含有牛膝或榆白皮提取物的口腔用組合物的製作方法
2023-09-12 13:18:10 2
>牙膏組合物實施例(cpm/106cell)比較例(cpm/106cell)I-1I-2I-3I-4I-5I-6I-7I-8I-9I-10I-11I-12I-13I-14I-15I-16I-17I-18266035402320452026504940265052402420525021205250210052603540453049505230265026402650264026302630261025402590262026102660264026502640253026202630為了研究對人的纖維牙細胞膠原合成的功能和效果，按以上用本發明牙膏組合物處理包含14C-脯氨酸的細胞培養液的結果，含有榆白皮提取物的1-2、4、6、8、10和12中促進膠原合成效果，隨著榆白皮濃度的增加而呈現上升趨勢，反之，含有牛膝提取物的實施例1-3、5、7、9和11中，沒有促進膠原合成效果。含有牛膝提取物和榆白皮提取物兩種的實施例1-13、14、15、16、17和18中，促進膠原合成效果，隨著榆白皮提取物的濃度呈現出上升趨勢。實施例1-6對本發明牙膏(實施例1-1～1-18)的功能和效果的臨床實驗用本發明的牙膏對牙周病治療臨床實驗的實施結果如下。將牙列整齊沒有損缺牙齒的牙周疾病患者作為實驗對象，年齡從30歲到50歲，以10歲為一年齡段，按性別，每30名實施精密口腔檢查診斷，共選擇120名實驗對象，每60名一組分開，按如下方法，對實驗組牙膏(實施例1-1～1-18)和比較組牙膏(比較例1-1～1-18)的牙周疾病患者治療效果的臨床實驗。首先，按如下方法進行本發明牙膏的臨床實驗。將實驗對象組分成實驗組和比較組後，教授口腔保健教育和正確刷牙方法後，對整個實驗對象組供給同樣的對照牙刷實施牙面細磨，將初期牙齦炎指數點數化，供給實驗組牙膏和比較組牙膏使用1周、1個月、3個月、6個月後，實施口腔檢查診斷，檢查齒齦炎指數，齒齦炎指數的測定方法，將牙周膜試驗片(Periodentalprove)插入齒齦列口內，在加力的狀態下，連續針刺各牙齒周圍，測定30秒後的出血狀態，按如下方法記錄點數，獲得結果。測定結果示於下述表17。表17從上述實驗結果，可知，含有抑制誘發牙周疾病的1L-1和白細胞介素生成和過氧化物，可抑制分解牙周組織的膠原酶活性的牛膝提取物，和或促進膠原合成，可抑制膠原酶活性的榆白皮提取物的本發明牙膏(實施例1-1～1-12)的牙周疾病治療效果，從1周到6個月，比不含有牛膝提取物或榆白皮提取物的比較例(1～18)顯示出優良的功能，比較例齒齦炎指數，從1個月以後，隨著時間的延長，不斷地上升，反之，使用本發明開發研製的牙膏時，抑制牙周疾病發生的牙齦炎指數，隨著時間的延長，顯示出顯著減少的趨勢。含有牛膝提取物和榆白皮提取物兩種的實施例1-13、14、15、16、17和18，對牙周疾病抑制顯示出上升的效果。實施例2-1～2-18和比較例2-1～2-18按下述表18～26中記載的成分配比，以通常軟膏劑製造方法。將各成分溶解在緩衝液中，並形成凝膠，根據本發明製造軟膏劑組合物(實施例2-1～2-18)和比較組合物(比較例2-1～2-18)。表18表19表20表21表22表23表24表25表26實驗例2-1本發明軟膏劑抑制過氧化物生成效果按如下方法測定本發明軟膏劑組合物對誘發牙周病物質過氧化物生成的抑制效果。使用檸檬酸作抗凝劑，從全身無疾患健康成人採集靜脈血液，以1200轉/分分離離心10分鐘後，一次性地回收中層的白細胞濃縮液，一次性地用RPMI1640培養基以1∶1的比例稀釋。在50ml的離心管中加入12mlFicollPaque後，小心添加30ml稀釋的血液，使之成為中層，以1600轉/分(rpm)離心分離30分鐘。除去含有血清的上層，用滅過菌的吸管將含有單核細胞的中層小心取出裝入新的離心分離管中，添加3倍量的RPMI1640培養基，以800rpm離心分離10分鐘。棄去上清液，再添加10mlRPMI1640培養液，緩慢進行移液後，以800rpm離心分離10分鐘，棄去上清液，添加HBSS(hanks』balancedSaltSolution)緩衝液，進行移液後，將人的單核白細胞，以106細胞/well，向24-well板上分別注入0.45ml，在95％的空氣、5％的CO2、100％溼度條件下，無菌培養2小時後，用FMLP(N-Formyl-Met-Leu-Phe)0.05ml(10-6M)進行處理，在37℃下培養15分鐘，刺激細胞。再分別添加0.1ml(80μM)細胞色素(Cytochrome)C、0.1ml(30μM)過氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)、和0.1ml用HBSS稀釋3倍的實施例和比較例的軟膏組合物後，添加HBSS使總反應液達到0.9ml，37℃下保溫10分鐘，再添加0.1ml作為刺激物質的食菌化的ZymosanA，使最終濃度為1.3mg/ml。一邊振蕩反應混合物，一邊在87℃下保溫90分鐘後，在4℃冷庫內放10分鐘，將反應停止後，在4℃下，以1500rpm離心分離10分鐘。以550nm測定上清液的吸光度，按下式計算出過氧化物陰離子的生成量。O-2=-O.D.21.0103(nmoles/106cell.min)]]>ΔO.D.＝(B-D)-(A-C)＝(B+C)-(D+A)表27從上述表27中記載的結果可知，含有0.001％以上牛膝的實施例2-1、5、7、9和11中，過氧化物生成抑制效果，隨著牛膝濃度的增加呈現出上升趨勢，反之，含有榆白皮的實施例2-、2、4、6、8、10和12中，卻沒有顯示出過氧化物生成抑制效果。含有牛膝和榆白皮兩種的實施例2-13、14、15、16、17和18，對過氧化物生成的抑制效果，隨著牛膝濃度呈上升趨勢。實驗例2-2本發明軟膏劑對膠原酶活性的抑制效果按如下方法實驗本發明軟膏劑組合物對牙周組織分解酶膠原酶的抑制效果。本實驗方法是模擬人體口腔環境的實驗方法。從牙周疾病進行過程中，牙周疾病病原菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)和分葉核白細胞(Polymorphonuclearleukocytes)和中性白細胞(Neutrophil)分泌的牙周疾病患者的唾液和齒齦列口液中所含的膠原酶作用，分解牙周組織基質膠原，而引起牙床退縮。在25個1.5mlEppendorf管內，分別添加100μ12％的紅色膠原基質Azocoll溶液，一個Eppendorf管用作空白，三個管中分別加入10、100、200ppm的從Sigma社購買的I型膠原酶標準酶溶液(膠原分解活性315units/mg)。其餘的管中分別添加100μl利用SephacrylS-200色譜柱由牙周疾病患者的唾液和齒齦裂口液中分離出的膠原酶，其中的一個管作為對照樣品使用，其餘的管中用微細管添加10μl，將本發明的實驗組軟膏(實施例2-1～2-18)和比較組軟膏(比較例2-1～2-18)與蒸餾水以1∶2的比例混合完全均質化5000g離心分離10分鐘的上清液，再添加緩衝溶液(0.05MTris-Hcl，InMCaCl2，7.8)使總反應液為500μl。將各Eppendorf管裝入37℃恆溫器內反應18小時後，以10000g進行分離5分鐘，沉澱出沒有分解的膠原，取含有分解的膠原的上清液。在540nm下測定吸光度，由添加了標準酶溶液的管獲得的結果作成標準活性曲線，再從標準曲線中換算出其餘管中的酶活性濃度，將實驗組和對照組的酶活性進行比較評價。測定結果示於表28。表28從上述表28中記載的結果可知，含有0.001％以上牛膝的實施例2、1、5、7、9和11中，對膠原酶活性的抑制效果，隨著牛膝濃度的增加呈現上升趨勢，含有榆白皮提取物的實施例2-2、4、6、8、10和12中，對膠原酶活性的抑制效果，隨著榆白皮濃度的增加顯示上升趨勢，牛膝提取物和榆白皮提取物兩種對膠原酶活性的抑制效果非常好，含有牛膝提取物和榆白皮提取物兩種的實施例2-13、14、15、16、17和18中，顯示出上升效果。實施例2-3本發明的軟膏劑對單核白細胞的白細胞介素(1L-1β)生成的抑制效果按如下方法測定用本發明的軟膏劑組合物對牙周疾病誘發物質白細胞介素(1L-1β)生成的抑制效果。將0.8ml從血液中分離的血液單核白細胞加入到24-孔板中，分注成106細胞/孔的濃度，將添加了200μlRPMI1640培養基的孔作對照組、將添加了100μl大腸桿菌(E.coli)LPS(250ppm)的孔和添加了100μlLPS(250ppm)和100μl用RPMI1640培養基稀釋3倍的軟膏劑的孔作實驗組，培養24小時後，分別添加50μl花生四烯酸，再培養30分鐘。在付著了1L-1β抗體的96-Well板的孔中，添加50μl1L-1β標準溶液(0、10、24、25、6、64、160、400pg/孔後，在實驗組孔(well)上添加50μl的上述細胞培養液，在所有的孔中分別添加50μl生物素(Biotinyl)化的抗體試劑後，25℃下保持30分鐘後，用洗滌緩衝液(含有0.05(重量)％(TWeen20的0.01M磷酸鹽緩衝液、PH7.5)洗滌3次。在所有的孔(Well)中添加100μl抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)-HRP結合物(Conjugate)，再在25℃下保持30分鐘後，再用洗滌緩衝溶液洗滌3次，直接添加100μl的酶基質，在25℃暗室內打開板蓋，保持30分鐘，添加100μl0.18M硫酸後，用微板判讀機，在450nm下測定吸光度，由標準溶液的吸光度值製作標準曲線，以該曲線為基準計算出實驗組的白細胞介素生成量。測定結果如表29所示。表29從上述表29中記載的結果可知，本發明軟膏劑對用大腸桿菌(E.col)LPS刺激的人單核白細胞1L-1β生成抑制效果的試驗結果，可知含有0.01％濃度以上的牛膝提取物的2-3、5、7、9和11中，抑制效果隨著牛膝提取物濃度的增加，呈現上升趨勢，反之，含有榆白皮提取物的實施例2-2、4、6、8、10和12中，對1L-1β的生成沒有抑制效果。含有牛膝和榆白皮兩種的實施例2-13、14、15、16、17和18中對於1L-1β生成的抑制效果隨著牛膝濃度而上升。實驗例2-4本發明軟膏劑對單核白細胞的前列腺素(PGE2)生成的抑制效果按如下方法實驗本發明軟膏劑組合物對牙周疾病誘發物質前列腺素生成的抑制效果。本試驗方法是，用牙周疾病進行過程中的牙周病原菌Porphyromonasgingivalis的細胞壁構成成分類脂多糖類刺激人的單核白細胞誘發PGE2的生成，以抗原-抗體免疫診斷法，將實驗組軟膏劑(實施例2-1～2-8)和比較組牙膏及軟膏劑(比較例2-1～2-18)與蒸餾水，以1∶2的比例完全均質混合，以5000g離心分離10分鐘，處理上清液後，比較評價抑制效果。具體的實驗方法如下。在付著山羊抗-鼠IgG的96-Well板的空白孔(Well)中添加50μl緩衝溶液(含有0.9％Nacl，0.1％牛血清蛋白、0.5％Kathon的0.1M磷酸緩衝溶液)，在標準孔中添加50μl適當濃度(0、2.5、5、10、20、40、80、160、320pg)的PGE2標準溶液後，將50μl如上製造的實驗組軟膏劑(實施例2-1～2-18)和比較組軟膏劑(比較例2-1～2-18)添加到設定為實施例和比較例組的孔(Well)中，除了空白孔(Well)外，所有的孔(Well)中添加50μl對PGE2的抗體後，除了空白(Well)外，在所有的(well)中添加50μlPGE2ConjugatePeroxidase，用96-孔Well板復蓋，在25℃下維持1小時後，用洗滌緩衝溶液(含有0.05％Tween20的磷酸緩衝溶液PH7.4)洗滌4次，在常溫下直接加入150μl酶基質(在20％的二甲基甲醯胺中溶解3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺/過氧化氫)，在25℃下保持30分鐘，添加100μl1M硫酸後，用微板判讀機，在450nm下測定吸光度，由標準溶液的吸光度值製作標準曲線，再由該標準曲線計算出實驗組的前列腺素生成量(單位pg)。測定結果示於表30。表30從上述表30中記載的結果可知，本發明軟膏劑組合物對用大腸桿菌(E.Coli)LPS進行刺激的人的單核白細胞PGE2生成的抑制效果，試驗結果是含有牛膝提取物的2-3、5、7、9和11中，抑制效果隨著牛膝提取物濃度的增加，顯示出上升趨勢，反之，含有榆白皮提取物的實施例2-2、4、6、8、10和12中，沒有顯示出PGE2生成抑制效果。含有牛膝和榆白皮兩者的實施例2-13、14、15、16、17和18，PGE2生成抑制效果隨著牛膝濃度呈上升趨勢。實驗例2-5本發明軟膏劑對齒齦纖維牙細胞的膠原蛋白質生成的效果按如下方法測定本發明軟膏劑組合物對齒齦纖維牙細胞的膠原蛋白質生成的影響。將一次培養的齒齦纖維細胞，以106細胞/孔，注入到24-孔板中，並在各孔中注入1ml含有10％FBS的DMEM培養基，培養一天，次日，將既存的培養基交換到新的培養基上，培養24小時後，用HBSS緩衝液洗滌付於底部的洗滌層後，再添加0.8ml不含有血清和(脯氨酸)脯氨酸的MEM培養基後，直接將實驗組軟膏劑(實施例2-1～2-18)和比較組軟膏劑(比較例2-1～2-18)用DMEM培養基以1∶2的比例進行稀釋完全均質化，以5000g離心分離10分鐘，處理100μl所得上清液後，直接在含有100μl14C-脯氨酸(10μCi)的培養液中培養細胞。經過24小時後，測定膠原蛋白質。首先，為測定細胞外蛋白質總合成量，將各孔的培養液裝入封住一端的透析管內，將另一端封口，用冷緩衝液(Tris-Hcl0.05mol/l、Nacl0.2mol/lCacl20.05mol/l，苯甲基磺醯氟化物0.3mN)透析24小時後，分別取100μl，裝入計量管內，加入10ml閃爍Coctail，用液體閃爍計數器(LSC)測定1分鐘放射能。為測定細胞內蛋白質總合成量，在除去細胞培養液的各個孔(well)中，分別添加0.1NNaOH和0.3mN苯甲基磺醯氟化物後，在60℃下保持30分鐘，待細胞膜破壞後，將細胞菌質液裝入封住一端的透析管內，再封住另一端，用冷緩衝液(Tris-Hcl0.05mol/l、Nacl0.2mol/l，Cacl20.05mol/l、苯甲基磺醯氟化物0.3mN)透析24小時後，分別取100μl，裝入計量管內，加入10ml閃爍Coctail，用LSC測定1分鐘放射能。為測定細胞內-外膠原蛋白質的總合成量，將透析完的細胞培養液和細胞均質液各取100μl裝入1.5ml微細管內，添加膠原酶緩衝液(0.05MTris-Hcl1mMCacl20.03mM苯甲基磺醯氟化物)、100μl膠原酶(100ppm)後，37℃下保持3小時，待膠原分解完全後，為去除沒分解的蛋白質，添加500μl含有50％三氯醋酸和1％旦寧酸的溶液後，在4℃下沉澱30分鐘後，以1000Xg，離心分離5分鐘後，取100μl上清液，裝入計量管內，再加入10ml閃爍Coctail，用LSC測定1分鐘放射能。測定結果示於表31。表31從表31中記載的結果可知，用本發明的軟膏組合物處理含有14C-脯氨酸的細胞培養液的結果，含有榆白皮提取物的2-2、4、6、8、10和12中，促進膠原合成效果，隨著榆白皮濃度的增加而顯示出上升趨勢，反之，含有牛膝提取物的實施例2-3、5、7、9和11中，沒有顯示出促進膠原合成效果。含有牛膝和榆白皮兩者的實施例2-13、14、15、16、17和18中，促進膠原合成效果隨著榆白皮濃度而呈上升趨勢。實施例2-6本發明的軟膏劑對治療牙周疾病的效果(臨床實驗)按如下臨床實驗方法，確認本發明軟膏劑對治療牙周疾病的治療效果。將實驗對象分成實驗組和比較組後，實施牙面細磨，測定初期齒齦炎指數，供給實驗組軟膏劑和比較組軟膏劑，一次200mg，每天3次，飯後服用，1周和1個月後，實施口腔檢查診斷，檢查齒齦炎指數。各情況的齒齦炎指數，是將牙周膜試驗片(Periodentalprove)插入齒齦裂口內，在不加力的狀態下，連續刺探各牙齒周圍，30秒後，測定出血狀態，以下表32中的基準記錄點數，得到的結果。測定結果示於表33。表33從表33中記載的結果可知，含有抑制誘發牙周疾病的1L-1β和前列腺素的生成及過氧化物、可抑制分解牙周組織的膠原酶酯素活性的牛膝提取物，和或含有促進膠原合成、抑制膠原酶活性的榆白皮提取物的本發明軟膏(實施例2-1～2-12)的牙周疾病治療效果，從1周到1個月，比不含有牛膝或榆白皮的比較例(2-11～2-18)，顯示出優良的效能，比較例的齒齦炎指數，1個月以後，隨著時間的延長不斷上升，反之，使用根據本發明研製的軟膏時，抑制牙周疾病發生的齒齦炎指數，隨著時間的延長明顯地降低，含有牛膝和榆白皮兩者的實施例2-13、14、15、16、17和18中，對抑制牙周疾病顯示出上升的效果。根據本發明的牙膏組合物和軟膏劑組合物，不僅能抑制牙周疾病誘發物質過氧化物(Superoxide)、前列腺素(PGE2)、白細胞介素-1β的生成，而且能抑制分解牙周組織基質膠原蛋白質的膠原酶的活性，同時，通過促進膠原蛋白質合成，可有效地治療牙周疾病。權利要求1.一種口腔用組合物，含有牛膝提取物、榆白皮提取物或它們的混合物。2.根據權利要求1記載的組合物，其特徵是提取溶劑是甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。3.根據權利要求1記載的組合物，口腔用組合物是牙膏組合物。4.根據權利要求3記載的組合物，其特徵是牛膝提取物和榆白皮提取物分別含有0.001～5(重量)％。5.根據權利要求4記載的組合物，其特徵是牛膝提取物和榆白皮提取物分別含有0.01～3(重量)％。6.根據權利要求3記載的組合物，其特徵是含有牛膝提取物和榆白皮提取物的混合物0.002～10(重量)％。7.根據權利要求3記載的組合物，其特徵是進而含有20～60(重量)％的磷酸氫鈣、沉澱二氧化矽或碳酸鈣作為煉磨劑。8.根據權利要求3記載的組合物，其特徵是進而含有0.1～2(重量)％的氟化鈉或第1氟化磷酸鈉作為含氟化合物。9.根據權利要求1記載的組合物，口腔用組合物是治療牙周疾病的軟膏劑。10.根據權利要求9記載的組合物，其特徵是以組合物的總重量為基準，含有0.001～5(重量)％的牛膝提取物。11.根據權利要求9記載的組合物，其特徵是以組合物的總重量為基準，含有0.001～5(重量)％的榆白皮提取物。12.根據權利要求9記載的組合物，其特徵是以組合物的總重量為基準，含有0.002～10(重量)％的牛膝提取物和榆白皮提取物的混合物。13.根據權利要求9～11的任一項記載的組合物，可進一步配合表面活性劑、增溶劑、溼潤劑、藥效傳遞組分、緩衝劑、防腐劑、甜味劑和香料。14.根據權利要求13中記載的組合物，以組合物的總重量為基準，配合5～30(重量)％的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物作為表面活性劑。15.根據權利要求13記載的組合物，以組合物的總重量為基準，配合1～20％的低級醇作為增溶劑。16.根據權利要求13記載的組合物，以組合物的總重量為基準，配合5～40(重量)％的選自甘油、山梨糖醇液、聚乙二醇-200、聚乙二醇400、聚乙二醇600和聚乙二醇1000、丙二醇、泊洛沙姆407和甘油單油酸酯Myverol18-99中的1種或1種以上的成分，作為溼潤劑。17.根據權利要求13記載的組合物，以組合物的總重量為基準，配合1～30(重量)％的明膠或果膠作為藥效傳遞組分。18.根據權利要求13記載的組合物，配合選自磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉、磷酸鈉、檸檬酸和檸檬酸鈉、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉和焦磷酸鈉和焦磷酸鹽中的1種或1種以上成分作為緩衝劑，將PH值調整為5.0～8.0。全文摘要本發明是關於含有牛膝提取物、榆白皮提取物,或它們的混合物的口腔用組合物,不僅能抑制牙周疾病誘發物質過氧化物、前列腺素(PGE文檔編號A61K36/18GK1186683SQ9710858公開日1998年7月8日申請日期1997年12月5日優先權日1996年12月5日發明者金文武,金祥年,石在均,崔慶哲申請人:Lg化學株式會社