用於為高效液相色譜生成微流量和納流量流動相梯度的設備的製作方法

2023-09-12 07:02:10

專利名稱：用於為高效液相色譜生成微流量和納流量流動相梯度的設備的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於為高效液相色譜生成微流量和納流量(micro-and nanoflow)流動相梯度的設備。
背景技術：
近年來，高效液相色譜(HPLC)系統尤其是所使用的流動相流量逐漸趨於小型化。這是因為流量減少尤其能夠限制昂貴的有毒溶劑的消耗；其還能夠減少注射體積，從而能 夠處理非常少的樣品量。另外，如果使用濃度敏感型傳感器，那麼，因為溶劑在柱中稀釋更 少且信噪比更好，所以靈敏度提高。最後，新型的液相色譜-質譜(LC-MS)聯用技術能夠在小於1 μ L/min的流量下工 作，從而獲得更高的靈敏度並限制可能的汙染風險。然而，當在非常低的流量下工作時碰到的問題之一在於缺少能夠在僅具有小的延 遲和溶劑的均勻混合的情況下生成可靠的流動相梯度的儀器。在小於ι μ L/min的流量下 生成梯度必然需要適當的泵送系統，該泵送系統不僅能夠仔細且均勻地混合流動相，而且 能夠以可再現的方式且在最小延遲下將它們輸送到柱中。然而，在這些條件下，可商購得到 的儀器被迫在其極限下工作，因此，性能可靠性通常是有問題的。此外，與設定相比，有效的 梯度曲線呈現出令人不滿意的圖形。生成微流量和納流量流動相梯度的最普遍的方法之一是使用插在HPLC泵和注射 器之間的分流器的分流技術。該方案受限於難以控制實際上輸送到柱中的梯度，因而再現 性差。實現納米級梯度的最初嘗試之一是將特定梯度儲存在毛細管中，然後用注射泵將其 輸送到柱中。該系統的缺陷在於實用性差、要形成的梯度的選擇有限且難以控制梯度的形 狀。另一已知系統(被稱為指數稀釋法)包括使容納在混合室中的流動相流體從弱洗 脫液快速變為強洗脫液，從而生成凹指數曲線的梯度。該系統的缺點是限制了能夠生成的梯度類型的數目。為了克服該缺點，已經提出用弱洗脫液來填充混合室，並使強洗脫液以程序化的 方式流到動態混合器中，從而能夠控制梯度隨時間的變化。該系統的缺點是可實現的梯度曲線的多樣性差。另一已知系統包括通過以下步驟生成指數納流梯度向兩個連續的混合室首先引 入弱洗脫液然後引入強洗脫液；然後每次使用一個泵將它們輸送到柱中。該已知方案的缺點除了包括一貫的梯度延遲以外，還包括梯度和曲線選擇有限。US 7，135，111描述了一種納流量梯度洗脫設備。該設備包括用於混合不同的溶劑 並輸送它們的第一泵、用於輸送轉移溶液的第二泵、注射器、柱和檢測系統。通過修改內部 系統連接並因此修改流向，兩個彎曲部分能夠暫時儲存不同的溶劑混合物，這些溶劑混合 物由第一微流量泵轉移，然後由第二泵輸送到納流量柱中。
該已知方案的難點在於當以納升/分鐘工作時難以以恆定流量輸送流動相。US 7，141，161描述了一種梯度泵布置，其能夠以特定的時間間隔並以量級為納升/分鐘的恆定流量將洗脫液連續地轉移到色譜中，同時改變兩種或更多種洗脫液的組成。該 梯度泵布置包括十埠多位閥、連接到恆流泵(isocratic pump)的第一彎曲部分和第二彎 曲部分，通過該第一彎曲部分和第二彎曲部分轉移洗脫液。該已知方案的缺點在於泵和閥系統相當複雜，從而使得特別難於使儀器自動化。

發明內容
本發明的目的是通過提供用於為高效液相色譜生成微流量和納流量流動相梯度 的新型布置來消除上述缺點，如在權利要求1中所描述的。


在下文中參照附圖進一步闡述本發明的兩個優選實施方案，其中圖1是本發明的設備的第一實施方案的示意圖，該設備具有連接到分流器設備的 兩個常規的HPLC泵；圖2示出了預定濃度的四種組分的混合物的色譜分離的五個副本；圖3示出了無級修整後的梯度(st印less trimmed gradient)的曲線； 圖4示出了在特定色譜條件下CH3CN在H2O中從0%到100%的三條不同的梯度曲 線.
一入 ，圖5示出了圖4的三條曲線的期望的理論圖形；圖6是本發明的設備的第二實施方案的示意圖，該設備具有用於微流量和納流量 的兩個HPLC注射泵。
具體實施方案參照圖1，本發明的設備的第一實施方案旨在生成微梯度和納梯度。該設備包括兩種溶劑A和B的兩個瓶2、4 ；這兩個瓶經由兩個傳統的往復式HPLC 泵6、8連接到混合器10，混合器10連接到具有0. 5 μ m的孔的燒結過濾器12。該過濾器經 由總體上由18指出的分流器迴路連接到多位閥16的進口。該分流器迴路包括閥14和兩個相同的PEEKsil毛細管(25 μ m或50 μ m內徑)， 這兩個毛細管經由死容積小的迴路連接到所述閥，並且還連接到排放器22。分流器迴路18 通過由本發明的設備提供的色譜柱26和兩個毛細管20、20』提供的阻力，能夠從由HPLC泵 6、8生成的高流量獲得期望的流量。多位閥16具有常規的類型，例如位於德州休斯頓的Valco儀器公司的EMTCST6UW 型，並配有十四個埠，其中的兩個埠形成進口和出口，而其它十二個表示用於六個彎曲 部分24 (其由內徑為250 μ m的PEEK管路形成)的連接點，以儲存流動相。頭五個彎曲部分24廠245具有50 μ L的相等容積，而第六個彎曲部分具有150 μ L 的容積。第六個彎曲部分含有最終的梯度組成，其更大的容積對於完成色譜分析並清洗柱 26而言是有用的。多位閥16的出口連接到兩位閥28的進口，兩位閥28的一個出口連接到排放器30，另一個出口連接到微流量和納流量計32，微流量和納流量計32連接到色譜柱26的注射 器34，檢測器36與色譜柱26相連。每個設備組件的操作，特別是兩個兩位閥14和28以及多位閥16的操作，由控制 系統38協調，從而提供設備的有組織的自動操作。在操作中，第一預定的操作包括裝載與多位閥16相連的六個彎曲部分24」為了 實現該裝載，兩個兩位閥14和28被設定成閥14繞開分流器設備16且閥28連接到多位閥 16的至排放器30的那個出口。在該配置中，泵6和8能夠提供約0. 8-1. OmL/min的高流量以加速該程序。控制 系統啟動與多位閥16的執行時間的程序相關的用於泵6和8的控制程序，從而在六個彎曲 部分24i內分配不同的流動相組成，以提高洗脫能力。
例如，為了生成從容納在瓶2中的100%的溶劑A到容納在瓶4中的100%的溶 劑B的梯度，選擇第一彎曲部分24」同時使泵6設計為單獨泵送100 %的溶劑A ；流量為 0. 8-1. OmL/min，填充該彎曲部分的時間理論上僅是幾秒鐘，但實際上，建議等待幾分鐘以 進行調理。因此，在幾分鐘之後，彎曲部分21完全裝載有其相應的流動相組成，並且控制 系統啟動多位閥16，從而將第二彎曲部分242連接到閥14 ；同時，改變泵6和8的操作，以 使泵6泵送80 %的溶劑A並使泵8泵送20 %的溶劑B。再經過幾分鐘之後，選擇第三彎曲部分243，並進一步改變泵，例如泵送60 %的溶 劑A和40%的溶劑B。然後，重複該過程，直到選擇了第六彎曲部分246，使泵8設計成單獨輸送100%的 溶劑B。在完成彎曲部分24i的裝載之後，在100%的溶劑A通路的情況下再次選擇第一彎 曲部分21 ；然後減小流量，並轉換那兩個兩位閥14和28以插入分流器迴路，並將多位閥16 連接到分析迴路。系統對來自納流量計32的數據進行處理，並調節泵6的流量以在柱26 中獲得期望的流量。在該配置中，源自分流器迴路16的溶劑A的微流或納流利用較弱的洗脫液(通常 為水)；連續地再次裝填第一彎曲部分241;以調理柱26。在引入樣品並開始色譜分析之後，啟動多位閥16以將裝載有洗脫能力更強的流 動相組成的下一個彎曲部分242的內容物輸送到柱26中。對於所有的彎曲部分，順序地重 復該過程。通過改變執行和停留時間來獲得將要生成的梯度的圖形。溶劑A，其在無改變的 情況下用來推動每個彎曲部分的內容物直至分析停止，能夠輸送恆定的流動相流量。安裝本發明的設備不需要修改常規的色譜。這個方面尤其重要，因為它能夠使任 何可商購得到的常規HPL色譜以微流量和納流量有效地工作。由於所使用的流量小、彎曲部分24i的直徑小和以毛細管連接，所以沒有湍動現象 或混合發生；因此，一旦完全填充之後，六個彎曲部分24i能夠根據流量提供足以用於不同 分析的洗脫液。根據所使用的梯度的類型和流量，控制系統在每次分析過程中將每個彎曲部分 24,所使用的溶劑的量儲存在其儲存器中，這意味著在彎曲部分24i已經完全排空相應的 流動相組成之前，並因此在它們不能生成準確的梯度之前，自動開始新的裝載程序。為了評價本發明的設備的特性和性能，通過執行濃度各自為5mg/L的四種化合物滅草隆、枯莠隆、利谷隆和乙基谷硫磷的混合物的五次分析來檢驗一天內的重複性。利用填充有3. 5 μ m顆粒的相C 18的Agilent Zorbax 150_X 75 μ m柱在以下條 件下獲得分離在16分鐘內使用在H2O中CH3CN為從0%到100%的線性梯度；注射體積為 50nL ；並利用UV在λ = 230nm下進行檢測。圖2示出了五次分析的保留時間的高度重複性，相對標準偏差小於0. 19%。表1示出了與圖2的色譜有關的保留時間，以便更詳細地評價一天內的重複性。表 1
化合物 注射1 I注射2 I注射3 I注射4 I注射5 I XI-SDRSD (%)
滅草隆 19. 497 ~19. 473 ~19. 553 ~19. 457 ~19. 507 ~19. 4974 0. 03678 0. 18864
枯莠隆 21.847 21.780 21.833 21.847 21.830 21.8274 0.027628 0. 12657
利谷隆 22.877 22. 780 22. 847 22.837 22. 843 22. 8368 0.035302 0. 15458
~乙基谷 24.657 24. 557 24. 640 24.630 24.640 24. 6248 0.039124 0. 15888 硫磷還為了評價一天內的重複性，在5個連續工作日內每天執行10次色譜分離。所分 析的化合物為滅多威、滅草隆、枯莠隆、利谷隆，濃度各自為197mg/L。所使用的梯度為在 16分鐘內100%!120至100%0130叱流量為36011171^11;柱為六8116壯 Zorbax C18 3. 5 μ m, 150mmX75 μ m ；注射體積為60nL ；在λ = 230nm下進行UV檢測。下表2示出了在每個工作日內每種化合物的保留時間的平均值和與每日的平均 值有關的標準偏差。對於每種化合物，能夠觀測到優異的各天間的重複性。表 2
化合物 i Γ^ Γ^ Γ^ Γ^RSD %
第1天 第2天 第3天 第4天 第5天
滅多威10. 5910. 5510.6810. 8110. 441. 31
滅草隆14. 8714.8614. 7114. 6914. 880. 63
枯莠隆17. 2117. 1316.9816. 9417. 100. 65
利谷隆19. 1519.0418. 8918. 9118.990. 55為了獲得流動相組成隨時間的恆定變化，通常建議使用無階梯的梯度。在這方面， 突然的流動相變化、典型的階梯狀圖形對應於快速的極性改變，就解析度和再現性而言，快 速極性改變會不期望地幹擾色譜分離。利用納流，容納在連續彎曲部分中的不同流動相交替以在多位閥16以及連接物的空間內混合在一起，以避免溶劑組成突然改變。圖3示出了無級修整後的梯度。圖4示出了使用不同的閥操作程序在400nL/min的流量下獲得的三個12分鐘梯度的曲線。用以下溶劑組合物來填充彎曲部分24 彎曲部分21 100% H2O-O% CH3CN ；彎 曲部分 242 80% H20-20 % CH3CN ；彎曲部分 243 :60% H20-40 % CH3CN ；彎曲部分 244 : 40% H20-60% CH3CN ；彎曲部分 245 20% H20-80% CH3CN ；彎曲部分 246 0% H2O-IOO% CH3CN0操作程序如下對於代表凹梯度的曲線a，彎曲部分242為0. 30分鐘，彎曲部分243 為1分鐘，彎曲部分244為1. 30分鐘，彎曲部分245為9. 00分鐘；對於代表線性梯度的曲線 b，彎曲部分242為3分鐘，彎曲部分243為3分鐘，彎曲部分244為3分鐘，彎曲部分245為 3分鐘；對於代表凸梯度的曲線c，彎曲部分242為9. 00分鐘，彎曲部分243為1. 30分鐘，彎 曲部分244為1分鐘，彎曲部分245為0. 30分鐘。在圖5中示出了期望的理論圖形。與吸光度有關的跡線很好地區分開，如由所選 的執行時間所示出的。考慮到極其小的操作流量，這是尤其重要的。在不同的條件下期望的梯度圖形和實際的梯度圖形之間的高度一致性使得能夠 經由執行時間的列表並通過更加直觀的圖示方法來設定梯度的形狀。在這方面，控制系統 能夠在計算機屏幕上顯示作為執行時間的函數的梯度曲線設定時間的每一變化立即被反 映為所顯示的曲線的相應變化。以相同的方式，通過利用計算機指針拖曳曲線圖獲得的每一梯度曲線的改變確定 了表中列出的執行時間的相應改變。因此，通過建立表中列出的時間參數或圖示曲線能夠 容易地使每個梯度形狀被程序化。當需要線性梯度時，可以使用指令「線性梯度」，該指令根據為該梯度選擇的持續 時間，自動計算執行時間並顯示該梯度曲線。在圖6所示的實施方案中，本發明的設備與圖1中示出的設備的不同之處在於用 微流量和納流量注射泵40和42代替往復泵6和8。這能夠在不使用分流器迴路18的情況 下獲得納流。至於其它的，設備是相似的，其中，同樣的組件採用相同的附圖標記。從上述顯而易見，本發明的設備是非常有利的，因為它能夠自動生成微流量和納 流量，根據分析需要在梯度圖形的選擇上具有高靈活性，並且總是具有非常高的精度和再 現性。
權利要求
用於為高效液相色譜生成微流量和納流量流動相梯度的設備，其特徵在於包括生成器(2、4、6、8、40、42、10)，其用於生成不同的百分比組成的至少兩種流動相的微流量和納流量，n位梯度分配器(16)，其具有進口埠、出口埠和(n-2)/2對埠，所述(n-2)/2對埠用於相同數量的毛細管彎曲部分(24i)，每個毛細管彎曲部分選擇性地可在一端連接到所述進口埠，並在其另一端連接到所述出口埠，流動變向裝置(28)，其進口連接到所述n位梯度分配器(16)的出口，其一個出口連接到排放器(30)且另一出口連接到微流量和納流量計(32)，所述微流量和納流量計(32)自身連接到分析迴路(26、36)，控制系統(38)，其配有以下裝置用於命令所述微流量和納流量生成器(2、4、6、8、40、42、10)產生不同的流動相混合物組成的裝置、用於對所述梯度分配器(16)的執行和停留時間起作用的梯度生成裝置、用於根據從所述微流量和納流量計(32)接收的數據來控制所述微流量和納流量生成器的吞吐量的裝置以及用於控制所述流動變向裝置(28)的位置的裝置。
2.權利要求1的設備，其特徵在於所述微流量和納流量生成器包括容納不同溶劑 的至少兩個瓶(2、4)、與每個瓶相連的往復泵(6、8)、用於由所述泵產生的流體的混合器 (10)，和分流器迴路(18)。
3.權利要求2的設備，其特徵在於所述分流器迴路(18)包括由所述控制單元(38)控 制的閥(14)，從而在連接到所述分流器迴路(18)的位置和繞開所述分流器迴路(18)的位 置之間切換。
4.權利要求3的設備，其特徵在於所述分流器迴路包括連接到所述閥(14)並連接到 排放器(22)的至少一個毛細管(20、20，)。
5.權利要求1的設備，其特徵在於所述微流量和納流量生成器包括容納不同溶劑的 至少兩個瓶(2、4)、與每個瓶相連的注射泵(40、42)以及用於由所述注射泵生成的微流量 流體和納流量流體的混合器。
6.權利要求2或5的設備，其特徵在於過濾器(12)介於所述混合器(10)和所述梯 度分配器(16)之間。
7.權利要求6的設備，其特徵在於所述過濾器(12)由具有量級為0.5 μ m的孔的燒 結鋼製成。
8.權利要求1的設備，其特徵在於所述梯度分配器(16)的n-1個彎曲部分(24i-245) 具有相同的容積，而第η彎曲部分(246)具有更大的容積。
9.權利要求8的設備，其特徵在於所述梯度分配器(16)的n-1個彎曲部分(24i-245) 具有量級為50yL的容積，而第η彎曲部分(246)具有量級為150yL的容積。
10.權利要求1的設備，其特徵在於所述梯度分配器(16)由η位閥構成。
全文摘要
一種用於為高效液相色譜生成微流量和納流量流動相梯度的設備，其特徵在於包括生成器(2、4、6、8、40、42、10)，其用於生成不同的百分比組成的至少兩種流動相的微流和納流；n位梯度分配器(16)，其具有進口埠、出口埠和(n-2)/2對埠，所述(n-2)/2對埠用於相同數量的毛細管彎曲部分(24i)，每個毛細管彎曲部分選擇性地可在一端連接到所述進口埠，並在其另一端連接到所述出口埠；流動變向裝置(28)，其進口連接到所述n位梯度分配器(16)的出口，其一個出口連接到排放器(30)且另一出口連接到微流和納流儀(32)，所述微流和納流儀(32)自身連接到分析迴路(26、36)；控制系統(38)，其配有以下裝置用於命令所述微流和納流生成器(2、4、6、8、40、42、10)產生不同的流動相混合物組成的裝置、對所述梯度分配器(16)的執行和停留時間起作用的梯度生成裝置、用於根據從所述微流和納流儀(32)接收的數據來控制所述微流和納流生成器的吞吐量的裝置以及用於控制所述流動變向裝置(28)的位置的裝置。
文檔編號G01N30/34GK101809440SQ200880108444
公開日2010年8月18日 申請日期2008年9月8日 優先權日2007年10月16日
發明者A·卡皮羅 申請人:戴尼儀器股份公司