產瓊脂酶的類芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-09-14 11:50:45

專利名稱：產瓊脂酶的類芽孢桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株經離子注入誘變得到的瓊膠酶高產菌株一類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )WL_15，及其在微生物發酵製備瓊膠酶中的應用。
背景技術：
瓊膠是一種從江籬、石花菜等紅藻中提取出來的水溶性多糖，主要由瓊膠糖和硫瓊膠兩部分組成，其中瓊膠糖是由1，3連接的β-D-半乳吡喃糖和1，4連接的3，6_內醚-a-L-半乳吡喃糖殘基反覆交替連接的鏈狀中性糖。近些年來的研究表明，瓊膠糖的降解產物，2 10聚合度的寡糖具有多種生理活性，如抗氧化活性，降血脂活性，免疫調節活性，抗過敏活性、抑制糖苷酶活性等。瓊膠酶就是能夠降解瓊膠為寡糖的酶，其在瓊膠寡糖製備方面具有特異性強、得到寡糖活性高等優點，其在分子生物學等方面也多有應用，因此，對於瓊膠酶的研究與開發具有重要的意義。瓊膠酶有兩個來源，一個來源是微生物。能夠產生瓊膠酶的微生物主要是海洋細菌，如假單胞菌屬O^eudomonas)、別單胞菌屬(Alteromonas)、類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)等；另一個來源是以海藻為食的海洋軟體動物，如從海兔(Aplysiadactylomela)、鮑魚(Haliotis coccinea)等。相比之下，微生物具有生長繁殖快，周期短，產酶活性高等特點，適合酶的大規模工業化生產，是獲得瓊膠酶的最佳來源。微生物菌種是發酵工業的基礎和關鍵，能否提高發酵工業的效率、降低產品成本，關鍵在於能否獲得高產優良的菌種。從自然界分離的野生菌種，往往存在產量低、發酵性能差等不足，需要對野生型菌株進行選育後才能改善其不足。時至今日，多種微生物育種新技術發展已取得長足發展，但誘變育種仍是大多數工業微生物育種最重要、最有效的技術，其不僅可以提高有效產物的產量，改善生物學特性和創造新品種，而且對於研究有效產物代謝途徑，繪製遺傳圖譜等方面都有一定的用途。離子注入法是最初應用金屬材料表面的改性，當被引進生物材料的誘變育種後，由於其具有較高的誘變頻率和較好的誘變效果而備受關注，也得到了越來越多的應用。離子注入生物材料後進行誘變的方法，由於其集能量沉積、質量沉積、動量傳遞過程以及粒子注入和電荷交換過程的聯合作用，引起強烈的生物學效應而能夠取得較好的誘變效果。離子注入具有變異幅度大、突變頻率較高、突變譜較廣、突變體的遺傳性能較穩定、回復突變率低的優點。

發明內容
本發明目的是提供一株瓊膠酶高產菌株——類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)WL-15，及其在製備瓊膠寡糖中的應用，較好地克服現有微生物發酵製備瓊膠酶中的發酵周期長和酶活性低的缺點。本發明採用的技術方案是一株瓊膠酶高產菌菌株——類芽孢桿菌(Paenikicillus sp.)札_15，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號CCTCCNo =M 2011；357，保藏日期2011 年 10 月 19 日。類芽孢桿菌WL-15是以從我國東海浙江省溫嶺市近海海域海水中分離出的類芽孢桿菌WL為出發菌株，經低能N+離子注入誘變選育而獲得，類芽孢桿菌WL菌株保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號=CCTCC No =M 2010049，保藏日期2010年3月12日。具體的，本發明所述的類芽孢桿菌WL-15採用以下步驟獲得(1)將出發菌株的菌體用無菌人工海水製成細胞濃度為IXlO7 IXlO8個/mL的菌懸液，塗布於培養皿中，在超淨工作檯上風乾，鏡檢細胞間無重疊後進行N+離子注入誘變。出發菌株為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )WL(CCTCC No :M 2010049)；(2)對步驟(1)塗布於培養皿中的菌體，採用能量為lOkeV，劑量為23. 4X 1014ions/cm2的N+離子注入誘變，誘變後用無菌人工海水洗脫，經無菌人工海水稀釋後，塗布於平板培養基上進行培養4 5天；(3)挑選步驟O)中平板培養基上形成凹陷較深的菌落，轉接於斜面培養基培養24 36h，接種於產酶培養基培養M 3 後，測定發酵液的瓊膠酶活力，與出發株進行比較，篩選獲得酶活最高的菌株類芽孢桿菌WL-15 ；(4)將步驟(3)篩選得到的類芽孢桿菌WL-15連續傳代5代並發酵產酶，測得各代產酶的活力，其產酶活力沒有下降，確定該菌株是產酶活力遺傳穩定。本發明類芽孢桿菌WL-15菌落具有以下特徵菌體經稀釋後接種平板培養基，30°C條件下培養M 48h，可形成直徑2 3mm的菌落，菌落呈灰白色、半透明、表面溼潤、圓形、邊緣整齊，菌落生長處，培養基明顯凹陷(見附圖1)。所述的平板培養基組成為瓊脂15 25g/L，葡萄糖1 2g/L，酵母浸出粉3 5g/L, MgSO4 · 7H20 4 5g/L, KCl 1 2g/L, FeSO4 · 7H20 0· 01 0. 03g/L, CaCl2 0. 1 0. 3g/L, NaH2PO4 0· 5 1. Og/L，溶劑為水，pH 7 8。所述的產酶培養基組成為瓊膠1 3g/L，NaNO3 3 6g/L，NaCl 10 20g/L,MgSO4 · 7H20 4 6g/L, KCl 1 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 03g/L, CaCl2O. 1 0. 3g/L,MnCl2 · 4H20 0· 1 0. 2g/L，溶劑為水，pH 7 8。本發明還涉及所述的類芽孢桿菌WL-15在微生物發酵製備瓊膠酶中的應用。所述的應用為將所述類芽孢桿菌WL-15菌種接種至適用於類芽孢桿菌的發酵產酶培養基(常規發酵培養基添加1 3g/L瓊膠即可)中，25 35°C培養M 36h，獲得含有瓊膠酶的發酵液。所得發酵液經過離心或過濾除去菌體的清液為粗酶液，可以直接應用於瓊膠寡糖的製備；也可以按照常規生化方法進行酶的分離純化，得到純化後的瓊膠酶應用於瓊膠寡糖的製備。優選的，所述發酵產酶培養基組成如下瓊膠1 3g/L，NaNO3 4 6g/L，NaCl10 20g/L, MgSO4 · 7H20 4 6g/L, KCl 1 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 03g/L, CaCl20· 1 0. 3g/L, NaH2PO4 0· 5 lg/L，MnCl2 · 4H20 0· 1 0. 2g/L，溶劑為水，pH 7 8。本發明的有益效果主要體現在(1)採用低能N+離子注入的方法進行誘變產瓊膠酶微生物，具有突變率高、操作簡單等優點；( 誘變選育得到的菌株產瓊膠酶遺傳穩定性良好，高產特性不易發生退化；C3)菌株具有產酶活力高、營養要求低和發酵周期短等優點，可應用於工業發酵製備瓊膠酶，而瓊膠酶在製備瓊膠寡糖等領域有多種用途。

圖1為平板培養基上的類芽孢桿菌WL-15菌落形態照片。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1 類芽孢桿菌WL的誘變和篩選在對類芽孢桿菌WL誘變之前，首先要對其進行純化。4°C冰箱保藏的類芽孢桿菌WL(CCTCC No =M 2010049)接種斜面培養基，於30°C恆溫培養48h，再挑取上述斜面菌體少許於裝有數十粒玻璃珠和50mL無菌人工海水的三角瓶中，三角瓶於室溫下振蕩lOmin，製得菌體懸液，細胞數為1 X IO8個/mL。酵母細胞懸液經稀釋IO6倍後，吸取0. 2mL塗布平板培養基，平板於30°C恆溫培養48h，待菌落長出後，挑取培養基凹陷較深處的菌落多個分別轉接斜面培養基，斜面於25 30°C恆溫培養36h。將不同斜面菌株轉接產酶培養基中，經30°C,200r/min條件下進行產酶發酵Mh。發酵結束後，將發酵液離心，測定上清液的瓊膠酶活力，並以出發菌株作為對照，挑取活力最高的菌株作為N+低能離子注入誘變的出發菌株。用接種環挑取少許出發菌株斜面菌體於裝45mL人工海水的三角瓶中(裝有少量玻璃珠)，充分搖勻以打散菌體。取0. ImL菌液均勻塗布於9cm平皿中，在超淨臺中風乾成為菌膜，鏡檢細胞間無重疊後，進行N+離子注入誘變。注入能量為IOkeV,注入劑量為23.4X1014ion/Cm2，之後，用ImL無菌人工海水衝洗平板得菌懸液。所述的離子注入劑為中國科學院等離子體物理研究所生產，型號為IBBe-III。將上述菌懸液稀釋IO-IO3倍後均勻塗布於平板培養基中，30°C下培養4 5d，挑選平板中凹陷較深的單菌落轉接於斜面培養基上，30°C培養3 後挑取1環菌體直接接種到產酶培養基中，30°C、200r/min條件下進行產酶發酵Mh。發酵結束後，將發酵液離心，測定上清液的瓊膠酶活力，並以出發菌株作為對照。經過初篩和復篩兩次比較，得到一株產瓊膠酶活力為47. 34U/mL的類芽孢桿菌WL_15菌株，較出發菌株提高了 53. 9%。將類芽孢桿菌WL-15菌株在斜面培養基傳代5次，每代進行產酶活力測定，結果表明各代產酶的活力相差不大，由此認為該菌株是優良的瓊膠酶產生菌株。將類芽孢桿菌WL-15遞交中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC No =M2011；357，保藏日期2011年10月19日。所述的斜面和平板培養基成分為瓊脂2g/L，酵母浸出粉10g/L，蛋白腖10g/L，NH4Cl lg/L, NaCl 20g/L, K2HPO4 · 3H20 1. 3g/L，溶劑為水，ρΗ7· 0 ；所述的產酶培養基成分為瓊脂2. 5g/L，NaNO3 4g/L，NaCl 10g/L, MgSO4 · 7H205g/L, KCl lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 02，g/L, CaCl2 0. 2g/L, NaH2PO4 0. 78g/L, MnCl2 · 4H200. 15g/L，溶劑為水，pH 7.5。所述的瓊膠酶活力測定方法為取ImL酶液，加入9mL濃度為2g/L瓊脂水溶液中，45°C下水浴振蕩酶解30min後，取ImL酶解液，用DNS法測定還原糖(以D-半乳糖為標準品繪製標準曲線)的含量。酶活定義為以Imin產生Iyg還原糖所需的酶量(mL)作為一個酶活力單位(U)，以滅活的酶液作為空白對照。實施例2 類芽孢桿菌WL-15發酵製備瓊膠酶的方法以類芽孢桿菌WL-15為菌種，優選的瓊膠酶的製備方法如下(1)將冷凍乾燥或試管斜面保藏的類芽孢桿菌WL-15菌種接種於斜面培養基，斜面於生化培養箱中培養36h。所述的斜面培養基組成為瓊脂20g/L，葡萄糖lg/L，酵母浸出粉 5g/L, NaCl 20g/L, MgSO4 · 7H20 5g/L ；KCl lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 02g/L, CaCl2 0. 2g/L，NaH2PO4 0. 78g/L，溶劑為水，pH 7. 5 ；(3)用接種環挑取步驟(1)活化培養後的類芽孢桿菌WL-15菌體至液體種子培養基中，液體種子培養基於^°C、200r/min振蕩條件下培養Mh，得到種子液；所述液體種子培養基組成為瓊脂2g/L，酵母浸出粉5g/L，蛋白腖10g/L, NaCl 20g/L, FeSO4 · 7H200. 02g/L，NaH2PO4 0. 6g/L，溶劑為水，pH 7. 0 ；(3)步驟(3)種子液以9%的體積比接種量接至液體發酵培養基，30°C、250r/min振蕩條件下培養Mh，得到含瓊膠酶的發酵液；所述液體發酵培養基組成為瓊膠2. 5g/L，NaNO3 6g/L, NaCl 15g/L, NaH2PO4 0. 6g/L，MgSO4 · 7H20 5g/L，KCl lg/L，FeSO4 · 7H20 0. 02g/L, CaCl2 0. 2g/L, MnCl2 · 4H20 0. 15g/L，溶劑為水，pH 7. 5 ；(4)將步驟(3)的含瓊膠酶發酵液於離心杯中，8000r/min、4°C條件下離心20min，傾倒出上層清液，棄去沉澱物，所得清液即為瓊膠酶粗酶液，瓊膠酶活力可達53. 27U/mL。實施例3 瓊膠寡糖的製備用pH = 7. 0、濃度為0. 2mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩衝液配製3g/L的瓊膠底物溶液(加熱溶解)，250mL三角瓶中裝40mL瓊膠底物溶液，加入5mL實施例2瓊膠酶粗酶液，三角瓶用保鮮膜封口後於45°C、200r/min振蕩條件下酶解反應120min，可得未經分離純化的瓊膠寡糖，寡糖的主要成分是新瓊四糖和新瓊六糖，寡糖的得率可達80%以上。
權利要求
1.類芽孢桿菌(Paenikicillussp. )WL_15，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號CCTCC No =M 2011357，保藏日期:2011年10月19日。
2.如權利要求1所述類芽孢桿菌WL-15在微生物發酵製備瓊膠酶中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於應用為將所述類芽孢桿菌WL-15菌種接種至適用於類芽孢桿菌的發酵產酶培養基中，25 35°C培養M 36h，獲得含有瓊膠酶的發酵液。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述發酵產酶培養基組成如下瓊膠1 3g/L, NaNO3 4 6g/L, NaCl 10 20g/L, MgSO4 · 7H20 4 6g/L, KCl 1 2g/L, FeSO4 · 7H20，0. 01 0. 03g/L, CaCl2 0· 1 0. 3g/L, NaH2PO4 0· 5 lg/L，MnCl2 · 4H20 0· 1 0. 2g/L,溶劑為水，pH 7 8。
全文摘要
本發明提供了一株經離子注入誘變得到的瓊膠酶高產菌株——類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)WL-15，及其在微生物發酵製備瓊膠酶中的應用。該菌株保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NoM2011357，保藏日期2011年10月19日。本發明的有益效果主要體現在(1)採用低能N+離子注入的方法進行誘變產瓊膠酶微生物，具有突變率高、操作簡單等優點；(2)誘變選育得到的菌株產瓊膠酶遺傳穩定性良好，高產特性不易發生退化；(3)菌株具有產酶活力高、營養要求低和發酵周期短等優點，可應用於工業發酵製備瓊膠酶，而瓊膠酶在製備瓊膠寡糖等領域有多種用途。
文檔編號C12N13/00GK102559547SQ20111043393
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者唐中秀, 應國清, 易喻, 梅建鳳, 王鴻, 陳建澍 申請人:浙江工業大學