異性啟動子可以是，例如，來自忙藏組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴 薯塊莖和果實的啟動子,或者來自代謝組織(metabolic sinktissue)例如分生組織的啟動子,種子特異性啟動子例如來自水稻的谷蛋白(gluteI in)、谷醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白或白蛋白啟動子,來自蠶豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4以及來自蠶豆的未知種子蛋白質基因的啟動子，來自種子油體蛋白質的啟動子，來自歐洲油菜(Brassica napus)的忙藏蛋白質napA啟動子,或者本領域已知的任何其它種子特異性啟動子，例如，如WO 91/14772中所述。此外，啟動子可以是葉子特異性啟動子，例如來自水稻和番茄的rbcs啟動子、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子、或來自水稻的aldP基因啟動子，或者創傷誘導型啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子。在本發明的上下文中，「誘導型啟動子」是指受某些條件調控的啟動子，例如光、化學物質濃度、蛋白質濃度；生物、細胞或細胞器的狀態等。誘導型啟動子的實例是HSP啟動子和PARSK1，後者是來自編碼絲氨酸-蘇氨酸激酶的擬南芥基因的啟動子並且被脫水、脫落酸和氯化鈉所誘導。實質上，受誘導型啟動子控制的表達響應於所應用的刺激而「開啟」或提高。所述刺激的性質依啟動子而變化並可包括上述環境因素。無論在不存在刺激時表達水平如何，在正確的刺激存在時由任何誘導型啟動子起始的表達都是提高的。本文中使用的術語「組織特異性的」是指在特定組織中的特性，其一般並非在所有組織中出現，或者可僅在目的組織中出現。在本申請中，「組織特異性的」在涉及基因調控元件(啟動子或啟動子加增強子和/或沉默子)、其編碼的基因或者所述基因的多肽產物時使用。在涉及基因調控元件或「組織特異性啟動子」時，該術語意指所述啟動子(以及其它調控元件例如增強子和/或沉默子元件)在特定譜系、組織或細胞類型的細胞中指導所連接序列轉錄，而在非所述譜系、組織或細胞類型的細胞或組織中則基本上失活。就轉錄物產生而言，本發明可用的組織特異性啟動子在特定組織中比在其它組織的細胞中或在同一譜系的轉化或惡性細胞中要高出至少5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或甚至1000倍。在涉及基因或基因多肽產物時，術語「組織特異性的」意指所述基因的多肽產物在該特定組織或細胞類型的細胞中可檢測到，但在某些其它細胞類型中則基本上檢測不到。特別相關的組織特異性啟動子包括在植物的木質部形成組織中特異表達或活躍的啟動子序列。這樣的啟動子的實例有Lmpl、Lmx2、Lmx3、Lmx4和Lmx5啟動子，參見WO 2004097024。「終止子序列」是指在用於轉錄的基因組DNA上標誌著基因或操縱子末端的遺傳序列部分。終止子序列被蛋白因子識別，所述蛋白因子在多腺苷化信號處共轉錄切割新生RNA,使RNA聚合酶停止進一步延伸轉錄物。當某一核酸與另一核酸序列的位置具有功能聯繫時，所述核酸即為「有效連接的」。例如，如果啟動子或增強子增強了編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子與該編碼序列有效連接。「有效連接」意指被連接的DNA序列通常是連續的(需要時連接兩個蛋白質編碼區)且在同一讀碼框內。然而，由於增強子通常在與啟動子相隔數千鹼基的情況下發揮作用並且內含子序列的長度可能不定，所以某些多核苷酸元件可以採用非連續的有·效連接。在本發明的上下文中，術語「轉化」與「轉染」是同義詞，其是指將DNA引入細胞的過程。DNA構建體(包含·目的基因或啟動子的至少一部分)可被引入宿主細胞內，如前所述，可以是單獨的細胞、培養中的細胞、作為宿主生物一部分的細胞、已受精的卵母細胞或配子體或胚胎細胞。當涉及宿主細胞時術語「引入」意指本領域已知的用於將重組載體DNA引入靶宿主細胞的標準步驟。這樣的步驟包括但不限於轉染、感染、轉化、自然攝取、電穿孔、生物射彈(biolistics)和農桿菌(Agrobacterium)。「可再生細胞(regenerable cell) 」意指從其可再生出完整植物的植物細胞。應當理解，所述再生細胞是保持其遺傳潛能(在本領域內也稱為「全能性」)的細胞。還應理解，在培養時所述再生細胞可能需要適當的刺激來表達親本植物的全部遺傳潛能。轉基因棺物的產牛方法用於選擇基因的功能分析可使用現有技術的步驟來鑑定用於改變和/或修飾生長相關植物表型的候選基因，例如，如Hertzberg等(2001)和Schrader等(2004)中所述。參與生長調控的候選基因還可例如在具有使用現有技術知識鑑定之特殊特性的轉錄因子中進行鑑定。為了使針對生長相關特性/功能的功能基因組計劃的陽性結果最多，所述候選基因鑑定在本領域中被認為是重要的。因此，本發明的第一方面提供了產生較其野生型而言生長有所提高的轉基因植物的方法，該方法包括改變植物中在木質形成階段特異性表達的至少一種基因的基因產物水平。基於靶向所述候選基因，本發明提供了產生轉基因植物的方法，所述方法包括靶向已通過新方法進一步選定供功能分析的基因。根據該方面的一個實施方案，所述至少一種基因的選擇滿足該基因的RNAi下調在一組3-8株轉基因植物中引起以下效果的標準當比較在18小時光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/l、K 56g/l的條件下於溫室中培育8周的所述轉基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長速率平均值(AMHGR)和最大高度生長速率最大值(MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長速率平均值(ADGR)
和直徑係數最大值(MDC)中具有5%或更大的差異；和/或 c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長速率最大值(MMHGR)和/或直徑係數最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；並且其中最大高度生長速率定義為以4個連續的高度數據點擬合的線性函數的斜率，高度生長速率值是以逐步的方式針對數據點1-4、數據點2-5等計算得到的，而最大高度生長速率值是最後針對每株植物從生長速率值中選擇的。含有N 84g/l、P 12g/l和K 56g/l的肥料是目前可獲得的，商品名為WeibullsRika S NPK7-1-5。該肥料的成分如下(均為 g/Ι) 總 N = 84，NO3 = 55，NH4 = 29,P = 12，K = 56，Mg = 7. 2，S = 7. 2，B =0.18，Cu = O. 02，Fe = 0. 84，Mn = 0.42，Mo = 0. 03，Zn=0.13。在另一實施方案中採用了更嚴格的一組標準。根據該實施方案，所述至少一種基因的選擇滿足該基因的RNAi下調在一組3-8株轉基因植物中引起以下效果的標準當比較在18小時光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/、K 56g/l的條件下於溫室中培育8周的所述轉基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長速率平均值(AMHGR)和最大高度生長速率最大值(MMHGR)中具有8%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長速率平均值(ADGR)和直徑係數最大值(MDC)中具有8%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長速率平均值(ADGR)中具有22%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長速率最大值(MMHGR)和/或直徑係數最大值(MDC)中具有22%或更大的差異；其中最大高度生長速率定義為以4個連續的高度數據點擬合的線性函數的斜率，高度生長速率值是以逐步的方式針對數據點1-4、數據點2-5等計算得到的，而最大高度生長速率值是最後針對每株植物從生長速率值中選擇的。本發明的一個優點是它提供了用於評估參與決定生長特性之候選基因的極其靈敏的分析平臺。先前的基因評估方法基於依照單一標準(例如植物高度或直徑)進行表型評估，而本發明的方法允許基於多重標準對表型進行表徵，包括最終高度平均值、最終高度最大值、最大高度生長速率平均值和最大高度生長速率的最大值。使用該分析平臺允許鑑定和選擇在產生生長提高之植物的方法中所用的新的靶基因。如果使用較簡單的方法，這些靶標基因將不會被認為參與生長特性的決定或者它們只被認為在產生生長表型中起不重要的作用。在本發明的一些具體實施方案中，相對於相應野生型植物而言，通過改變根據以上標準評估和選擇之候選基因的表達水平來產生具有有利的植物表型。根據這些方面提供的方法包括改變植物中至少一種基因的基因產物水平，所述基因包含選自以下的核苷酸序列a)選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 的核苷酸序列；例如 SEQID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60 ；b)與選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 的核苷酸序列(例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)具有至少 60% 同一性的核苷酸序列；c)a)或b)的核苷酸序列的子序列或片段。由序列ID 號 1-17、50、51、54-58、60 指示的序列(例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)代表克隆自雜交山楊的候選基因的部分序列。正如技術人員所應理解地，使用常規克隆技術(例如Sambrook等所述的技術)可容易地獲得在 SEQID NO :1-17、50、51、54-58、60(例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)中所述的序列5，和3，端的另外的序列。核酸構建體 根據本發明的一些更具體的實施方案，所述方法包括提供核酸構建體(例如重組DNA構建體)的步驟，所述核酸構建體包含選自以下的核苷酸序列d)包含選自 SEQ ID NO : 1_17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、
15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；e)d)之核苷酸序列的互補核苷酸序列；f) d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；g)與d)、e)和f)中的任一序列至少60% —致的核酸序列；以及h)在嚴格條件下與d)、e)或f)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在本發明的另一些實施方案中，c)或g)中的核酸序列與a)、c)、d)、e)或f)中的任一序列至少65%—致,例如與a)、c)、d)、e)或f)中的任一序列至少70%—致,至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。在本發明該方面的一些優選實施方案中，a)的核苷酸序列選自SEQ IDN0:1、5、6、9、11、12、15、17、56、57 和 58。本領域中存在多種用於產生本發明的核酸序列和核酸/DNA構建體的方法。用於鑑定和分離DNA克隆的步驟是本領域技術人員公知的，參見例如Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual (第二版)，1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, New York, 1989。或者,本發明的核酸序列可利用適合本發明的多種體外擴增方法通過適當選擇特異性或簡併性引物來產生。足以指導技術人員實施體外擴增方法的方案實例包括聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、Qi3-複製酶擴增及其它RNA聚合酶介導的技術(例如NASBA)，例如用於產生本發明的同源核酸，參見Sambrook (同上)。或者，可從固相合成方法所產生的片段組裝成本發明的核酸構建體。通常，單獨合成多達約100個鹼基的片段，然後利用酶促法或化學法連接以產生所需序列，例如編碼轉錄因子全長或部分的多核苷酸。例如，利用亞磷醯胺法進行化學合成是技術人員眾所周知的。根據所述方法，寡核苷酸被合成、純化、與其互補鏈退火、連接、然後任選地克隆進合適的載體中。如所提及地，上述序列來自雜交山楊。技術人員應當理解，可從其它物種分離出所述序列的同源物，其非限制性的實例包括金合歡樹(acacia)、桉樹、角樹(hornbeam)、山毛櫸樹(beech)、桃花心木(mahogany)、胡桃、橡樹、白臘樹(ash)、山胡桃樹(hickory)、樺樹、慄樹、赤楊(alder)、楓樹、懸鈴木(sycamore)、銀杏樹、棕櫚樹、香楓(sweet gum)、柏樹、花旗松(Douglas fir)、冷杉、紅杉(sequoia)、鐵杉、雪松、杜松(juniper)、落葉松(larch)、松樹、巨杉(redwood)、雲杉、紫杉(yew)、蘋果樹、李子樹、梨樹、香蕉樹、桔樹、稱猴桃樹、朽1檬樹、樓桃樹、葡萄樹、無花果樹、棉花、竹子、柳枝稷(switch grass)、草蘆(red canarygrass)和橡膠植物。所述序列的可用同源物還可從來自楊柳科(Salicaceae)的硬木植物中分離，例如來自柳屬和楊屬。所述屬中的成員的已知常用名為柳樹、楊樹和山楊。具體地，本發明的核苷酸序列包含選自SEQ ID NO : 18_38、48、49、51_60 (例如SEQID NO :20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列或其互補核苷酸序列。顯而易見地，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少15個核苷酸，例如至少16個核苷酸，至少17個核苷酸，至少18個核苷酸，至少19個核苷酸，至少20個核苷酸，至少21個核苷酸，至少22個核苷酸，至少23個核苷酸，至少24個核苷酸，至少25個核苷酸，例如至少30個核苷酸，至少35個核苷酸，至少40個核苷酸，至少45個核苷酸，至少50個核苷酸，至少55個核苷酸，至 少60個核苷酸，至少65個核苷酸，至少70個核苷酸，至少75個核苷酸，至少80個核苷酸，至少85個核苷酸，至少90個核苷酸，至少95個核苷酸，或者例如至少100個核苷酸。在某些實施方案中，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少約150個核酸殘基，例如至少約 200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800個核苷酸，例如至少約900個核苷酸，或者例如至少約lkb、1. lkb、1. 2kb、1. 3kb、1. 4kb、
1.5kb、l. 6kb、l. 7kb、l. 8kb、l. 9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb,2. 4kb、2. 5kb、2. 6kb,2. 7kb、
2.8kb、2. 9kb或例如至少約3kb。特別地，本發明的方法可包括提供含有核苷酸序列的核酸構建體(例如重組DNA構建體)的步驟，所述核苷酸序列與所述特定序列相比包含改變所編碼多肽中一個或數個胺基酸的保守性變化。因此，本發明的範圍中提供和使用重組DNA構建體，其包含編碼含有a)中多肽之保守替換變體的多肽的核苷酸序列。不改變多核苷酸所編碼之胺基酸序列的序列改變被稱為「沉默替換」。除了分別編碼甲硫氨酸和色氨酸的密碼子ATG和TGG之外，針對同一胺基酸的任何可能密碼子均可通過本領域中可獲得的多種技術(例如定點誘變)進行替換。因此，本發明還可提供重組核酸構建體，其中核苷酸序列包含在核苷酸序列中的沉默替換。在本發明的另一些實施方案中，所述子序列或片段與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結構域具有至少65%的序列同一性，例如與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結構域至少70%—致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%一致,至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。實現基因產物水平改變的方法本發明通過降低或在某些情況下消除某些基因的表達來實施，本文中提供了如何實現的非限制性實例。上述核酸構建體或重組DNA構建體可用於鑑定較野生型而言生長特性發生改變的植物。這樣的植物可以是例如天然存在的變體或經遺傳修飾表現出改變的生長特性的植物。為此目的，本發明的核酸構建體或重組DNA構建體可用作例如常規雜交測定中的探針或用作特異性擴增核酸片段的引物。儘管本發明的主要部分是基因產物的下調如何得到所需效果，它還顯示改變本文所示基因的表達可用於改良所需特性，這是看待所述數據的另一種思路，即增加植物內的所述基因產物也是改良所需性狀的一種方式。存在不同的方法來提高基因產物的水平，這些與下調下述基因產物的方法平行描述於下文中。這些基因還可用作標記輔助育種(marker assisted breeding)的祀標，這是因為基因調控序列中的變化可引起表達模式的改變，而編碼序列中的變化可引起基因功能的改變，並且我們已知對這些基因進行操作可引起所述性狀的改變。此外，本發明的核酸構建體或重組DNA構建體可用於基因置換的目的來修飾相應的植物生長表型。可例如使用核酶來實現內源基因表達的抑制。核酶是具有高度特異性內切核糖核酸酶活性的RNA分子。核酶的製備和使用公開於美國專利No. 4，987，071和美國專利No. 5，543，508中。反義技術在下文中論述，應注意的是，包含反義RNA的合成核酶序列可用於賦予反義RNA以RNA切割活性，從而使與該反義RNA雜交的內源mRNA分子被切割，進而導致對內源基因表達的反義抑制增強。還可使用其中由相關基因同源物編碼的RNA過表達的載體來實現相應內源基因的共抑制，例如，採用Jorgensen的美國專利No. 5，231，020中所述的方法。這樣的共抑制(也稱為有義抑制)不需要將完整的序列引入植物細胞中，也不需要所引入序列與內源目的序列完全一致。然而，當雜交的特異性增加時(例如，當加長所引入序列時，和/或當所引入序列與內源轉錄因子基因之間的序列相似性增加時)抑制效率將會提高。表達不可翻譯形式之基因(例如含有一個或多個終止密碼子或無義突變的序列)的載體也可用於抑制內源轉錄因子的表達，從而降低或消除其活性並改良一種或多種性狀。用於產生所述構建體的方法參見美國專利No. 5，583，021。特別地，這樣的構建體可通過在基因中引入提前終止(premature)的終止密碼子來製備。進行靶DNA插入的一種方法是通過利用如W02006/078431中所述的逆轉錄病毒DNA整合機制來實現。該技術是基於可以通過將整合酶與DNA結合蛋白質(束縛蛋白)有效偶聯來改變逆轉錄病毒和逆轉座子整合酶整合位點特異性。對整合酶的改造優選在核酸水平上進行，通過利用PCR來修飾野生型整合酶的編碼序列。這樣，可將整合酶複合物引導至期望部分或引導其遠離基因組DNA的不期望部分，從而產生期望的整合位點特性。另一種此類技術是「祀向誘導基因組的局部損傷(Targeting InducedLocalLesions in Genomes) 」,這是一種以祀向方式改變基因功能的非轉基因方法。該方法包括用例如甲磺酸乙酯(EMS)使植物突變，然後找出其中特定所需基因已被修飾的個體。該技術可參見例如 Slade 和Knauf, Transgenic Res. 2005年4 月；14 (2) :109-15 以及Henikoff,Till 和 Comai，Plant PhysiOl. 2004 年 6 月；135(2) :630-6。消除基因表達的另一種方法是通過利用根瘤農桿菌的T-DNA插入突變來實現。在產生了插入突變體之後，可對突變體進行篩選以鑑定那些在適當基因中包含所述插入的突變體。可將在期望基因處包含單個轉基因插入事件的植物進行雜交，以生成針對該突變的純合植物。
對技術人員來說顯而易見地，還可通過使用cre-lox系統來修飾植物性狀。可將植物基因組修飾為包含第一和第二 Iox位點，然後將所述Iox位點與Cre重組酶接觸。倘若所述Iox位點的方向相同，則介於這兩個位點之間的DNA序列將會被切除。如果所述Iox位點的方向相反，則介於其中的序列會被倒置。本發明的多核苷酸和多肽還可在不存在表達盒的情況下通過以其它方式操控內源基因的活性或表達水平而表達於植物中，例如，通過利用T-DNA激活標籤來異位表達基因(Ichikawa 等(1997)Nature 390698-701 ;Kakimoto 等(1996)Science 274:982-985)。該方法需要用含有多種轉錄增強子的基因標籤轉化植物，並且一旦標籤被插入基因組中，兩側基因編碼序列的表達就被解除控制。在另一實施例中，可改進植物中的轉錄機器以便提高本發明多核苷酸的轉錄水平(參見，例如PCT公開物W096/06166和WO 98/53057，其描述了通過改變DNA結合基序中的特定胺基酸來修飾鋅指蛋白質的DNA結合特異性)。表達的反義抑制然而，包含上述核苷酸序列的重組DNA構建體尤其可用於表達的有義和反義抑制，例如，用於下調特定基因的表達，從而獲得生長提高的植物表型。也就是說，本發明的核苷酸序列或其子序列或反義序列可用於阻斷天然存在同源核酸的表達。傳統的有義和反義技術的變體是本領域已知的，例如描述於Lichtenstein和Nellen(1997), AntisenseTechnology APractical Approach IRL Press at Oxford University，Oxford，England。反義方法的目的是利用與靶基因互補的序列來阻斷其表達，以及建立其中單個選定蛋白質的水平被選擇性降低或消除的突變細胞系或生物體。

例如，為了得到以生長提高為特徵的植物表型，可通過引入對應於目的多肽之cDNA的反義構建體來實現轉基因植物中基因產物表達的降低或消除(即「敲除」)。對於反義抑制，在表達載體中以相對於啟動子序列而言相反的方向(就編碼序列而言)安排編碼基因產物或其部分的cDNA。所引入的序列不需要是全長的cDNA或基因，也不需要與待轉化植物類型中所發現之cDNA或基因完全一致。通常，反義序列只需要能夠與靶基因或目的RNA雜交即可。因此，在引入序列長度較短的情況下，為了有效的反義抑制就需要與內源轉錄因子序列具有較高程度的同源性。儘管可應用各種長度的反義序列，但優選地，在載體中引入的反義序列長度範圍是15-30個核苷酸,例如16-28個核苷酸、17-26個核苷酸或18-24個核苷酸，並且隨著反義序列長度的增加，通常可觀察到反義抑制的提高。優選地，載體中反義序列的長度應大於100個核苷酸。所述反義構建體的轉錄導致產生與轉錄自植物細胞內源基因的mRNA分子反向互補的RNA分子。有關應用於植物細胞中的基因表達反義調控的更詳細描述可參見美國專利No. 5，107，065，其內容通過引用以整體併入本文。RNA 幹擾由雙鏈RNA引起的基因沉默通常稱為RNA幹擾或RNAi。RNA幹擾是雙鏈核糖核酸(dsRNA)片段幹擾與該dsRNA共有同源序列的特定基因表達的一種分子機制。這種由與加工microRNA同樣的細胞機制介導的加工已知為RNA-誘導的沉默複合物(RISC)。該加工由核糖核酸酶蛋白Dicer起始，Dicer結合併切割外源雙鏈RNA分子以產生在各端具有少數未配對突出鹼基的20-25個鹼基對的雙鏈片段。由Dicer產生的短雙鏈片段稱為小幹擾RNA(siRNA)，它們被分開並整合入活性RISC複合物中。如果RNA轉錄物的一部分被RNAi分子或構建體靶向，則所述整個轉錄物被下調。RISC複合物的催化活性組分在動物內已知為argonaute蛋白，其為介導siRNA誘導的靶mRNA鏈切割的內切核酸酶。因為Dicer產生的片段是雙鏈的，因此它們在理論上每條均可產生有功能的siRNA ;但是,兩條鏈中只有一條(稱為「引導鏈(guide strand)」)結合argonaute蛋白並導致基因沉默。另一條反引導鏈(ant1-guide strand)或過客鏈(passengerstrand)在RISC活化過程中被降解成RISC底物。選作引導的鏈通常為5』端更穩定的鏈，但鏈的選擇不取決於RISC加入前Dicer切割dsRNA的方向。實驗室中使用的RNA幹擾常包括引起mRNA切割的鹼基完美配對的dsRNA分子。在整合入RISC中後，siRNA與其靶mRNA鹼基配對並誘導RISC組分蛋白argonaute切割mRNA，從而阻止其被用作翻譯模板。為了在體外或在體內穩定，siLNA或siRNA化合物的序列不需要與其靶核酸100%互補。siRNA化合物(以及下述的siLNA化合物)與其靶分子互補並可特異性雜交的事實僅僅意味著siRNA(或siLNA)化合物與靶分子的結合足夠強及特異，以提供對靶標正常功能的預期幹擾，而非靶mRNA的功能則不受影響。已知摻入寡聚物中的LNA單體會引起寡聚物及其可形成之雜交體的RNA樣結構。還顯示LNA殘基會指導該結構朝LNA摻入的3』端方向加入DNA殘基以及朝向5』端的較少延伸。其後果是有可能通過DNA單體修飾RNA鏈，並且如果一個或多個LNA殘基在DNA單體的兩側，它們仍會形成RNA結構。因此，DNA和LNA可替換RNA單體，除此之外，所述寡聚體仍會形成大體的RNA樣結構。DNA要比RNA便宜得多，並且更易於合成，對核酸酶也更穩定，因此這樣的修飾將提高siRNA的整體用途和適應性。生物體在其細胞攝取外源dsRNA並將其用於RNAi途徑的能力上是不同的。然而，在植物中，由RNAi引起的基因沉默可在植物中的細胞之間蔓延，因此RNA幹擾的作用在植物中是系統性的且可遺傳的。有關利用dsRNA轉錄在植物中進行RNAi基因抑制的詳細描述參見美國專利No. 6，506, 559、美國專利申請公開No. 2002/0168707 Al以及美國專利申請系列號No. 09/423，143 (參見 WO 98/53083)、系列號 No. 09/127，735 (參見 Wo 99/53050)和系列號No. 09/084, 942 (參見Wo 99/61631)，所有這些文獻均通過引用以整體併入本文。在本發明舉例說明的一些具體實施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO 18-38、48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列。載體的構建一般地，本領域技術人員完全能夠構建本發明的載體並設計適於重組基因表達的方案。有關載體製備一般方案的更多細節參見MolecularCloning a Laboratory Manual 第二版，Sambrook 等，1989, Cold SpringHarbor Laboratory Press。用於反義基因的啟動子可影響反義抑制的水平、時間選擇、組織、特異性或可誘導性。此外，反義序列可通過選擇靶基因的獨特區域或者它與其它相關基因共有同源性的區域來操縱其特異性。一般地，通過RNA幹擾抑制 基因可使用重組DNA構建體來實現，所述重組DNA構建體具有與含有所述基因之基因組DNA或cDNA片段的有義和反義元件的DNA元件有效連接的啟動子，所述片段為例如約25個核苷酸，例如至少30個、至少40個、至少50個、至少75個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個或至少750個核苷酸，或者例如至少lkb,例如至少1. 5kb、至少2kb、至少2. 5kb或例如至少3kb,其中所述有義和反義DNA組分可直接連接內含子或人工DNA片段，其可在所轉錄RNA雜交形成髮夾結構時形成環。在本發明的有關實施方案中，所述核酸構建體或重組DNA構建體還包含組成型、誘導型或組織特異性的與所述核苷酸序列有效連接的啟動子。核酸構建體或重組DNA構建體的一個實例具有驅動來自靶基因之DNA片段以及隨後的以反相重複形式出現的較短序列轉錄的啟動子，這一切引發了靶基因的RNAi應答。這樣的構建體已描述於Brummel D. A.等 Plant Journal 2003, 33,第 793-800 頁)。在另一實例中，人工microRNA的構建是用啟動子驅動模擬microRNA功能的RNA分子表達，而設定基因特異性的序列是通過重組方式引入的(參見Niu等，2006. Expression of artificial microRNAs intransgenic Arabidopsis thaliana confers virusresistance. Science 2006, 24 卷，No. 11 第 1420-1428 頁)。microRNA 可以是天然存在而過表達的。在本發明的一個具體實施方案中，核酸構建體或重組DNA構建體還包含位於轉錄盒之前的強組成型啟動子，所述轉錄盒由靶基因部分及隨後的植物功能性內含子以及再後方向相反的該靶基因部分組成，該轉錄盒後面是終止子序列。優選的載體是本發明的核苷酸序列之一以反轉重複方向插入的這種類型。在本發明目前一個優選的實施方案中，核酸構建體或重組DNA構建體包含SEQ IDNO 47白勺序列ο目前優選用於基於RNAi之方法的核酸構建體是被稱為pK7GWIWG2(I)的載體。該載體描述於Gateway vectors forAgrobacterium-mediated plants transformation,Karimi, M.等，Trends Inplant Sciences,第 7 卷第 5 期，第 193-195 頁。同一基本類型的載體較早描述於 Wesley S. V.等，Construct design for efficient, efiectiveandhigh-throughput gene silencing in plants. Plant Journal 2001,27,第 581-590頁。本領域技術人員應理解，作為基因一部分的任何序列或本文提供的相應mRNA均可用於下調所述mRNA的水平。在所提供序列不代表完整mRNA的情況下，可用本領域技術人員已知的各種技術克隆出完整的mRNA,例如Sambrook等所述的技術。對於發現與楊屬基因之mRNA轉錄物相關的更多序列尤為重要的新近資源是已公開的毛果楊的基因組以及描述於 Tuskan 等 2006 (G. A Tuskan 等，2006. The genome of BlackCottonwood, Populustricocarpa(Torr. &Gray). Science 313 卷 No. 5793,第 1596-1604 頁)中的資源。植物細胞的轉化根據本發明，所述方法包括用所述核酸構建體或重組DNA構建體轉化植物可再生細胞並從所述轉化細胞再生出轉基因植物的另外步驟。當將以上DNA構建體或載體引入植物細胞中時，必須考慮到本領域技術人員眾所周知的某些問題。如上所述，待插入的核酸應組裝於含有驅動轉錄之有效調控元件的構建體內。必須有可將構建體轉運入細胞內的方法。構建體一旦在細胞內，就會整合或不整合進內源染色體物質。可使用本領域技術人員眾所周知的轉化技術將DNA構建體和載體引入植物細胞內以產生具有改良之植物生長特性的轉基因植物，尤其是轉基因樹木。本領域技術人員將認識到，可利用多種宿主細胞作為本發明DNA構建體和載體的受者。宿主細胞的非限制性實例包括胚胎組織、Ι、Π和III型愈傷組織、下胚軸、分生組織、根組織以及在韌皮部中表達的組織的細胞。如上所列舉的，農桿菌轉化是本領域技術人員廣泛用於轉化樹木品種尤其是硬木品種(例如楊樹)的一種方法。產生穩定的、可繁育的轉基因植物目前在本領域中是常規的技術。當農桿菌轉化效率低或無效時(例如在某些裸子植物品種中)，可使用其它方法，例如微粒或顆粒轟擊、電穿孔、顯微注射、直接的DNA攝取、脂質體介導的DNA攝取或渦旋混合(vortexing)方法。或者，可採用不同技術的組合來提高轉化處理的效率，例如用農桿菌包被的微粒轟擊或者微粒轟擊引起創傷後與農桿菌共培養。應當理解，轉化技術的具體選擇應取決於其轉化某植物品種的效率以及本發明實施人員對選擇具體方法的經驗和偏好。對於技術人員來說顯而易見的是，對用於將核酸引入植物細胞的轉化體系的具體選擇不是本發明的本質問題或對本發明產生限制，對植物再生技術的選擇也是如此。轉化後，優選使用摻入轉化載體中的顯性選擇標記來選擇轉基因植物。通常，這樣的標記可使轉化植物具有抗生素或除草劑抗性，可通過將植物暴露於適當濃度的抗生素或除草劑中來實現轉化子的選擇。新型選擇標記利用D形(D-form)胺基酸並基於植物只可耐受L形胺基酸的事實，其提供了一種快速、有效並對環境有利的選擇體系。該選擇體系之所以吸引人是因為它既能選擇又能反選擇(counter-selection)。隨後，如本領域中的標準一樣，植物可從例如單個細胞、愈傷組織或葉盤再生。幾乎任何植物都可從植物的細胞、組織和器官`完全再生。可用的技術綜述於Vasil等1984，Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants, I, II 和 III 卷，LaboratoryProcedureso在選定轉化植物並培養至成熟後，鑑定出那些表現出生長提高表型的植物。此外，為了證實所述表型歸因於本文公開之多肽或多核苷酸表達水平或活性的改變，可利用Northern印跡、RT-PCR或微陣列分析mRNA表達或利用免疫印跡、Western印跡或凝膠遷移測定分析蛋白質表達來加以確定。植物品種根據本發明，所述方法生成了較其來源的野生型植物而言生長有所提高的轉基因植物。在本發明方法的一個實施方案中，轉基因植物是多年生植物，即存活超過兩年的植物。在一個具體實施方案中，所述多年生植物是木本植物，其可定義為具有高度木質化之莖(或多於一條莖)的維管植物。在一個優選的實施方案中，所述木本植物是硬木植物，即闊葉樹或被子植物，其可選自金合歡樹、桉樹、角樹、山毛櫸樹、桃花心木、胡桃、橡樹、白蠟樹、柳樹、山胡桃樹、樺樹、慄樹、楊樹、赤楊、楓樹、懸鈴木、銀杏樹、棕櫚樹和香楓。來自楊柳科的硬木植物(例如柳樹、楊樹和山楊)包括其變體是特別令人關注的，因為這兩種類型包括生長迅速的樹木品種或者為供暖提供木材和生物燃料而專門培育的木本灌木。用作生物能源的纖維質草類(例如柳枝稷和草蘆)也是令人關注的。在另一些實施方案中，所述木本植物是軟木或針葉樹，其可選自柏樹、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹、巨杉、雲杉和紫杉。
在可用的實施方案中，所述木本植物是結果植物，其可選自蘋果樹、李子樹、梨樹、香蕉樹、桔樹、獼猴桃樹、檸檬樹、櫻桃樹、葡萄樹和無花果樹。可用於本發明方法中的其它木本植物還可選自棉花、竹子和橡膠植物。DNA構律體根據本發明的另一主要方面，提供了至少包含一個上述序列的DNA構建體(例如重組DNA構建體)。具體地，所述重組DNA構建體可包含選自以下的核苷酸序列a)包含選自 SEQ ID NO : 1_17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；b) a)之核苷酸序列的互補核苷酸序列；c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段；d)與a)、b)和c)中的任一序列至少60% —致的核酸序列；以及e)在嚴格條件下與a)、b)或c)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
在本發明的一些選定實施方案中，d)中的核酸序列與a)、b)和c)中的任一序列至少65%—致,例如與a)、b)和c)中的任一序列至少70%—致,至少75%—致,至少80%一致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。在與本發明該方面相關的另一些實施方案中，所述核苷酸序列包含選自SEQ IDNO :18-38、48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列或其互補
核苷酸序列。同樣與本發明的該方面有關，顯然地，上述c)中的子序列或片段包含至少15個核苷酸，例如至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸、至少21個核苷酸、至少22個核苷酸、至少23個核苷酸、至少24個核苷酸、至少25個核苷酸，例如至少30個核苷酸、至少35個核苷酸、至少40個核苷酸、至少45個核苷酸、至少50個核苷酸、至少55個核苷酸、至少60個核苷酸、至少65個核苷酸、至少70個核苷酸、至少75個核苷酸、至少80個核苷酸、至少85個核苷酸、至少90個核苷酸、至少95個核苷酸，或者例如至少100個核苷酸。在某些實施方案中，上述c)中的子序列或片段包含至少約 150 個核酸殘基，例如至少約 200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800個核苷酸，例如至少約900個核苷酸，或者例如至少約lkb、1. lkb、1. 2kb、
1.3kb、l. 4kb、l. 5kb、l. 6kb、l. 7kb、l. 8kb、l. 9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb、2. 4kb、2. 5kb、
2.6kb、2. 7kb、2. 8kb、2. 9kb 或例如至少約 3kb。同樣，根據以上論述，所述核苷酸序列編碼含有a)多肽之保守替換變體的多肽。另外，所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換。在涉及本發明該方面的另一些實施方案中，所述子序列或片段與上述a)中核苷酸序列的保守結構域具有至少65%的序列同一性，例如與上述a)中核苷酸序列的保守結構域至少70%—致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5% —致。在一些具體的實施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO : 18-38、48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列。
在另一些實施方案中並且根據以上描述，重組DNA構建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導型或組織特異性的啟動子。特別地，所述重組DNA構建體還可包含位於轉錄盒之前的強組成型啟動子，所述轉錄盒由靶基因部分及隨後的植物功能性內含子以及再後方向相反的上述靶基因部分組成。同樣如上文所解釋地，另一類優選的重組DNA構建體包含驅動來自靶基因之DNA片段轉錄的啟動子以及隨後的以反轉重複形式存在的較短序列。在本發明目前示例的一些實施方案中，重組DNA構建體包含SEQID NO :47的序列。轉基因植物本發明的第三方面提供了包含重組多核苷酸(DNA構建體)的轉基因植物，所述重組多核苷酸包含能改變植物中在木質形成階段中特異性表達的至少一種基因的基因產物水平的核苷酸序列。與上述類似地，應當理解，在某一實施方案中所述至少一種基因的選擇滿足該基因的RNAi下調在一組3-8株轉基因植物中引起以下效果的標準當比較在18小時光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/l、K 56g/l的條件下於溫室中培育8周的所述轉基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長速率平均值(AMHGR)和最大高度生長速率最大值(MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長速率平均值(ADGR)和直徑係數最大值(MDC)中具有5%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或

d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長速率最大值(MMHGR)和/或直徑係數最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；其中最大高度生長速率定義為以4個連續的高度數據點擬合的線性函數的斜率，高度生長速率值是以逐步的方式針對數據點1-4、數據點2-5等計算得到的，而最大高度生長速率值是最後針對每株植物從生長速率值中選擇的。根據本發明該方面的另一實施方案，在木質形成階段表達的基因的選擇滿足該基因的RNAi下調在一組3-8株轉基因植物中引起以下效果的標準當比較在18小時光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/、K 56g/l的條件下於溫室中培育8周的所述轉基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長速率平均值(AMHGR)和最大高度生長速率最大值(MMHGR)中具有8%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長速率平均值(ADGR)和直徑係數最大值(MDC)中具有8%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長速率平均值(ADGR)中具有22%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長速率最大值(MMHGR)和/或直徑係數最大值(MDC)中具有22%或更大的差異；
其中最大高度生長速率定義為以4個連續的高度數據點擬合的線性函數的斜率，高度生長速率值是以逐步的方式針對數據點1-4、數據點2-5等計算得到的，而最大高度生長速率值是最後針對每株植物從生長速率值中選擇的。根據本發明的一些具體實施方案，將包含選自以下核苷酸序列的至少一種基因的基因產物水平相對於各自相應野生型植物中所發現的水平進行改變a)選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、
16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)的核苷酸序列；b)與選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)的核苷酸序列至少60%—致的核苷酸序列；c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段。根據本方面的另一實施方案，所述轉基因植物包含含有選自以下組中的核苷酸序列的重組多核苷酸(DNA構建體)d)包含選自 SEQ ID NO : 1_17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；e) d)之核苷酸序列的互補核苷酸序列；f) d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；g)與d)、e)和f)中的任一序列至少60% —致的核酸序列；以及h)在嚴格條件下 與d)、e)或f)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在本發明該方面的另一些實施方案中，C)或g)中的核酸序列與8)、13)、(1)、6)或f)中的任一序列至少65%完全相同，例如與a)、b)、d)、e)或f)中的任一序列至少70%一致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。如上所提及地，技術人員會認識到本領域中存在多種方法用於得到本發明的核酸序列和多核苷酸構建體，例如，通過克隆技術、將固相合成產生的片段加以組裝來實現。此外，技術人員應理解，可從其它物種分離出所述序列的同源物，其非限制性的實例包括金合歡樹、桉樹、角樹、山毛櫸樹、桃花心木、胡桃、橡樹、白蠟樹、山胡桃樹、樺樹、慄樹、赤楊、楓樹、懸鈴木、銀杏樹、棕櫚樹、香楓、柏樹、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹、巨杉、雲杉、紫杉、蘋果樹、李子樹、梨樹、香蕉樹、桔樹、稱猴桃樹、梓檬樹、樓桃樹、葡萄樹、無花果樹、棉花、竹子、柳枝稷(switch grass)、草蘆(red canary grass)和橡膠植物。所述序列的可用同源物還可從來自楊柳科的硬木植物中分離，例如來自柳樹、楊樹或山楊。特別地，本發明的核苷酸序列包含選自SEQ ID NO : 18_38、48、49、51_60 (例如SEQID NO :20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列或其互補核苷酸序列。此外，顯然地，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少15個核苷酸，例如至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸、至少21個核苷酸、至少22個核苷酸、至少23個核苷酸、至少24個核苷酸、至少25個核苷酸，例如至少30個核苷酸、至少35個核苷酸、至少40個核苷酸、至少45個核苷酸、至少50個核苷酸、至少55個核苷酸、至少60個核苷酸、至少65個核苷酸、至少70個核苷酸、至少75個核苷酸、至少80個核苷酸、至少85個核苷酸、至少90個核苷酸、至少95個核苷酸或例如至少100個核苷酸。在某些實施方案中，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少約150個核酸殘基，例如至少約 200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800個核苷酸，例如至少約900個核苷酸，或者例如至少約lkb、1. lkb、1. 2kb、1. 3kb、1. 4kb、
1.5kb、l. 6kb、l. 7kb、l. 8kb、l. 9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb,2. 4kb、2. 5kb、2. 6kb,2. 7kb、
2. 8kb、2. 9kb或例如至少約3kb。特別地，本發明的轉基因植物可包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含的核苷酸序列相對於所述特定序列而言含有隻改變編碼多肽中一個或數個胺基酸的保守變體，這樣的轉基因植物也可根據本發明提供和使用。因此，提供包含如下重組DNA構建體的轉基因植物是在本發明範圍內的，即該重組DNA構建體含有的核苷酸序列編碼包含a)或d)之多肽之保守替換變體的多肽。因此，本發明還可提供重組DNA構建體，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換，即，重組DNA構建體可包含不改變該多核苷酸所編碼之胺基酸序列的序列變化。在本發明的另一些實施方案中，所述子序列或片段與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結構域具有至少65%的序列同一性，例如與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結構域至少70%—致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%一致,至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。在本發明示例的具體實施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ IDNO =18-38,48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列。在另一些實施方案中，本發明所提供的轉基因植物包含重組多核苷酸構建體，所述構建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導型或組織特異性的啟動子。在又一些實施方案中，所述重組多核苷酸構建體還包含位於轉錄盒之前的強組成型啟動子，所述轉錄盒由靶基因部分及隨後的植物功能性內含子以及再後的方向相反的該靶基因部分組成。同樣如上文所解釋地，另一類優選的重組多核苷酸構建體包含驅動來自靶基因之DNA片段轉錄的啟動子以及隨後的以反轉重複形式存在的較短序列。在本發明示例的一些具體實施方案中，所述轉基因植物包含重組多核苷酸構建體，其中c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO :18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列。在本發明目前優選的一些實施方案中，本發明的轉基因植物包含含有SEQ ID NO 47之序列的重組DNA構建體。植物品種根據本發明，轉基因植物可以是多年生植物，優選木本植物或木質品種。在一個可用的實施方案中，所述木本植物是硬木植物，其可選自金合歡樹、桉樹、角樹、山毛櫸樹、桃花心木、胡桃、橡樹、白蠟樹、柳樹、山胡桃樹、樺樹、慄樹、楊樹、赤楊、楓樹、懸鈴木、銀杏樹、棕櫚樹和香楓。來自楊柳科的硬木植物(例如柳樹、楊樹和山楊)包括其變體是特別令人關注的，因為這兩種類型包括生長迅速的樹木品種或者為供暖提供木材和生物燃料而專門培育的木本灌木。在另一些實施方案中，所述木本植物是針葉樹，其可選自柏樹、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹、巨杉、雲杉和紫杉。在一些可用的實施方案中，所述木本植物是結果植物，其可選自蘋果樹、李子樹、梨樹、香蕉樹、桔樹、獼猴桃樹、檸檬樹、櫻桃樹、葡萄樹和無花果樹。 可用於本發明方法中的其它木本植物還可選自棉花、竹子和橡膠植物。本發明延伸至通過本文所述方法獲得的以上轉基因植物的任何植物細胞，以及所有的植物部分，包括植物的可收穫部分、種子及其繁殖體以及植物外植體或植物組織。本發明還涵蓋包含本發明DNA構建體的植物及其部分、植物細胞或植物後代。本發明進一步延伸至涵蓋經由上述任何方法產生的原代轉化或轉染細胞、組織、器官或完整植物的後代，唯一的要求是該後代需表現出與經由本發明方法產生的親本一樣的基因型和/或表型特徵。應當注意的是，在本發明各方面之一中所述的實施方案和特徵也適用於本發明的其它方面。本申請中引用的所有專利和非專利文獻均通過引用以整體併入本文。現在將在以下非限制性的實施例中對本發明進行更詳細地描述。
實施例實施例1鑑定參與木質形成和木材生長的可用基因1.1 介紹為了發現和闡明參與木質形成和木質生長之基因的功能，實施了廣泛的基因發掘計劃(gene mining program),由此鑑定了在木材工業應用中可用的基因。1. 2.材料和方法1.2.1基因選擇為了縮小待檢測功能之基因的範圍，該基因發掘方案的第一步是從一個大的基因集合中選擇某些基因。該基因選擇方法是基於如Hertzberg等(2001)和Schrader等(2004)中所述的基因表達模式。在Hertzberg等(2001)中描述了對發育中的楊樹次生木質部的研究。楊樹的次生木質部是高度組織化的，在不同發育階段具有易識別的且獨特的邊界。木質形成開始於維管形成層。形成層衍生物通過分裂、擴大、次生壁形成、木質化和最終的程序性細胞死亡過程發育成木質部細胞。利用樹木維管分生組織的大尺寸通過切向冷凍切片獲取來自確定發育階段的樣品。為了測定歐洲山楊X美洲山楊(雜交山楊)中個體發育的木質形成期間特定階段的穩定狀態mRNA水平，採集貫穿木質發育區的30 μ m厚切片的樣品，並隨後用由來自雜交山楊的2995個獨特EST組成的點樣cDNA微陣列對樣品進行分析(Hertzberg等，2001)。隨後還將這些樣品如Schrader等(2004)中所述與已點樣的微陣列再次雜交。從這些實驗中，在木質形成不同階段具有明顯的特異性表達的基因被挑選出來(參見圖1)。這是基於基因通常在其表達部位發揮其功能的推測。因此，在不同的木質形成階段(例如細胞分裂、細胞擴大和形成層區域中細胞定型)特異性表達的基因以及在在次生細胞壁形成期間表達在成熟區域內的基因(其定義參見Wilson等，1966)比任何隨機選擇的基因更有可能對於木質形成過程具有重要性。與其它植物分生組織類似，維管形成層(圖1，區域A)的主要功能是細胞分裂和起始分化。主要表達於分生組織和早期細胞擴大區域(圖1，區域B)中的序列代表了參與細胞周期、細胞擴大、纖維尖端生長和初生細胞壁生物合成的候選基因。區域A和B還預期表達調控細胞命運和細胞身份的基因。細胞擴大發生於分生組織(區域A)中以及區域B和C中。因此，跨越區域A、B和C(圖1)表達的基因可能在細胞擴大中發揮作用。細胞擴大一完成，次生細胞壁就沉積於所有木質部細胞內(區域D)。參與次生細胞壁生物合成的絕大多數基因預測存在於區域C (維管在此處起始其次生細胞壁)、D和E(圖1)中。在區域E(圖1)中顯著上調的基因包括貫穿細胞壁形成凹陷(pit)和孔(pore)的最後階段所需的許多壁降解酶，或者與纖維成熟的晚期階段(例如木質化和程序性細胞死亡)相關的基因。表達於此區域內的基因還包括參與射線細胞(ray cell)中新陳代謝和轉運的基因，所述射線細胞(與纖維相反)保持存活並維持其代謝活性。選擇在木質部發育不同階段表達的大量不同基因用於通過在轉基因楊樹植物中的RNAi下調進行功能基因組分析。圖2顯示了選定並測試其功能之基因的表達模式的實例。除了這種選擇之外，還基於Schrader等(2004)中所述的分生組織陣列基因表達實驗來選擇基因。在該實驗中只有形成層區域被採樣。但是，樣品更薄，導致了形成層分生組織的更高解析度，即一個切片相當於形成層區域的約三層細胞，這樣，為獲得表達圖譜提供了接近細胞特異性的解析度。從該實驗中，選擇在形成層區域內具有峰值或者在形成層分生組織的表達中有急劇變化的基因(Schrader等2004)用於通過在轉基因楊樹植物中的RNAi下調進行功能基因組分析。在基於表達模式進行選擇後，基於基因注釋對基因進行篩選，並排除了具有顯然不感興趣之基因注釋的基因(例如核糖體蛋白基因)。為了降低成本和更快地找到感興趣的基因，在直接針對生長和木質特性的功能基因組方案中仔細挑選待進行功能測試的基因是非常有益的。儘管選擇用於功能分析的基因是以經濟有效的方式發現具有對林木生物技術而言值得關注之功能的基因的一個重要部分，但事實上檢測選定基因的基因功能對於發現其在工業應用中的用 途而言是關鍵的步驟。例如在本文中進行的基因選擇僅僅對於為了使定向針對某些特性/功能之功能性基因組方案(例如，用突變體或轉基因植物/生物進行大規模基因測試)的陽性結果最大化具有重要性。基因選擇的結果是184種可能的基因，最終對其中150種進行了功能分析，其中的17種基因由於其參與以及可用於改變和/或修飾與生長和改良的木質化學性質有關的樹木表型而被進一步選擇。來自184種選定基因的表達模式的實例如圖2和圖3所示。1. 2. 2選定基因的克隆隨後利用Gateway技術(Invitrogen USA)將選定的基因克隆進受CaMV 35S啟動子控制的RNAi載體(RNA幹擾載體，pK7GWIWG2(I))中。使用了兩套主要的克隆引物，一套是與載體和poly-Α尾配對結合的通用引物，另一套是基因特異性引物。首先將PCR產物轉移入pDONR載體(Invitrogen USA)中，隨後根據製造商的說明(Invitrogen USA)轉移入目的載體PK7GWIWG2 (I)中。選定基因的序列、其基因庫登錄編號和PCR引物等列於表1.1中。表1.1基因庫登錄編號、序列和PCR引物等表1.1a
權利要求
1.通過產生與其野生型相比生長有所提高之轉基因植物的方法而產生的轉基因植物產生的木材，其中所述方法包括改變植物中來自SEQ IDNO 15的核苷酸序列所編碼之基因產物的水平，其中所述轉基因植物是木本植物。
2.包含選自以下序列中至少一種序列的DNA構建體 a)來自SEQID NO 15的核苷酸序列；或 b)子序列SEQ ID NO :36 ;或 c)a)或b)之核苷酸序列的互補核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及利用生物信息學工具、來自EST測序和DNA陣列的數據從鑑定得到的大批候選基因中選擇具有可商用表型之基因的一種新的應用廣泛的分析平臺。本發明的一方面提供了與其野生型相比生長有所提高的轉基因植物的生成方法。該方法包括改變植物中在木質形成不同階段特異性表達的至少一種基因的基因產物水平。本發明另一些方面提供了包含本發明重組多核苷酸的轉基因植物的植物細胞或植物後代。其它一些方面涉及包含本發明核苷酸序列的DNA構建體以及包含所述DNA構建體的植物細胞或植物後代。
文檔編號A01H5/00GK103031330SQ20121050647
公開日2013年4月10日 申請日期2007年12月4日 優先權日2006年12月8日
發明者芒努斯·赫茨貝裡, 戈蘭·桑德貝裡, 亞爾莫·施拉德爾, 大衛·瑟德斯特倫 申請人:瑞典樹木科技公司