分離自母乳的具有益生菌活性和抑制體重增加活性的乳酸菌的製作方法

2023-09-14 04:10:55 1

專利名稱：分離自母乳的具有益生菌活性和抑制體重增加活性的乳酸菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種益生乳酸菌，更準確地說，涉及一種新的屬於乳桿菌屬的乳酸菌，所述乳酸菌分離自人母乳，並具有優良的益生菌活性，例如耐酸性、膽汁酸抗性和抗菌活性以及抑制體重增加的活性。

背景技術：
乳酸菌與人類共有悠久的歷史，是對人類健康非常有益的微生物，因此需求量不斷提高。根據乳酸菌研究的最新進展，其應用已經從普通的食品擴大到保健食品和藥品。乳酸菌例如有鏈球菌屬、小球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、芽孢乳桿菌屬和雙歧桿菌屬微生物。
乳酸菌存在於動物腸內，在其中分解宿主動物攝入的營養和纖維素，然後將其作為能源來製備乳酸和抗菌素，以抑制致病菌在腸內的生長，保持腸內健康。還將乳酸菌用於刺激動物生長、改善飼料利用、增強對疾病的抵抗力、抑制致病菌生長、降低死亡率、抑制有毒物質產生以及產生各種維生素。
然而，為了在腸內有效，從體外引入的乳酸菌必須安全到達腸內並附著於黏膜上來發揮功能。為此，乳酸菌必須能直接粘著於腸黏膜上，當其口服時必須較少被胃酸破壞，必須對膽汁酸具有強的抗性，並且必須對病原體具有強的抗菌活性。
當將乳酸菌用於對人類健康的食品或藥品時，認為其分離自人體以得到更好的效果。尤其是已經確認分離自母乳的乳酸菌更有效並且更安全。然而，人體來源的乳酸菌大部分分離自成人糞便或母乳哺育的嬰兒的糞便。分離自母乳的乳酸菌大部分是羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)以及其它幾乎未曾報導過的乳酸菌。
同時，肥胖病是慢性病，其原因尚未完全揭示，但認為其發展歸因於幾種不同因素的共同作用。肥胖病可能導致高血壓、糖尿病、心血管疾病、膽結石(galstone)、骨關節炎、睡眠呼吸暫停綜合症、呼吸紊亂、前列腺癌、乳癌、結腸癌等。用於預防和治療肥胖病的慣用方法主要有飲食-鍛鍊療法、外科手術、藥物療法等。飲食-鍛鍊療法鼓勵攝取低熱值、低脂肪的食品和耗氧的體育鍛鍊。該方法要求耐性，因為其需要重複並堅持地進行，這就是該方法似乎對於公眾無效的原因。外科手術通過手術除去體脂肪。該方法具有在短時間內獲得理想結果的優點，但同時具有承受痛苦的外科手術、對其效果的持續有質疑以及費用昂貴的缺點。藥物療法需要用心觀察，因為其帶來很多副作用。
最近，已經積極進行了由乳酸菌產生多糖的研究。已知乳酸菌產生胞外多糖的機制很複雜。根據乳酸菌的種類，多糖的產率和結構存在巨大差異。已經報導了由乳酸菌產生的多糖具有抗癌活性和免疫增強活性(Kitazawa，H.Int.J.Food Microbiol.，1998，40，169-175；Hosono，A.Biosci.Biotechnol.Biochem.，1997，61，312-316，Chabot，S.Lait.2001，81，683-697)。因為乳酸菌本身列為GRAS(公認是安全的，GenerallyRecognized As Safe)，預計由乳酸菌產生的多糖是非常安全的。


發明內容
本發明涉及一種分離自人母乳的乳酸菌，本發明的一個目的是提供具有對酸、pH和膽汁酸具有強的抗性，以及對腸具有強附著的乳酸菌，使得由消化酶分解的低分子量碳水化合物轉化為高分子量的多糖，並排洩多糖而不是使其被身體吸收。
為了實現上述目的，本發明提供了一種加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)BNR17菌株，該乳酸菌分離自人母乳。
本發明的乳酸菌菌株具有以下特徵 ①形態學-在乳酸菌MRS瓊脂平板培養基上，於37℃培養24小時之後的形態學 i.菌落的形狀、大小和顏色圓形、0.5mm×2mm，乳白色，光滑表面。
ii.革蘭氏染色陽性。
iii.類型杆式(桿菌)。
iv.孢子形成無。
v.遷移性無。
②生理學性質 i.生長溫度25-45℃ ii.生長pHpH 4.0-10.0 iii.最適生長溫度37-40℃ iv.最適生長pHpH 6.0-8.0 ③氧氣的影響兼性厭氧。
④糖類的可利用性 甘油-、核糖-、阿東糖醇-、半乳糖+、D-葡萄糖+、D-果糖+、D-甘露糖+、甘露醇-、山梨醇-、N-乙醯葡糖苷+、七葉苷+、水楊苷+、纖維二糖+、麥芽糖+、乳糖+、蜜二糖-、蔗糖+、海藻糖+、菊粉-、松三糖-、棉子糖-、澱粉-、β-龍膽二糖-、D-松二糖+、D-塔格糖+ ⑤耐酸性在pH 2.0下生存。
⑥膽汁酸抗性在0.3％的膽汁酸中生存。
⑦附著於腸附著於人腸上皮細胞Caco-2細胞。
⑧抗生素抗性對慶大黴素、卡那黴素、鏈黴素、桿菌肽、新黴素、萘啶酮酸、環丙沙星、多粘菌素B和甲氧苄啶有抗性。對紅黴素、青黴素、四環素、氨苄青黴素、氯黴素、萬古黴素和頭孢西丁、利福平敏感。
⑨對於致病菌的抗菌活性對於大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌和奇異變形桿菌具有抗菌活性。
⑩抗菌肽的存在由PCR檢測到對應於細菌素的加氏菌素T(gassericin T)(乳酸菌的抗菌肽成分之一)的基因。


多糖的產生本發明的乳酸菌在補充有2％葡萄糖的MRS培養基上培養24小時後產生大約520mg/L的多糖。多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、阿拉伯糖和D-葡糖胺組成。由本發明的乳酸菌所產生的多糖沒有被消化酶例如α-澱粉酶和胰酶分解。
韓國人與西方人具有不同的飲食習慣。因此，很清楚且自然的是，分離自韓國人的乳酸菌最適合於韓國人。分離自韓國人母乳的乳酸菌適合益生乳酸菌所需要的每個基本條件，使得對韓國人具有最佳的健康增強作用。本發明者將具有上述特徵的這種乳酸菌命名為「加氏乳桿菌BNR17」，並於2006年1月23日保藏在韓國生物技術和生物科學研究所(KRIBB)的韓國典型菌種保藏中心(KCTC)(保藏編號KCTC10902BP)。
本發明還提供了一種包含有效劑量的乳酸菌的組合物。本發明的組合物可以按照食品、食品添加劑、動物飼料和動物飼料添加劑的形式提供。
由本發明提供的新的乳酸菌，加氏乳桿菌BNR17(保藏編號KCTC10902BP)具有優良的耐酸性、膽汁酸抗性和抗菌活性，使其成為作為生產各種發酵乳產品及其它發酵食品的種子的優良候選者。本文所述的發酵乳產品可列舉酸乳酪、可爾必思(calpis)、乾酪和黃油，而本文所述的其它發酵食品可列舉豆腐、黃豆醬、清國醬(Chungkukjang)、果凍和韓國泡菜(Kimchi)，然而並不總限於此。用本發明的乳酸菌代替菌株，僅通過常規方法就可以容易地生產發酵乳產品和發酵食品。
根據本發明的優選實施方式，與給予PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)的對照組的大鼠相比，在給予加氏乳桿菌BNR17的實驗組大鼠中，觀察到大約7.7％抑制體重增加的作用(參見表6)。除抑制體重增加的作用外，實驗組的飲食功效與對照組相比也顯著降低。檢測了實驗組和對照組的糞便中包含的多糖。結果是實驗組的糞便中包含的多糖含量高於對照組(參見圖6)。這些結果表明加氏乳桿菌BNR17的不可消化多糖的生產能力在體重調節中起到一定作用。同時，在攝取加氏乳桿菌BNR17的實驗組大鼠中，未發現明顯的副作用，而每個器官的重量都沒有明顯不同於對照組(參見表7和表8)。沒有觀察到作為人攝取微生物時主要關心的問題之一的微生物轉換，表明本發明的乳酸菌對於人攝取來說非常安全(參見圖7)。
可以按照僅包含加氏乳桿菌BNR17或含有任何可接受的載體的組合物的可食用形式來生產本發明的乳酸菌食品產品。可以將本發明的乳酸菌加入到不包含任何益生菌的食品中或已經包含幾種益生菌的食品中。可與本發明的乳酸菌共用來生產乳酸菌食品的微生物必須適合於人或動物攝入，並具有益生菌活性，例如抑制致病菌或改善哺乳動物腸內的微生物平衡，但並不總限於此。益生菌微生物可列舉酵母，例如酵母菌屬、假絲酵母屬、畢赤氏酵母屬(Pichia)和球擬酵母屬(Torulopsis)；真菌，例如麴黴菌屬、根黴菌屬、毛黴菌屬和青黴菌屬；以及細菌，所述細菌屬於乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、丙酸桿菌屬、腸球菌屬和小球菌屬。優選地，所述益生菌微生物可選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbruckii)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminus)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)所組成的組。更優選將具有優良益生菌活性和免疫增強活性以及抗癌活性的益生菌微生物混合物加入到本發明的乳酸菌食品中以獲得更強的效果。適用於本發明的乳酸菌食品的載體例如有稀釋劑、高纖維添加劑、膠囊用材料和脂類，其為本領域技術人員所熟知。可將本發明的乳酸菌加氏乳桿菌BNR17製成膠囊劑、培養懸浮液或乾粉。
另外，可以將包含本發明乳酸菌的組合物制為動物飼料或動物飼料添加劑。
本發明的動物飼料添加劑可製成乾燥形式或液體形式，除了加氏乳桿菌BNR17之外，可以包含其它非致病微生物。可添加的微生物可以選自產生蛋白酶、脂肪酶和糖類轉換酶的枯草桿菌、具有有機分解活性並在厭氧條件下保持生理活性的乳桿菌菌株、有助於提高家畜的乳產量和體重並增加飼料可消化性的絲狀真菌例如米麴黴(Aspergillus oryzae)(Slyter，L.L.J.Animal Sci.1976，43，910-926)以及酵母例如釀酒酵母(Johnson，D.E等人，J.Anim.Sci.，1983，56，735-739；Williams，P.E.V.等人，1990，211)所組成的組。
除了加氏乳桿菌BNR17之外，本發明的動物飼料添加劑還可以包括一種或多種酶製劑。可添加的酶製劑可以是乾燥形式或液體形式，其選自脂肪酶、將肌醇六磷酸分解為磷酸鹽和磷酸肌醇酯的肌醇六磷酸酶、水解包含在澱粉和糖原內的α-1，4-糖苷鍵的澱粉酶、水解有機磷酸酯的磷酸酶、分解纖維素的羧甲基纖維素酶、分解木糖的木糖酶、將麥芽糖水解為兩個葡萄糖的麥芽糖酶以及將蔗糖水解為葡萄糖-果糖的轉化酶所組成的組。
將本發明的乳酸菌作為添加劑加入到動物飼料時，適宜的飼料原料選自農作物、大豆蛋白、花生、豌豆、製糖甜菜、紙漿、農作物副產品、動物腸粉和魚粉所組成的組。此時，可將這些原料原樣使用或在加工後使用。為了加工動物飼料，例如將用於飼料的原料通過壓力壓縮來排出，但不總限於此。就使用蛋白作為原料而言，優選為擠出。特別地，擠出使蛋白通過熱處理變性，使抗酶因子受到破壞。更具體地說，就使用大豆蛋白而言，擠出改善了蛋白的可消化性，鈍化了抗營養因子例如作為蛋白酶抑制劑之一的胰蛋白酶抑制劑，增加了由蛋白酶引起的消化性，使得蛋白的營養價值提高。
本發明進一步提供了用於預防和治療肥胖病的藥物組合物，其包含有效劑量的加氏乳桿菌BNR17(保藏編號KCTC 10902BP)。
本發明的加氏乳桿菌BNR17通常以片劑或膠囊劑的形式來給藥，所述片劑或膠囊劑通過將乳酸菌與藥學上可接受的載體、賦形劑或另一有效的輔助組分混合來製備。
用於本發明藥物組合物的可接受的載體、賦形劑或稀釋劑可列舉乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂或礦物油。本發明的微生物組合物還可包括潤滑劑、潤溼劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑或調味劑。本發明的組合物可根據本領域技術人員眾所周知的常規方法以腸溶包衣製劑的形式製備，以使該組合物經過胃安全地到達小腸，並快速而容易地在其中釋放作為活性成分的微生物。
本發明的微生物組合物還可根據通用的膠囊生產方法製成膠囊形式。例如，將標準載體用於製備包含本發明冷凍乾燥微生物的小球，所述小球填充軟膠囊劑。另一個例子是將本發明的微生物與藥學上可接受的載體例如可溶性膠、纖維素、矽酸鹽或油混合來製備懸浮液或分散溶液，所述懸浮液或分散溶液填充軟膠囊劑。
本發明的藥物組合物可以按照用於口服的單位藥物形式作為腸溶包衣製劑提供。本文的「腸溶包衣」表示藥物不被胃酸分解而保持包衣狀態，但在小腸中分解以在其中釋放活性成分，其包括藥學上可接受的各種包衣。本發明的「腸溶包衣」在模擬胃液例如HCl溶液(pH 1)於36-38℃維持至少兩個小時，但優選在模擬腸液例如KH2PO4緩衝液(pH6.8)中30分鐘內將包衣分解。
進行本發明的腸溶包衣，其中每個片芯上包覆16-30mg、優選16-20mg或少於25mg的組合物。包衣的優選厚度為5-100μm，為了獲得最佳結果，更優選為20-80μm。腸溶包衣的原料可以選自眾所周知的高分子物質。那些高分子物質記載於大量的參考文獻中(L.Lachman等人，The Theory and Practice of Industrial Pharmacy，第三版，1986，第365-373頁；H.Sucker等人，Pharmazeutische Technologie，Thieme，1991，第355-359頁；Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis，第四版，第7卷，第739-742頁和第766-778頁(SpringerVerlag，1971)；以及Remington′sPharmaceutical Sciences，第13版，第1689-1691頁(Mack Publ.，Co.，1970))，其可列舉出纖維素酯衍生物、纖維素醚、丙烯酸樹脂的丙烯酸甲酯共聚物以及馬來酸和苯二甲酸衍生物的共聚物。
本發明的腸溶包衣可由常規方法進行，所述常規方法是將包衣溶液噴霧到片芯上。腸溶包衣可接受的溶劑選自酒精例如乙醇、酮例如丙酮、滷化烴例如CH2Cl2及其混合物所組成的組。可將軟化劑例如鄰苯二甲酸二丁酯或三醋酸甘油酯以1∶0.05-0.3(包衣材料∶軟化劑)的比例加入到包衣溶液中。優選連續噴霧，並且噴霧量視包衣狀況而定。可以調節噴霧壓力，並且通常認為1-1.5bar獲得最佳效果。
本發明的「藥學上的有效劑量」指能降低低糖碳水化合物吸收到哺乳動物腸中的本發明微生物的最低量。可以根據給藥途徑和受試者來調節由本發明的組合物輸送給人體的微生物的劑量。
可以將本發明的組合物每天至少一天一次給予受試者。單位劑量指物理上獨立的、適於向受試者(人或其它哺乳動物)單位給藥的單位，並且每個單位包含需要量的可接受載體和需要量的用於治療作用的本發明的微生物。用於口服給予的本發明組合物的單位劑量優選為0.1-10g，更優選為0.5-5g。本發明微生物藥學上有效的劑量是0.1-10g/天。然而，劑量可根據患者的體重、肥胖病的嚴重程度以及有效的輔助成分和微生物而變化。可將一天的劑量分成幾個亞單位，使得必要時可以連續給藥。因此，本發明組合物的劑量不以任何方式限制本發明的精神和範圍。
本發明組合物的定期給予通過釋放微生物來競爭和形成阻斷吸收的微生物群落，從而導致糖類在人體內吸收的阻斷，並進一步參與單糖例如碳水化合物轉換為多糖以抑制其吸收。另外，由微生物產生的膳食纖維提供了適於有益腸道菌生長並刺激腸運動的較好條件。所以，本發明的組合物可有效用於肥胖病的預防和治療。
為了使藥物組合物的體重減輕作用或肥胖病預防效果最大化，可將本領域技術人員已知的任何體重減輕劑以適當的量包含於該組合物中。可在多次試驗之後由本領域技術人員確定該量。作為添加劑有效成分的體重減輕劑優選選自共軛亞油酸、聚右旋糖、菊粉、瓜耳膠、阿拉伯樹膠、左旋肉鹼、葡萄籽提取物、低聚果糖、低聚木糖、棉子糖、葡糖酸、食用傘菌、聚花青素、乳果糖、乳糖醇、低聚乳果糖、朝鮮當歸(Angelicagigas)提取物、枳棋子(Hovenia dulcis)提取物和陳皮提取物組成的組，但並不總限於此。
本發明還提供了通過培養加氏乳桿菌BNR17(保藏編號KCTC10902BP)而製備的培養液。對用於製備培養液的培養基並沒有限制，可使用包含用於微生物培養的培養基的任何培養基。如果需要，本發明的培養液還可以包含用於特定用途的任何添加劑。例如為了使體重減輕作用最大化，可將本領域技術人員眾所周知的任何體重減輕劑加入培養液中，此時可通過重複試驗測定有效劑量範圍後，由本領域技術人員確定該體重減輕劑的含量。
本發明還提供了由本發明的乳酸菌產生的細菌素肽(bacteriocinpeptide)以及編碼該肽的基因。本申請的發明者將該細菌素肽命名為「加氏菌素BNR17(gassericin BNR17)」，證實其具有SEQ.ID.NO5所示的核苷酸序列。將加氏菌素BNR17的核苷酸序列與通用的抗微生物肽加氏菌素T的核苷酸序列(NCBI Blast檢索號AB029612，SEQ.ID.NO6)相比較，結果加氏菌素BNR17與加氏菌素T具有大約98％的同源性。
本發明進一步提供了包含加氏菌素BNR17基因的重組載體。
可通過將具有SEQ.ID.NO5所示的核苷酸序列的基因插入大腸桿菌的通用表達載體中來製備本發明的重組載體。用於構建重組載體的母載體不局限於具體的一種，幾乎可以使用任何微生物表達載體，但優選大腸桿菌表達載體。
本發明還提供了用重組載體轉化的轉化體。
可以通過將上述重組載體導入任意的宿主細胞容易地製備本發明的轉化體。本文的宿主細胞可以選自真核細胞或原核細胞以及多細胞動物來源的細胞系組成的組，但並不總限於此。



參考附圖可最好地理解本發明優選實施方式的應用，其中 圖1是顯示本發明的加氏乳桿菌BNR17和加氏乳桿菌KC26(NCBIGENBANK登錄號AF243156)16S rRNA的序列比較的圖。
圖2是顯示本發明的加氏乳桿菌BNR17的腸附著的顯微照片。
圖3是顯示本發明的加氏乳桿菌BNR17對各種致病菌具有抗菌活性的一組照片。
圖4是顯示根據本發明的加氏乳桿菌BNR17的生長，葡萄糖消耗量和多糖產量的圖。■細胞生長，◆葡萄糖濃度，▲EPS(多糖)濃度 圖5是顯示攝取本發明的加氏乳桿菌BNR17的大鼠糞便的量的圖。
圖6是顯示攝取本發明的加氏乳桿菌BNR17的大鼠糞便的EPS(多糖)濃度的圖。
圖7是顯示分離自攝取本發明的加氏乳桿菌BNR17的大鼠的、除小腸外的其它器官的菌落的RAPD-PCR圖譜的一組電泳照片，其中使用SEQ.ID.NO7(A)、NO8(B)和NO9(C)所示的引物。泳道1加氏乳桿菌BNR17，泳道2-5分離自攝取加氏乳桿菌BNR17的大鼠的、除小腸外的其它器官的菌落，MDNA長度標記物。
實施例 如以下實施例所示來說明本發明的應用和目前優選的實施方式。
然而應當理解，本領域技術人員通過考慮該公開內容可以在本發明的精神和範圍之內做出修改和改進。
實施例1分離自人母乳的乳酸菌 從分娩嬰兒不超過兩周的婦女獲取人母乳。然後，用PBS稀釋母乳，並將未稀釋的乳汁和稀釋的乳汁分別分配到乳酸菌選擇培養基中。在37℃下將培養基培養2-3天，然後通過形態和顏色將其中產生的菌落揀選。將分離的菌落進行革蘭氏染色，然後在顯微鏡下觀察來選擇格蘭氏陽性並具有杆狀結構的那些菌落。37℃下在MRS液體培養基(pH 6.8)中將選擇的菌落培養24小時。選擇pH低於4.5的培養液中的菌落。在MRS培養基(pH 2.0)中將菌落培養2小時，隨後在補充有0.3％牛膽汁的MRS培養基中進一步培養9小時。分離顯示耐酸性和膽汁酸抗性的存活的乳酸菌菌株，並通過16S rRNA測序進行鑑定。結果證實該菌株屬於加氏乳桿菌種(SEQ.ID.NO1，圖1)，並命名為「加氏乳桿菌BNR17」。
實施例2分離的乳酸菌的糖類利用 通過應用API50CHL試劑盒(Biomerieux，法國)與其它標準菌株相比較來研究以上分離的本發明加氏乳桿菌BNR17的糖類利用，結果如表1所示。在表1中，5314表示加氏乳桿菌CECT5714；5315表示加氏乳桿菌CECT5715；11413表示加氏乳桿菌LMG11413；18194表示加氏乳桿菌LMG18194；4479表示加氏乳桿菌CECT4479；18176表示加氏乳桿菌LMG18176；而13047表示加氏乳桿菌LMG13047。
表1 如表1所示，與其它乳酸菌菌株相比，本發明的加氏乳桿菌BNR17在糖類利用上可與其它相區別(如粗斜體字所示)。
實施例3分離的乳酸菌的酶活性 應用APIZYM試劑盒(Biomerieux，法國)將實施例1中分離的加氏乳桿菌BNR17的酶活性與其它標準菌株的酶活性相比較，結果如表2所示。在表2中，13134表示加氏乳桿菌LMG13134。
表2 如表2所示，本發明的加氏乳桿菌BNR17在酶活性上可與其它菌株相區別(如粗斜體字所示)。
實施例4耐酸性和膽汁酸抗性 為了研究本發明菌株的耐酸性和膽汁酸抗性，將加氏乳桿菌BNR17接種到4ml的MRS液體培養基中，並在37℃下培養18-20小時。將一些培養液再接種到具有調節的pH 2.0、107CFU/ml濃度的另一MRS培養基中，並在37℃下培養2小時。應用MRS瓊脂平板對活細胞進行計數。再次使用測定耐酸性的培養液來離心。回收細胞，並接種到補充有0.3％牛膽汁的MRS液體培養基(pH 6.8)中，隨後在37℃下培養9小時。也應用MRS瓊脂平板對活細胞進行計數。結果如表3所示。
表3 結果是即使用強酸(pH 2.0)處理之後，加氏乳桿菌BNR17仍然顯示高的存活率，在補充有0.3％牛膽汁的培養基中也是如此。
實施例5腸附著 將本發明的菌株接種到平板上，在該平板上，人腸上皮細胞系CaCo-2以107CFU/ml的濃度培養於PRMI1640(Gibco)中。在37℃下培養菌株一小時，隨後用PBS衝洗三次來除去未粘著的細胞。將樣品用甲醇固定，然後用結晶紫染色，隨後在顯微鏡下觀察。結果證實本發明的加氏乳桿菌BNR17非常好地粘著於CaCo-2細胞上(圖2)。
實施例6對致病菌的抗菌活性 在37℃下，在BHI液體培養基(Difco)中培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌和奇異變形桿菌18小時，然後以105CFU/ml的濃度分別接種到6份5ml BHI瓊脂培養基(瓊脂含量0.7％)中。這些培養基疊置於其上固定有BHI瓊脂培養基(瓊脂含量1.5％)的6塊平板上。在將這6塊平板培養基固化後，在每個培養基中形成直徑4mm的孔，在其中加入40μl在37℃下培養24小時的乳酸菌培養液的上清液(2X)，隨後在37℃下培養5小時。
結果是在孔周圍觀察到清楚的生長抑制環，表明本發明的菌株對各種致病菌具有抗菌活性(表4和圖3)。
表4 實施例7抗生素抗性 將加氏乳桿菌BNR17培養液使用藥籤塗在MRS瓊脂平板上，其上放置圓片，所述圓片包含紅黴素、青黴素、慶大黴素、卡那黴素、鏈黴素、桿菌肽、氯黴素、萬古黴素、四環素、氨苄青黴素、頭孢西丁、利福平、新黴素、萘啶酮酸、環丙沙星、多粘菌素B或甲氧苄啶，隨後在37℃下培養24小時。
結果證實本發明的加氏乳桿菌BNR17對慶大黴素、鏈黴素和甲氧苄啶具有抗性。
實施例8抗菌肽基因的檢測 通過PCR研究細菌素基因，所述PCR通過使用加氏乳桿菌BNR17基因組DNA作為模板，並使用SEQ.ID.NO3和NO4所示的引物來進行。所述的SEQ.ID.NO3和NO4特異於細菌素基因的核苷酸序列，已知所述細菌素由加氏乳桿菌種產生的抗菌肽。
結果證實了對應於加氏菌素的PCR產物，並如SEQ.ID.NO5所示。將該核苷酸序列與SEQ.ID.NO6所示的加氏菌素T(NCBI Blast檢索號AB029612)相比較，證實具有大約98％的同源性。
實施例9β-葡糖醛酸酶活性 已知腸道菌產生的β-葡糖醛酸酶是一種致癌酶，因此認為具有該酶活性的菌株是有害菌株。為了研究本發明的加氏乳桿菌BNR17是否具有β-葡糖醛酸酶活性，使用API ZYM試劑盒(Biomerieux，法國)來測定加氏乳桿菌BNR17的酶活性。
結果證實本發明的菌株不具有β-葡糖醛酸酶活性，表明該菌株是安全的(表5)。
表5 實施例10葡萄糖消耗量和多糖產量 將加氏乳桿菌BNR17以濃度106CFU/ml接種到通過加入2％葡萄糖(w/v)而製備的MRS培養基(Difco)中，培養96小時，其間逐步測定細胞數目，同時還測定葡萄糖消耗量和胞外多糖(EPS)產量。
結果是在第12小時的培養基上觀察到最高水平的，並且從那時起，該水平降低。在培養7小時之後，葡萄糖濃度迅速減低，在36小時之後，沒有檢測到葡萄糖濃度的變化，表明自培養開始起36小時之內，大部分葡萄糖耗盡。在第24小時EPS產量達到最大(最高水平520mg/l)，並在36小時稍微減低，但此後再次提高。推測將其歸因於引起細胞中各種多糖釋放到培養液中的細胞自溶作用(圖4)。
實施例11由加氏乳桿菌BNR17生產的多糖的通過消化酶的分解 將100mg的α-澱粉酶(Sigma)和胰酶(Sigma)各自溶於0.05M磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)。將50μl的上述酶溶液和150μl的0.05M磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)加入200μl的多糖(EPS)溶液中，所述的多糖(EPS)溶液從加氏乳桿菌BNR17培養液的上清液中提取，隨後在37℃下反應一小時。反應混合物在100℃下加熱15分鐘以鈍化其中的酶，隨後在室溫下冷卻。用葡萄糖試劑盒(Sigma)測定葡萄糖濃度。
結果是在處理每種消化酶之前，在多糖溶液中檢測不到葡萄糖，而在處理胰酶和α-澱粉酶之後，分別檢測到3.70mg/l和19.1mg/l的葡萄糖。這些結果表明由加氏乳桿菌BNR17生產的多糖幾乎不被消化酶分解。
實施例12加氏乳桿菌BNR17抑制體重增加的作用 將8周齡的雄性SD大鼠分為兩組。一組8周每天僅僅口服給予PBS(pH 7.4)，而另一組8周每天口服給予懸浮有109CFU/ml的加氏乳桿菌BNR17的PBS。每周測定體重、攝入食物和血液化學值例如膽固醇水平的變化。還測定糞便量和糞便中的EPS量來研究加氏乳桿菌BNR17抑制體重增加的作用與其多糖生產能力的關係。8周以後，處死全部試驗動物，並解剖摘取肝、腎、脾、MLN(腸繫膜淋巴結)，測定其重量。將每個摘取的器官的少許勻漿，塗在作為乳酸菌選擇培養基的LBS瓊脂上，然後培養，並且考察產生菌落的RAPD(隨機擴增多態性DNA)-PCR圖譜。將結果與加氏乳桿菌BNR17的RAPD-PCR圖譜相比較來研究該菌株是否轉入其它的器官中。
結果8周後在僅口服給予PBS的對照組中觀察到大約179.1％的體重增加，而在口服給予加氏乳桿菌BNR17的實驗組中觀察到大約171.6％的體重增加(表6)。與對照組相比，實驗組還顯示出較低的每日體重增加率和食物功效比。
表6
在表6中，食物功效比(FER)表示體重增加(g/天)/食物攝入(g/天)。*P＜0.05，**P＜0.05。
對照組和實驗組的糞便量和糞便中的EPS量的測定結果如圖5和圖6所示。在對照組和實驗組之間，糞便量沒有很大不同，但在給予加氏乳桿菌BNR17的實驗組中ESP的量顯著增加。該結果表明加氏乳桿菌BNR17將攝入體內的糖類組分轉化為不可消化的多糖，從而將多糖釋放出體外，導致體內吸收率降低和抑制體重增加的作用。
為了檢測用於人體給藥的菌株的安全性，測定血液化學值和器官重量。在對照組和實驗組中每個水平和值都相似，表明該菌株不引起副作用(表7和表8)。
表7 表8 在表8中，每個數字表示器官重量(g)/大鼠體重(g)。
為了研究該菌株是否轉入到其它器官中，通過使用分別由SEQ.ID.NO7-NO9所示的引物p1、p2和OPL5來研究在LBS瓊脂平板上培養的每個器官組織的菌落的RAPD-PCR圖譜。如下進行使用引物p1和p2的PCR94℃(2分鐘)、36℃(5分鐘)、72℃(5分鐘)-4個循環/94℃(1分鐘)、36℃(1分鐘)、72℃(2分鐘)-36個循環。如下進行使用引物OPL5的PCR94℃(2分鐘)-1個循環/94℃(40秒)、45℃(1分鐘)、72℃(1分鐘)-2個循環/94℃(40秒)、52℃(1分鐘)、72℃(3分鐘)-30個循環/70℃(5分鐘)-1個循環。
結果沒有菌落顯示出與BNR17類似的圖譜(圖7)。因此，證實當攝取時，BNR17是安全的菌株，其不會轉入除小腸之外的其它器官。
製備實施例1發酵乳的製備 使用脫脂奶粉將原料奶將非脂乳固體含量調節為8-20％，並在72-75℃下滅菌15秒。將滅菌的原料奶冷卻到適當溫度，將本發明的加氏乳桿菌BNR17以106CFU/ml的濃度接種，隨後培養直到pH達到4-5為止。當培養完成時，冷卻培養液。同時，將0.1-50重量％的濃縮果汁、0.1-20重量％的膳食纖維、0.5-30重量％的葡萄糖、0.1-15重量％的低聚糖、0.01-10重量％的鈣和0.001-5重量％的維生素全部溶解來製備糖漿。將糖漿滅菌，冷卻，並與上述培養液混合，隨後攪拌均勻。將生成的混合物包裝，結果製備得到發酵乳。測定發酵乳產品的風味、物理性質和味道，結果令人滿意。
製備實施例2乳酸菌粉末的製備 將本發明的加氏乳桿菌BNR17以106CFU/ml的濃度接種到MRS液體培養基中，隨後在37℃下控制pH發酵18-24小時。通過使用30體積％的NaOH作為中和劑使pH達到5.7±0.2來控制pH。當培養完成時，在4℃下以10,000×g進行離心來回收細胞。製備補充有5重量％的脫脂奶、2.5重量％的乳清和5重量％的蔗糖(相對於組合物的總重而言)的保護劑。將等量的回收細胞和保護劑混合，隨後通過使用凍幹機來研成粉末。產生的加氏乳桿菌BNR17乾燥粉末包含超過1×1011CFU/g活細胞。所述保護劑還可以包括10重量％的海藻糖、10重量％的麥芽糊精和7.5重量％的乳糖。
製備實施例3乳酸菌產品的製備 由製備實施例2生產的乳酸菌粉末製備乳酸菌產品例如乳酸菌食品和消化藥。將10重量％的低聚糖、20重量％的無水葡萄糖、5重量％的結晶果糖、2重量％的維生素C、5重量％的果粉香精、5重量％的蘆薈、15重量％的膳食纖維和18重量％的車前籽殼(Psyllium Husk)加入到20重量％的加氏乳桿菌BNR17的乾粉中，並將混合物包裝在棒狀物或瓶子中。由此製備的乳酸菌產物中，活細胞超過5×108CFU/g。
製備實施例4用於飼料添加劑的組合物的製備 由表9所示的下列成分製備用於飼料添加劑的包含加氏乳桿菌BNR17的組合物。
表9用於飼料添加劑的組合物的構成比率(重量％) 本文所用的酶製劑是肌醇六磷酸酶、纖維素酶、木糖酶、麥芽糖酶和轉化酶的混合物，並且所述非致病微生物是米麴黴。
工業實用性 如上文所說明的，本發明的加氏乳桿菌BNR17具有較寬的最適生長溫度和pH範圍。而且，本發明的菌株除了具有抑制體重增加的作用外，不僅具有優良的耐酸性、膽汁酸抗性和腸附著能力，而且對致病微生物具有強烈的抗菌活性。所以，本發明的菌株可以有效用於生產發酵乳及其它發酵產品，而且作為動物飼料添加劑也非常有用。
序列表
隨同附上序列表。
序列表
Bioneer Corporation
株式會社 百奧尼
Lactic Acid Bacteria Isolated from Mother′s Milk with Probiotic
Activity and Inhibitory Activity against Body Weight Augmentation
分離自母乳的具有益生菌活性和抑制體重增加活性的乳酸菌
2007-opa-3710
9
KopatentIn 1.71
1
840
DNA
Lactobacillus gasseri BNR17
加氏乳桿菌BNR17
1
gctgactcct ataaaggtta tcccaccggc tttgggtgtt acagactctc atggtgtgac60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta120
gcgattccag cttcgtgtag gcgagttgca gcctacagtc cgaactgaga acggctttca180
nagatccgct tgccttcgca ggttcgcttc tcgttgtacc gtccattgta gcacgtgtgt240
agcccaggtc ataaggggca tgatgacttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca300
ccggcagtct cattagagtg cccaacttaa tgatggcaac taatgacaag ggttgcgctc360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacagccatg caccacctgt420
ctcagcgtcc ccgaagggaa ctcctaatct cttaggtttg cactggatgt caagacctgg480
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg540
tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt600
agctgcagca ctgagaggcg gaaacctccc aacacttagc actcatcgtt tacggcatgg660
actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagcctcagc gtcagttgca720
gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt ccaccgctac780
acatggagtt ccactctcct cttctgcact caagttcaac agtttctgat gcaattctcc840
840
2
840
DNA
Lactobacillus gasseri KC26
加氏乳桿菌KC26
2
gctgactcct ataaaggtta tcccaccggc tttgggtgtt acagactctc atggtgtgac60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta120
gcgattccag cttcgtgtag gcgagttgca gcctacagtc cgaactgaga acggctttca180
gagatccgct tgccttcgca ggttcgcttc tcgttgtacc gtccattgta gcacgtgtgt240
agcccaggtc ataaggggca tgatgacttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca300
ccggcagtct cattagagtg cccaacttaa tgatggcaac taatgacaag ggttgcgctc360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacagccatg caccacctgt420
ctcagcgtcc ccgaagggaa ctcctaatct cttaggtttg cactggatgt caagacctgg480
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg540
tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt600
agctgcagca ctgagaggcg gaaacctccc aacacttagc actcatcgtt tacggcatgg660
actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagcctcagc gtcagttgca720
gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt ccaccgctac780
acatggagtt ccactctcct cttctgcact caagttcaac agtttctgat gcaattctcc840
840
3
20
DNA
Artificial Sequence人工序列

gaT-950 forward primer
gaT-950正向引物
3
ggagtaggtg gagcgacagt 20
4
20
DNA
Artificial Sequence人工序列

gaT-1075 reverse primer
gaT-1075反向引物
4
tccaccagta gctgccgtta 20
5
110
DNA
Artificial Sequence人工序列

gassericin BNR17 gene originated from Lactobacillus gasseri BNR17
來自加氏乳桿菌BNR17的加氏菌素BNR17基因
5
tgccgttacg ccagcccatg ctattggaac atagtgtgct ccaacagagc cacaagcagg60
accgcaaact gcatttccaa gagcccgtcc agcgactgtc gctccaccta 110
6
110
DNA
Artificial Sequence人工序列

gassericin T gene disclosed in NCBI Blast Search No.AB029612
NCBI Blast檢索號AB029612公開的加氏菌素T基因
6
tgccgttacg ccagcccatg ctattggaac atagtgtgct ccaacaaagc cacaagcagg60
accgcaaact gcatttccaa gagcccatcc agcgactgtc gctccaccta 110
7
10
DNA
Artificial Sequence人工序列

primer p1
引物p1
7
agcagcgtgg10
8
10
DNA
Artificial Sequence人工序列

primer p2
引物p2
8
ggcatgacct10
9
10
DNA
Artificial Sequence人工序列

primer OPL5
引物OPL5
9
acgcaggcac10
權利要求
1.一種加氏乳桿菌BNR17菌株(保藏編號KCTC 10902BP)。
2.根據權利要求1所述的加氏乳桿菌BNR17菌株(保藏編號KCTC10902BP)，其中所述菌株包含由SEQ.ID.NO1所示的16S rRNA序列。
3.一種組合物，所述組合物包含有效劑量的權利要求1所述的加氏乳桿菌BNR17(保藏編號KCTC 10902BP)。
4.根據權利要求3所述的組合物，其中所述組合物選自食品、食品添加劑、動物飼料和動物飼料添加劑所組成的組。
5.根據權利要求4所述的組合物，其中所述動物飼料添加劑包含選自其它非致病微生物、酶及其混合物所組成的組的一種或多種。
6.一種用於預防或治療肥胖病的藥物組合物，所述組合物包含有效劑量的權利要求1所述的加氏乳桿菌BNR17(保藏編號KCTC10902BP)。
7.一種由權利要求1所述的菌株產生的細菌素肽。
8.一種編碼權利要求7所述的細菌素肽的基因。
9.根據權利要求8所述的基因，其中所述基因如SEQ.ID.NO5所示。
10.根據權利要求7所述的細菌素肽，其中所述細菌素肽由SEQ.ID.NO5所示的序列編碼。
11.一種包含權利要求8或9所述基因的重組載體。
12.一種由權利要求11所述的重組載體轉化的轉化體。
13.一種權利要求1所述的加氏乳桿菌BNR17(保藏編號KCTC10902BP)的培養液。
全文摘要
本發明涉及一種分離自人母乳的乳酸菌，更準確地說，涉及一種分離自韓國人母乳的加氏乳桿菌BNR17菌株，所述菌株具有優良的益生菌活性，例如耐酸性、膽汁酸抗性和抗菌活性，並且還具有抑制體重增加的作用。此外，本發明的加氏乳桿菌BNR17除了通過將包含在攝入食品中的單糖合成不可消化的多糖並將合成的多糖釋放出體外的抑制體重增加的作用外，還具有優良的耐酸性、膽汁酸抗性、腸吸收活性和對致病微生物具有的抗菌活性。因此，由於這些有益作用，本發明的菌株不但可以有效用於生產發酵乳、其它的發酵食品產品和動物飼料，而且可以有效用於生產抑制體重增加的活細胞產品和食品添加劑。
文檔編號C12N1/20GK101541947SQ200780029113
公開日2009年9月23日 申請日期2007年5月14日 優先權日2006年8月4日
發明者姜智姬, 庾炳一, 尹成一, 樸翰浯 申請人:株式會社百奧尼