一種多重pcr法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法
2023-09-14 13:03:20
一種多重pcr法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法
【專利摘要】本發明公開了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法。所述引物組包括三對引物，第一對引物的上下遊序列分別如SEQ?ID?No.1～2所示，第二對引物的上下遊序列分別如SEQ?ID?No.3～4所示，第三對引物的上下遊序列分別如SEQ?ID?No.5～6所示。該引物組有極強的特異性，每一對引物僅能擴增相應病害的病原菌特異性片段，因此可用於對水稻白枯葉病原菌、水稻細菌性條斑病原菌和水稻細菌性谷枯病原菌這三種病原菌進行同時、快速、準確的檢測鑑定。
【專利說明】—種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法【技術領域】[0001]本發明屬於植物病原菌檢驗檢疫領域，具體涉及一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法。【背景技術】[0002]水稻是最重要的糧食作物，世界上一半人口以水稻為生。隨著水稻種質資源的調運日益頻繁，一些水稻病害隨種子調運而嚴重擴散，對稻米產量造成了不可挽回的損失。因此，重視並加強檢驗檢疫工作，對切實保障稻米生產安全及產地生態安全有著重要的意義。 此外，我國加入WTO後，在植物出入境檢疫方面亦面臨著空前的挑戰。為確保我國農業的可持續發展，必須一方面有效制止病蟲害傳入我國，另一方面則要保證我國出口的農產品符合進口國的要求。而這些檢疫、防疫工作的落實則依賴靈敏、準確以及便捷的病原檢測技術的發展和應用。[0003]2007年，農業部匯同國家質量監督檢驗檢疫總局共同制定了《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，該目錄中明確規定水稻白葉枯病(Rice bacterial leaf blight)、水稻細菌性條斑病(Rice bacterial leaf streak)和水稻細菌性谷枯病 (Bacterial grain rot)為水稻的檢疫性病害。由於帶菌種子是這三種病害的主要初侵染源與傳播途徑，因此及早檢測發現種子上的病原菌及有無症狀病害，對於預防及採取相應措施加以防治、指導生產、減少經濟損失等均有著重要的意義。[0004]現階段已有許多技術應用到對水稻白葉枯病、細菌性條斑病和細菌性谷枯病的檢驗檢疫，例如經典的產地檢驗、育苗生長觀察法、選擇性分離、噬菌體檢測、致病性測定、免疫分離、血清學檢測技術等，但主要還是依據三種病原菌的生理生化差異來區分。根據《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準》中關於水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌的檢測方法規定，對於出入境種子首先需要進行樣品的清洗、研磨並獲得提取液，然後進行 SPA的平板培養，或利用ELISA試劑盒對提取液進行快速篩選檢測。對於檢測結果呈陽性的還需進行進一步的平板分離和生化鑑定。整個過程程序複雜，耗時長，且仍有可能造成假陽性。[0005]近年來，隨著分子生物學技術的發展，PCR技術已廣泛用於水稻白葉枯病、細菌性谷枯病和細菌性條斑病的檢測(TakeuchiT, Sawada H, Suzuki F，et al.Specific detection of Burkholderia plantarii and B.glumae by PCR using primers selected from thel6S_23S rDNA spacer regions [J].The Phytopathological Society of Japan，1997，63 (6):455—462.；Cottyn Bj Bautista A Tj Nelson R J，et al.Polymerase chain reaction amplification of DNA from bacterial pathogens of rice using specific oligonucleotide primers.1nt Rice Notes，1994，19:30~32.；GnanamanickamSSj Sakthivel N，Nelson R J，et al.Evaluation of Culture Media and Molecular Probesfor Detection of Xanthomonas oryzae pv.0ryzae in Rice.1n:Verma J Pj VarmaA,KUMAR Dj ed.Detection of Plant Pathogens and Their Management.New Delh1: Angkor Publishers, 1995，336~349.;張華，姜英華，胡白石，等.利用PCR技術專化性檢測水稻細菌性條斑病菌.植物病理學報，2008，38(1):1~5.;懷雁，等.水稻細菌性谷枯病菌的實時螢光PCR檢測技術研究.中國水稻科學，2003，23(1):107~110.;張華，胡白石，劉鳳權.雙重PCR技術檢測水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌.植物檢疫，2007，21增刊)。[0006]但是，現有技術只能對水稻白枯葉病原菌、水稻細菌性條斑病原菌和水稻細菌性谷枯病原菌中的一種或兩種進行檢測鑑定，能同時對這三種病原菌進行檢測鑑定的方法仍未見報導。
【發明內容】
[0007]本發明公開了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組，利用該引物組可以同對水稻白枯葉病原菌、水稻細菌性條斑病原菌和水稻細菌性谷枯病原菌這三種病原菌進行快速、準確的檢測鑑定。[0008]多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組，包括三對引物:[0009]第一對引物的鹼基序列為:[0010]上遊引物:5'-CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3'；[0011]下遊引物:5'-ACACCGTGATGCAATGAAGA-3'；[0012]第二對引物的鹼基序列為:[0013]上遊引物:5'-CAAGACAGACATTGCTGGCA-3'；[0014]下遊引物:5'-GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3'；[0015]第三對引物的鹼基序列為:[0016]上遊引物:5'-TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3'；[0017]下遊引物:5'-CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3'。[0018]在GenBank中搜索水稻白葉枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)和細菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)的基因並進行BLAST比對,分別獲得了水稻白葉枯病原菌的特異性基因Glycosyltransferase (GenBank號為:AF169030.1，編碼糖基轉移酶Glycosyltransferase),以及細菌性條斑病原菌的特異性基因AvrRxo (GenBank號為: AY395713.1)。針對X.0ryzae pv.0ryzae 在 Glycosyltransferase 基因的特異性位點設計了所述第一對引物，針對X.0ryzae pv.0ryzicola在AvrRxo基因的特異位點設計了所述第二對引物。[0019]對水稻細菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)的16s rDNA (GenBank號為: D87080)進行 BLAST 搜索,獲得了與其同源性極高的 B.plantarii, B.gladioli, B.cepalia 的16s rDNA序列；對這些序列進行比對,發現了 B.glumae的16s rDNA的保守區和特異性區域，針對該特異性區域設計了所述第三對引物。[0020]本發明還提供了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的方法，包括:[0021 ] (I)提取待檢樣品的DNA ;[0022](2)以提取的DNA為模板，利用所述引物組進行PCR擴增；[0023](3)將PCR擴增產物進行凝膠電泳分離、染色，根據擴增條帶判定待測樣品中水稻檢疫性病原菌的種類；[0024]所述水稻檢疫性病原菌為水稻白葉枯病原菌、水稻細菌性條斑病原菌和水稻細菌性谷枯病原菌。[0025]若待檢樣品中病原侵染的程度很低，容易導致無法檢測到相應的病原菌。為避免出現「假陰性」結果，作為優選，PCR擴增體系中，水稻白葉枯病原菌DNA的濃度不低於0.01ng/ μ L ;水稻細菌性條斑病原菌DNA的濃度不低於0.05ng/ μ L ;水稻細菌性谷枯病原菌 DNA 的濃度不低於 0.1ng/μ L0 0.01ng/μ L,0.05ng/yL、0.1ng/μ L 即是相應病原菌 DNA 的檢出限，本發明中，「檢出限(limit of detection)」是指在本發明的PCR條件下,相應病原菌DNA能夠被檢測出來的最低濃度。[0026]作為優選，PCR擴增體系為50 μ L，其中，2XTaq PCR Master Mix緩衝液25 μ L， 10 μ M的引物各I μ L，DNA模板的終濃度不低於檢出限，滅菌去離子水補至50 μ L ;所述 2 X Taq PCR Master Mix 緩衝液中含有 1.5mMMg2+、200 μ M dNTPUU Taq 酶。[0027]PCR 反應程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環；最後72°C延伸5min。[0028]本發明還提供了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的試劑盒，包括PCR緩衝液，MgCl2, dNTP, Taq酶，引物，陽性對照DNA和滅菌去離子水，所述引物即為本發明所述引物組。[0029]作為優選，所述試劑盒中採用2XTaq PCR Master Mix緩衝液，該緩衝液中含有 Mg2+、dNTP、Taq酶，因此不必另外設置上述的MgCl2, dNTP, Taq酶，試劑盒內只配備2 XPCR Master Mix緩衝液、引物、陽性對照DNA和滅菌去離子水即可,不僅節約試劑盒內空間也大大簡化了 PCR過程，只需在2 X Taq PCR Master Mix緩衝液中加入模板、引物組和滅菌去離子水，即可進行反應。[0030]作為優選，所述試劑盒還包括核酸提取液和膠回收提取液。如此一來，利用該試劑盒即可完成對待測樣品進行核酸提取、膠回收純化的一系列步驟，不必再另外使用其他的核酸提取試劑盒以及膠回收試劑盒。[0031]與現有技術相比，本發明的有益效果為:本發明的引物組具有極強的特異性，僅能擴增相應病害的病原菌特異性片段，因此可用於對水稻白枯葉病原菌、水稻細菌性條斑病原菌和水稻細菌性谷枯病原菌這三種病原菌進行同時、快速、準確的檢測鑑定。此外，由於本發明僅在一個PCR管中即可實現對三種病原菌的同時檢測，因此大大降低了成本。【專利附圖】
【附圖說明】[0032] 圖1為引物JLXooF/JLXooR對各水稻病原菌的擴增產物電泳圖；其中，M為DNA分子量標準，1-4 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173, 5-9 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，10-20 泳道依次為:X.maltophilia, X.campestris, B.gladioli pv.alliicola, B.cepacia, B.glumae, Pellicularia sasakii，Fusarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30， Magnaporthe oryzae CHL441， Ustilaginoidea oryzae LN, Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0033]圖2為引物JLXocF/JLXocR對各水稻病原菌的擴增產物電泳圖；其中，M為DNA 分子量標準，1~5泳道依次為X.0ryzae pv.0ryzicola的五個菌株AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，6-9 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、 Z173，10-20 泳道依次為:X.maltophilia, X.campestris, B.gladioli pv.alliicola, B.cepacia, B.glumae, Pellicularia sasakii，Fusarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30， Magnaporthe oryzae CHL441， Ustilaginoidea oryzae LN, Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0034]圖3為引物JLBgF/JLBgR對各水稻病原菌的擴增產物電泳圖；其中，M為DNA分子量標準，I 泳道為 B.glumae，2 泳道為 B.gladioli pv.alliicola，3 泳道為 B.cepacia， 4-7 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173，8_12 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1，13-20 泳道依次 為:X.maltophilia，X.campestris，Pellicularia sasakii，Fusarium oxysporumf.sp.niveum, Magnaporthe oryzae C30，Magnaporthe oryzae CHL441，Ustilaginoidea oryzae LN，Ustilaginoidea oryzae SX0201 ；[0035]圖4為引物JLXooF/JLXooR的靈敏度檢測結果圖；[0036]圖5為引物JLXocF/JLXocR的靈敏度檢測結果圖；[0037]圖6為引物JLBgF/JLBgR的靈敏度檢測結果圖；[0038]圖4-6中，M為DNA分子量標準，1-9泳道對應的DNA模板濃度依次為:lng/uL， 5X10 1Iig/ μ L，I X 10 1Iig/ μ L，5 X 10 2ng/ μ L，I X 10 2ng/ μ L，5 X 10 3ng/ μ L，I X 10 3ng/ μ L，5 X 10 4ng/ μ L，I X 10 4ng/ μ L ；[0039]圖7為本發明引物組對三種水稻檢疫性病原菌的多重PCR同步檢測結果圖；其中， M 為 DNA 分子量標準，1-3 泳道依次為 X.0ryzae pv.0ryzae Ζ173、Χ.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-K B.glumae 的 DNA ；4 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 的 DNA 混合物；5 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和 B.glumae 的 DNA 混合物；6泳道為 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 和 B.glumae 的 DNA 混合物；7 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae Ζ173、Χ.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 和 Β.glumae 的 DNA 混合物；[0040]圖8為利用現有引物對各水稻病原菌的擴增產物電泳圖；其中，M為DNA分子量標準，1-6 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzicola JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1、AHB4-75 以及 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225，7-11 泳道為 X.0ryzae pv.0ryzae 0S86、0S198、0S225、Z173 以及 X.0ryzae pv.0ryzicola JSB322 ；[0041 ] 圖9為引物JLXooF/JLXooR和JLXocF/JLXocR對帶菌水稻葉片的擴增產物電泳圖；其中，M為DNA分子量標準，1，2泳道分別為X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198，3， 4 泳道分別為 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1、AHB4_75，5，6 分別為人工接種 X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198的水稻葉片提取物，7，8分別為人工接種X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1、AHB4-75的水稻葉片提取物，9泳道為同時接種X.0ryzae pv.0ryzae Z173 和X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1的水稻葉片提取物，10泳道為同時接種X.0ryzae pv.0ryzae 0S198 和 X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75 的水稻葉片提取物，11，12 為健康水稻葉片。【具體實施方式】[0042]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明的技術方案作進一步詳細說明。[0043]I引物設計[0044]在GenBank中搜索水稻白葉枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)和細菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)的基因並進行BLAST比對,分別獲得了水稻白葉枯病原菌的特異性基因Glycosyltransferase (GenBank號為:AF169030.1，編碼糖基轉移酶Glycosyltransferase),以及細菌性條斑病原菌的特異性基因AvrRxo (GenBank號為: AY395713.1)。針對X.0ryzae pv.0ryzae 在 Glycosyltransferase 基因的特異性位點設計了第一對引物JLXooF/JLXooR,針對X.0ryzae pv.0ryzicola在AvrRxo基因的特異位點設計了第二對引物 JLXocF/JLXocR。[0045]第一對引物JLXooF/JLXooR的鹼基序列為:[0046]JLXooF:5/ -CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3' (SEQ ID N0.1)；[0047]JLXooR:5/ -ACACCGTGATGCAATGAAGA-3' (SEQ ID N0.2)；[0048]第二對引物JLXocF/JLXocR的鹼基序列為:[0049]JLXocF:5/ -CAAGACAGACATTGCTGGCA-3' (SEQ ID N0.3)；[0050]JLXocR:5/ -GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3' (SEQ ID N0.4)；[0051]對水稻細菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)的16s rDNA (GenBank號為: D87080)進行 BLAST 搜索,獲得了與其同源性極高的 B.plantarii, B.gladioli, B.cepalia 的16s rDNA序列；對這些序列進行比對,發現了 B.glumae的16s rDNA的保守區和特異性區域，針對該特異性區域設計了第三對引物JLBgF/JLBgR，其鹼基序列為:[0052]JLBgF:5/ -TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3' (SEQ ID N0.5)；[0053]JLBgR:5/ -CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3' (SEQ ID N0.6)。[0054]2引物的特異性檢測[0055]分別提取水稻白葉枯病原菌(X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、 Z173)、水稻細菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、 GXB3-14、SCB4-1)、水稻細菌性谷枯病原菌(B.glumae)、以及其他植物病原菌(B.cepacia, B.gladioli pv.alliicola、X.maltophilia、X.campestris、Pellicularia sasaki1、 Fusarium oxysporumf.sp.niveum、Magnaporthe oryzae C30、Magnaporthe oryzae CHL441>Ustilaginoidea oryzae LN>Ustilaginoidea oryzae SX0201)的 DNA,這些植物病原菌由浙江省農業科學研究院、浙江大學、浙江師範大學提供或購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。DNA 的提取方法為參見生工細菌DNA提取試劑盒的說明書。[0056]以上述提取的DNA為模板，分別用設計的三對引物進行PCR擴增，檢測這三對引物的特異性。[0057]PCR 擴增體系為 50μ L，其中，2XTaq PCR Master Mix 緩衝液 25 μ L (含 1.5mM Mg2+、200 μ M dNTP、IU Taq 酶)，10 μ M 的引物各 I μ L，10ng/ul 的 DNA 模板 I μ L，滅菌去離子水補至50 μ L0[0058]PCR 反應程序為:94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個循環；最後72°C延伸5min。[0059]檢測結果分別見圖1、圖2和圖3。[0060]由圖1可見，當用引物JLXooF/JLXooR分別對上述DNA模板進行PCR擴增時， X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173均出現了特異性條帶，而其他病原菌未出現條帶，說明引物JLXooF/JLXooR對水稻白葉枯病原菌X.0ryzae pv.0ryzae具有較高的特異性。[0061 ] 由圖2可見，當用引物JLXocF/JLXocR分別對上述DNA模板進行PCR擴增時， X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1 均出現了特異性條帶，而其他病原菌未出現條帶，說明引物JLXocF/JLXoCR對水稻細菌性條斑病原菌 X.0ryzae pv.0ryzicola具有較高的特異性。[0062]由圖3可見，當用引物JLBgF/JLBgR分別對上述DNA模板進行PCR擴增時，僅B.glumae出現了特異性條帶,其他病原菌均未出現條帶,說明引物JLBgF/JLBgR對水稻細菌性谷枯病原菌B.glumae具有較高的特異性。[0063]3引物的靈敏度檢測[0064]用無菌水分別對水稻白葉枯病原菌X.0ryzae pv.0ryzae Z173的DNA、水稻細菌性條斑病原菌X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1的DNA、水稻細菌性谷枯病原菌B.glumae 的 DNA 進行一系列稀釋,使其濃度依次為:lng/ μ L, 5xl0_1ng/ μ L, lxlO_1ng/ μ L, 5xl0_2ng/ μ L,IxlO2ng/μ L,5x103ng/μ L,IxlO3ng/μ L,5x104ng/μ L 和 IxlO 4ng/μ L0[0065]分別取I μ L的各濃度DNA作為模板，利用相應的特異性引物進行PCR擴增，檢測引物的靈敏度。PCR擴增體系和反應程序同上，檢測結果見圖4、圖5、圖6。[0066]由圖4 可見，引物 JLXooF/JLXooR 對 X.0ryzae pv.0ryzae Z173 的檢出限為 0.01ng/ μ L0 由圖 5 可見，引物 JLXocF/JLXocR 對 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1 的檢出限為0.05ng/yL。由圖6可見，引物JLBgF/JLBgR對B.glumae的檢出限為0.1ng/μ L。由此可見，本發明的三對引物均具有較高的靈敏度。[0067]4多重PCR同步檢測[0068]為實現對三種水稻檢疫性病原菌的同步檢測，以X.0ryzae pv.0ryzae Z173、 X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4_1、B.glumae為例，分別將三種病原菌的DNA等量混合、兩種病原菌的DNA等量混合、僅一種病原菌DNA作為模板，在每個擴增體系中均同時加入引物 JLXooF/JLXooR,引物JLXocF/JLXocR、引物JLBgF/JLBgR，進行PCR擴增，擴增體系和反應程序同上。擴增產物的電泳結果見圖7。[0069]由圖7可見，在以一種病原菌DNA為模板的擴增產物中，只有一條特異性條帶；在以兩種病原菌的DNA等量混合為模板的擴增產物中，可以得到兩條特異性條帶；在以三種病原菌的DNA等量混合為模板的擴增產物中，可以得到三條特異性條帶；說明利用本發明的引物組進行多重PCR可以用於對三種水稻檢疫性病原菌進行同步檢測，並且，檢測結果精確可/[目。[0070]5、利用已公開引物檢測水稻白葉枯病原菌和水稻細菌性條斑病原菌[0071]分別以X.0ryzae pv.0ryzae 0S225、0S198、0S86、Z173, X.0ryzae pv.0ryzicola AHB4-75、JSB3-22、YNB10-32、GXB3-14、SCB4-1這九個菌株的DNA為模板，分別利用文獻 (Cho M, Kang M, Kim C, Sensitive and Specific Detection of Xanthomonas oryzae pv.0ry zae by RealTime Bio-PCR Using Pathovar-Specific Primers Based on an rhs Family Gene,Plant Disease，2011，95 (5)589-594.)中公開的引物 Xoo290F/Xoo290R (SEQ ID N0.7~8)、文獻(張華，姜英華，胡白石，劉鳳權，許志剛.利用PCR技術專化性檢測水稻細菌性條斑病菌，植物病理學報，2008，38 (I) 1-5.)中公開的引物XoocF/XoocR (SEQ IDN0.9~10)進行PCR擴增，檢驗該引物對水稻白葉枯病原菌和水稻細菌性條斑病原菌的特異性，PCR擴增體系和反應程序同上。擴增產物的電泳結果見圖8。[0072]由圖8 可見，引物 XoocF/XoocR 從 X.0ryzae pv.0ryzicola 各菌株以及 X.0ryzae pv.0ryzae 0S225 中擴增出條帶，引物 Xoo290F/Xoo290R 則從 X.0ryzae pv.0ryzae 各菌株以及X.0ryzae pv.0ryzicola JSB322中擴增出條帶。表明這兩對引物對水稻白葉枯病原菌和水稻細菌性條斑病原菌的檢測特異性較低。[0073]6對水稻帶病葉片的檢測[0074]分別用剪葉法和針孔注射法對水稻9311葉片進行白葉枯病原菌(X.0ryzae pv.0ryzae Z173、0S198)和細菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola SCB4-1>AHB4-75) 的人工接種，並提取病斑(含病斑周圍水稻組織)的DNA。以提取的DNA為模板，利用引物 JLXooF/JLXooR和JLXocF/JLXocR進行擴增，PCR擴增體系和反應程序同上。擴增產物的電泳結果見圖9。[0075]由圖9可見，經相應病原菌接種後，在水稻葉片的病斑組織中檢測到相應的病原菌侵染，體現為電泳圖譜中出現了特異性的條帶。表明本發明的引物JLXooF/JLXooR和 JLXocF/JLXocR能夠在實際應用中用於檢測鑑定水稻白葉枯病原菌和水稻細菌性條斑病原菌。由於水稻穀枯病在國內尚屬少見，人工接種方法仍未建立，因此較難找到帶菌葉片或對其進行活體接種。[0076]7試劑盒[0077]利用上述設計的引物製備多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的試劑盒，該試劑盒中含有:核酸提取液、2XTaq PCR Master Mix 緩衝液(含 1.5mM Mg2\200yM dNTPUU Taq 酶)、引物 JLXooF/JLXooR、引物 JLXocF/JLXocR、引物 JLBgF/JLBgR、陽性對照 DNA、滅菌去離子水以及膠回收提取液。利用該試劑盒可以實現對待測樣品進行核酸提取、多重PCR擴增、 膠回收純化獲得擴增片段的一系列步驟。
【權利要求】
1.一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組，其特徵在於，包括三對引物:第一對引物的鹼基序列為:上遊引物:5' -CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3'；下遊引物:5' -ACACCGTGATGCAATGAAGA-3'；第二對引物的鹼基序列為:上遊引物:5' -CAAGACAGACATTGCTGGCA-3'；下遊引物:5' -GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3'；第三對引物的鹼基序列為:上遊引物:5' -TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3'；下遊引物:5' -CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3'。
2.—種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的方法，包括:(1)提取待檢樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物組進行PCR擴增；(3)將PCR擴增產物進行凝膠電泳分離、染色，根據擴增條帶判定待測樣品中水稻檢疫性病原菌的種類；所述水稻檢疫性病原菌為水稻白葉枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)、水稻細菌性條斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)和水稻細菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，PCR擴增體系中水稻白葉枯病原菌DNA的濃度不低於0.01ng/μ L0
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，PCR擴增體系中水稻細菌性條斑病原菌DNA 的濃度不低於0.05ng/ μ L。
5.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，PCR擴增體系中水稻細菌性谷枯病原菌DNA 的濃度不低於0.1ng/μ L0
6.如權利要求2~5任一所述的方法，其特徵在於，PCR擴增體系為50μ L，其中， 2 X Taq PCR Master Mix緩衝液25 μ L，10 μ M的引物各I μ L，DNA模板的終濃度不低於檢出限，滅菌去離子水補至50 μ L ;所述2XTaqPCR Master Mix緩衝液中含有1.5mM Mg2+、 200 μ M dNTPUU Taq 酶。
7.一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的試劑盒，包括PCR緩衝液，MgCl2, dNTP，Taq 酶，引物，陽性對照DNA和滅菌去離子水，其特徵在於，所述引物為權利要求1所述的引物組。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特`徵在於，還包括核酸提取液和膠回收提取液。
【文檔編號】C12R1/01GK103498000SQ201310473978
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】王雪豔, 陸雯, 潘潞琪, 姚含笑 申請人:中國計量學院