單純皰疹病毒載體和重組病毒及宿主細胞及其藥物組合物的製作方法

2023-09-19 21:11:45

專利名稱：：單純皰疹病毒載體和重組病毒及宿主細胞及其藥物組合物的製作方法
技術領域：
：本發明是關於一種病毒載體、包括該病毒載體的重組病毒、包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的宿主細胞，以及包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的藥物組合物。具體地說，本發明是關於一種單純皰疹病毒載體、包括該病毒載體的重組病毒、包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的宿主細胞，以及包括所述病毒載體和/或所述重組病毒的藥物組合物。
背景技術：
：單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)呈球形，完整的單純皰疹病毒由核心、衣殼、被膜(Tegument)和囊膜組成。該病毒的核心含有雙鏈DNA，纏繞成纖絲巻軸。衣殼呈二十面體對稱，直徑為100納米左右，由162個殼微粒組成。衣殼由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質雙層囊膜。包括囊膜的病毒直徑為150-200納米。囊膜表面含有病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM)。單純皰疹病毒包括I型單純皰疹病毒(HerpesSimplexVirusTypeI,HSV-1)以及II型單純皰疹病毒。該病毒對宿主細胞的感染能力與單純皰疹病毒囊膜糖蛋白的立體結構有關，即囊膜糖蛋白的立體結構決定了病毒能否進入宿主細胞，以及能夠進入宿主細胞的病毒滴度。由於單純皰疹病毒能以人類細胞作為宿主細胞，並且能夠感染的人類細胞類型廣、發生意外增殖可以用抗皰疹藥物阻止、裂解期和潛伏期都不整合宿主細胞基因組插入突變危險小，因此，單純皰疹病毒已經用於腫瘤或神經系統退行性疾病的基因治療。例如，I型單純皰疹病毒F株HSV1716用於腦膠質瘤的治療(參見"HSV1716injectionintothebrainadjacenttotumourfollowingsurgicalresectionofhigh-gradeglioma:safetydataandlong-termsurvival",S.Harrow等人，GeneTherapy,11,1648-1658,2004);I型單純皰疹病毒17+株感染腫瘤細胞，通過該病毒的裂解性複製溶解腫瘤細胞而治療癌症。此外，單純皰疹病毒的編碼感染細胞多肽34.5(infectedcellpolypeptides,ICP34.5)的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因已分別被證實對人體正常細胞有害但不影響單純皰疹病毒在腫瘤細胞中的增殖，因此可以通過敲除所述三個基因中的一個或幾個製備單純皰疹病毒載體(參見"Mappingofherpessimplexvirus-1neurovimlencetogamma134.5，agenenonessentialforgrowthinculture",JChou等人，5Wewce，Vol250,Issue4985,1262-1266，1990年9月；TreatmentofMalignantGliomasUsingGanciclovir-hypersensitive,RibonucleotideReductase-deficientHerpesSimplexViralMutant,ToshihiroMineta等人，Cawcer/^earc/z54，3963-3966,1994年8月；以及CN12838030。所述單純皰疹病毒載體可以以空載體的形式感染腫瘤細胞，通過病毒載體的迅速增殖殺傷腫瘤細胞；也可以攜帶抗腫瘤外源基因(例如粒-巨噬細胞集落刺激因子)，通過病毒載體增殖和外源基因在腫瘤細胞中的表達，殺傷腫瘤細胞。然而，感染不同人種的I型單純皰疹病毒基因組具有明顯不同的限制性內切酶分解模式，即存在限制性片段長度多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)(參見"Quantitativeanalysisofgenomicpolymorphismofherpessimplexvirustype1strainsfromsixcountries:studiesofmolecularevolutionandmolecularepidemiologyofthevirus",H.Sakaoka等人，JournalofGeneralVirology,Vol75，513-527，1994)，單純皰疹病毒17+株從白色人種中分離，因此，將易於感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株，敲除編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個後所得的載體，在用於對黃色人種進行基因治療時，存在病毒感染率低、在宿主細胞中複製增殖速度慢的缺點。
發明內容本發明的第一個目的是克服現有缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因的單純皰疹病毒載體用於黃色人種基因治療時病毒感染率低、在宿主細胞中複製增殖速度慢的缺點，提供一種缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因的單純皰疹病毒載體，該病毒載體用於黃色人種基因治療時，病毒感染率高、在宿主細胞中複製增殖速度快。本發明的第二個目的是提供包括上述病毒載體的重組病毒。本發明的第三個目的是提供包括上述病毒載體和/或上述重組病毒的宿主細胞。本發明的第四個目的是提供一種包括上述病毒載體和/或上述重組病毒的藥物組合物。本發明的發明人針對易於感染白色人種的I型單純皰疹病毒17+株敲除編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個後所得的載體，在用於對黃色人種進行基因治療時，存在病毒感染率低、在宿主細胞中複製增殖速度慢的缺點，從成年中國人口角皰疹中分離出單純皰疹病毒(分類命名為單純皰疹病毒I型，拉丁文學名為//^;^S/m/tecWn^pe/，於2006年6月14日保藏至位於北京市海澱區中關村北一條13號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.1736)，並對該病毒進行了基因組全序列測定和分析，確定了該臨床分離株與I型單純皰疹病毒17+株在編碼囊膜蛋白的基因方面存在的差異。而且本發明的發明人還敲除了單純皰疹病毒編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因，得到毒性低、可以攜帶更多目的基因的單純皰疹病毒載體。本發明提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因，所述病毒載體具有囊膜蛋白，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進該病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:NO.3所示的胺基酸序列、SEQID:NO.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列、SEQID:N0.9所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l、SEQID:NO,3、SEQID:NO,5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列中的一種或幾種。本發明還提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因，所述病毒具有編碼囊膜蛋白的基因，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進該病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:NO.3所示的胺基酸序列、SEQID:N0.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列、SEQID:N0.9所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l、SEQID:NO,3、SEQID:N0.5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列中的一種或幾種。本發明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括病毒載體和目的基因，其中，所述病毒載體為本發明所述的單純皰疹病毒載體。本發明還提供了一種感染有病毒的宿主細胞，其中，所述病毒為本發明提供的病毒載體和/或重組病毒。本發明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發明提供的病毒載體和/或重組病毒。本發明提供了一種分離自黃色人種且缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因的單純皰疹病毒載體，該病毒載體對於黃色人種宿主細胞的特異性侵染率高，複製速度快，毒性低，因此可以直接用於侵染並溶解黃色人種的腫瘤細胞，也可以作為病毒載體攜帶基因藥物至黃色人種細胞內進行基因治療。此外，與現有的分離自白色人種且敲除編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因得到的I型單純皰疹病毒17+株載體相比，本發明病毒載體用於其他人種多發腫瘤細胞時，對腫瘤細胞的溶解能力更強。本發明涉及的單純皰疹病毒的分類命名為單純皰疹病毒I型，拉丁文學名為//er/7MS/m/fecWms/，於2006年6月14日保藏至位於北京市海澱區中關村北一條13號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo.1736。圖1為本發明涉及單純皰疹病毒的電子顯微鏡照片(放大52000倍)；圖2為正常人乳腺癌細胞系MCF—7培養96小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)；圖3為培養MCF—7細胞48小時後，按病毒活性顆粒/細胞數的比值(MOI)為0.1轉染本發明病毒後再培養48小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)；圖4為本發明病毒載體對人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的藥效照片；圖5為本發明病毒載體對結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤抑制作用的曲線；圖6為表達由本發明病毒載體攜帶的綠色螢光蛋白基因的人鼻咽癌細胞。具體實施例方式本發明提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因，所述病毒載體具有囊膜蛋白，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:NO.3所示的胺基酸序列、SEQID:NO.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列、SEQID:N0.9所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:N0.5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列中的一種或幾種。所述囊膜蛋白一般為糖蛋白，與病毒載體侵染宿主細胞有關，例如病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)和病毒糖蛋白D(gD)都與吸附/穿入宿主細胞有關，它們還都可以誘導宿主細胞融合，並都有誘生宿主細胞中和抗體的作用；病毒糖蛋白B(gB)、病毒糖蛋白C(gC)、病毒糖蛋白D(gD)、病毒糖蛋白G(gG)和病毒糖蛋白M(gM)都能誘生細胞毒作用。由於本發明的單純皰疹病毒載體的囊膜蛋白，例如SEQID:NO.l所示的病毒糖蛋白B、SEQID:N0.3所示的病毒糖蛋白C、SEQID:NO.5所示的病毒糖蛋白D、SEQID:N0.7所示的病毒糖蛋白G和SEQID:NO.9所示的病毒糖蛋白M中的一種或幾種，與野生型單純皰疹病毒17+敲除編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因得到的病毒載體的相應囊膜蛋白相比，發生了變異，囊膜蛋白的立體結構與宿主細胞的相應靶標(例如細胞表面受體)更吻合，因此能進入宿主細胞尤其是黃色人種宿主細胞的病毒載體更多，因而使病毒載體感染率明顯提高。組成蛋白質的20種胺基酸殘基，按照側鏈極性可以分成四類1、非極性的胺基酸如丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro);2、極性不帶電荷的胺基酸如甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、穀氨醯胺(Gln)和酪氨酸(Tyr);3、帶正電荷的胺基酸如精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His);4、帶負電荷的胺基酸如天冬氨酸(Asp)和穀氨酸(Glu)(參見"生物化學"(第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質中如果發生同屬一個類別的胺基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質結構域中所起的作用如提供正電荷或形成疏水囊袋結構的作用沒有改變，因此對蛋白質的立體結構並不會產生影響，因此仍然可以實現蛋白質的功能。例如，本領域技術人員公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser禾口Asn、Ala禾卩Val、Ser禾BGly、Tyr禾卩Phe、Ala禾卩pro、Lys禾口Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會影響蛋白質的立體結構和功能。所述同屬一個類別的胺基酸殘基取代可以發生在上述囊膜蛋白的任意一個胺基酸殘基位置上。相反，不同類別的胺基酸殘基發生取代，會使蛋白質的結構發生變化，功能出現差異。例如與單純皰疹病毒17+敲除編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因得到的病毒載體比較，本發明單純皰疹病毒載體因囊膜糖蛋白的鹼基發生了不同類別的取代，如單純皰疹病毒17+載體的病毒糖蛋白B的第79位胺基酸殘基為賴氨酸，而本發明單純皰疹病毒載體的病毒糖蛋白B的第79位胺基酸殘基為蘇氨酸，因此本發明的單純皰疹病毒載體更易感染黃色人種。對所述SEQID:NO.l所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列可以選自SEQID:NO.l中第79位為絲氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、酪氨酸或甘氨酸的胺基酸序列。對所述SEQID:N0.3所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列可以為SEQID:NO.3中第201位為穀氨酸的胺基酸序列和/或SEQID:NO.3中第295位為賴氨酸或精氨酸的胺基酸序列。對所述SEQID:NO.5所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列可以為SEQID:NO.5中第369位為賴氨酸或精氨酸的胺基酸序列。對所述SEQID:NO.7所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列可以選自SEQID:NO.7中第3位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:N0.7中第86位為天冬氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.7中第116位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:N0.7中第118位為天冬氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.7中第130位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.7中第151位為甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.7中第153位為天冬氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.7中第162位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:N0.7中第164位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:N0.7中第208位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列和第236位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.9所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列可以為SEQID:NO.9中第440位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列和/或SEQID:N0.9中第446位為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列。本發明所述胺基酸序列優選選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:NO,3所示的胺基酸序列、SEQID:NO.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列和SEQID:NO.9所示的胺基酸序列中的一種或幾種。更優選所述胺基酸序列為SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:N0.3所示的胺基酸序列、SEQID:NO.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列和SEQID:N0.9所示的胺基酸序列。本發明還提供了一種單純皰疹病毒載體，所述病毒載體缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因，所述病毒載體具有編碼囊膜蛋白的基因，其中，所述囊膜蛋白包括一種具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:NO.3所示的胺基酸序列、SEQID:N0.5所示的胺基酸序列、SEQID:N0.7所示的胺基酸序列、SEQID:N0.9所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:N0.5、SEQID:NO.7或SEQID:NO,9所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列中的一種或幾種。本領域技術人員公知，組成蛋白質的20種不同的胺基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種胺基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989，見950頁附錄D)。即由於遺傳密碼子的簡併性，決定一個胺基酸的密碼子大多不止一個，三聯體密碼子中第三個核苷酸的置換，往往不會改變胺基酸的組成，因此編碼相同蛋白質的核苷酸序列可以不同。本領域人員根據公知的密碼子表，從本發明公開的胺基酸序列，以及由所述胺基酸序列得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，完全可以推導出能夠編碼它們的核苷酸序列，通過生物學方法(如PCR方法、突變方法)或化學合成方法得到所述核苷酸序列，應用到重組技術以及基因治療當中，因此該部分核苷酸序列都應該包括在本發明範圍內。相同道理，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進行，通過修改本發明提供的核苷酸序列，得到與本發明所述囊膜蛋白功能一致的胺基酸序列。優選所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:N0.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO.6所示的核苷酸序列、SEQID:N0.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.10所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:N0.2、SEQID:N0.4、SEQID:N0.6、SEQID:NO.8或SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對所述SEQID:N0.2所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.2中第144位為胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第183位為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第186位為A、G或T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第210位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第219位為G的核苷酸序列、SEQID:NO,2中第237位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第865位為T的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第867位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1161位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:N0.2中第1410位為T、G或C的核苷酸序歹ij、SEQID:NO.2中第1513位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第1515位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2095位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2097位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2196位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2530位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.2中第2532位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:NO.2中第2562位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.4所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.4中第120位為G、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第177位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第267位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第597位為T的核苷酸序列、SEQID:NO,4中第865位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第867位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第1059位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.4中第1149位為T、G或C的核苷酸序列和SEQID:NO.4中第1368位為T、G或C的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.6所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:N0.6中第75位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第90位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第822位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第870位為G的核苷酸序列、SEQID:N0.6中第948位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第963位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1095位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1099位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1101位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.6中第1105位為A的核苷酸序列和SEQID:NO.6中第1107位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.8所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.8中第9位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第108位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第228位為A或T的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第258位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第261位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第270位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第327位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第336位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第345位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第348位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第351位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第354位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第390位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第396位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第430位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第432位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第453位為C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第459位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第472位為A的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第474位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第486位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第492位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第501位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.8中第624位為A、G或C的核苷酸序列和SEQID:NO.8中第708位為A、T或G的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.10中第27位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第136位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.IO中第138位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第315位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第489位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第609位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第618位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第643位為A的核苷酸序歹U、SEQID:NO.10中第645位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第728位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第762位為T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第784位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第786位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第954位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第966位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1320位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.10中第1338位為T的核苷酸序列和SEQID:NO.10中第1344位為A的核苷酸序列中的一種或幾種。單純皰疹病毒的立即早期基因(immediateearlyphase,IE)指病毒進入宿主細胞就立即利用宿主細胞表達(一般在l小時內)的基因，由於單純皰疹病毒載體對宿主細胞的感染能力還與該病毒載體的立即早期基因編碼的感染細胞多肽在宿主細胞中的表達豐度有關，即編碼感染細胞多肽的立即早期基因在宿主細胞中表達的豐度越高，則病毒載體在宿主細胞中的增殖速度越快。因此更優選所述病毒載體還包括一種具有促進病毒載體增殖功能的胺基酸序列，即一種立即早期基因編碼的感染細胞多肽表達豐度更高的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.ll所示的胺基酸序列、SEQID:NO.13所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.ll或SEQID:NO.13所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進病毒載體增殖功能的胺基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.ll進行一個或幾個胺基酸取代而得到的具有促進病毒載體增殖功能的胺基酸序列可以選自SEQID:NO.ll中第34位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第102位為絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第281位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.ll中第351位為精氨酸或組氨酸的胺基酸序列和SEQID:NO.ll中第360位為賴氨酸或組氨酸的胺基酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:N0.13進行一個或幾個胺基酸取代而得到的具有促進病毒載體增殖功能的胺基酸序列可以選自SEQID:NO.13中第36位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.13中第178位為賴氨酸或精氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.13中第179位為賴氨酸或組氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.13中第180位為賴氨酸或組氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.3中第181位為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或酪氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.13中第206位為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的胺基酸序列，SEQID:NO.13中第383位為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸的胺基酸序列中的一種或幾種。進一步優選所述病毒載體還包括一種具有促進病毒載體增殖功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列為SEQID:NO.ll所示的胺基酸序列和/或SEQID:NO.13所示的胺基酸序列。所述編碼囊膜蛋白的基因中，所述囊膜蛋白更優選選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:N0.3所示的胺基酸序列、SEQID:N0.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列和SEQID:NO,9所示的胺基酸序列的囊膜蛋白中的一種或幾種。進一步優選所述核苷酸序列選自SEQID:NO,2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO.6所示的核苷酸序列、SEQID:N0.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列中的一種或幾種。更進一步優選所述核苷酸序列為SEQID:NO.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:NO.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列。更優選所述病毒載體還包括一種編碼具有促進病毒載體增殖功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:NO，12所示的核苷酸序列、SEQID:N0.14所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:NO.12或SEQID:NO.14所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。其中，對所述SEQID:NO.12所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.12中第102位為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或鳥嘌呤(G)的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第306位為A、T或胞嘧啶(C)的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第570位為G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第612位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第652位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第654位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第729位為A、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第843位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO.12中第1053位為G的核苷酸序列和SEQID:NO.12中第1080位為A、T或C的核苷酸序列中的一種或幾種。對所述SEQID:NO.14所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列可以選自SEQID:NO.14中第108位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第465位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第519位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第534位為T的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第535位為A的核苷酸序列、SEQID:N0.14中第537位為A、T或C的核苷酸序列、SEQID:NO.14中第540位為A、T或G的核苷酸序列、SEQID:NO,14中第588位為T、G或C的核苷酸序列、SEQID:NO,14中第618位為A、T或C的核苷酸序列和SEQID:NO.14中第1149位為A、T或G的核苷酸序列的核苷酸序列中的一種或幾種。進一步優選所述病毒載體還包括一種編碼具有促進病毒載體增殖功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列為SEQID:N0.12所示的核苷酸序列和/或SEQID:NO.14所示的核苷酸序列。用於製備本發明所述病毒載體的單純皰疹病毒可以為核苷酸序列與NCBI中ID:NC一001806的I型單純皰疹病毒17+的核苷酸序列具有99.5%的同源性的單純皰疹病毒，二者的差別如表1所示。表1中的"變異位置"為ID:NC001806的I型單純皰疹病毒17+的全序列核苷酸的鹼基編號。表1tableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage20續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21續表ltableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage23續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage24續表ltableseeoriginaldocumentpage25續表ltableseeoriginaldocumentpage26續表ltableseeoriginaldocumentpage27續表ltableseeoriginaldocumentpage28續表ltableseeoriginaldocumentpage28續表ltableseeoriginaldocumentpage28本發明單純皰疹病毒載體不僅在侵染黃色人種宿主細胞的能力方面增強，而且用於其他人種多發腫瘤細胞時，對腫瘤細胞的溶解能力更強。本發明還提供了一種重組病毒，所述重組病毒包括病毒載體和目的基因，其中，所述病毒載體為本發明的單純皰疹病毒載體。本發明的單純皰疹病毒載體不僅可以單獨作用裂解殺傷腫瘤細胞，而且還可以通過傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細胞。本發明的單純皰疹病毒載體可以攜帶0.1-50kb的目的基因，優選攜帶10-40kb的目的基因。所述目的基因可以為抗腫瘤活性的基因，例如編碼前體藥物激活蛋白的基因、編碼腫瘤抑制蛋白的基因、編碼細胞凋亡因子(pro-apoptoticfactors)前體的基因和編碼免疫刺激蛋白的基因中的一種或幾種。所述免疫刺激蛋白可以為自身具有細胞毒性的蛋白、能夠刺激/增強抗腫瘤免疫應答的蛋白。當然本發明的病毒載體也可以用來將一種或幾種目的基因傳遞至需要其表達的細胞內，該細胞可以是非腫瘤細胞例如神經細胞，所述一種或幾種目的基因可以為編碼改變對疼痛刺激應答或緩解慢性疼痛的多肽的基因，所述多肽例如能夠隔絕例如神經生長因子、其它疼痛調節神經營養因子、神經營養因子樣分子的蛋白，物質P以及其它神經肽。所述一種或幾種目的基因也可以為編碼能夠刺激變性性疾病中損傷神經再生長或防止神經進一步變性的多肽的基因。所述目的基因還可以包括調控序列，例如所述一種或幾種目的基因表達的啟動子、終止子和增強子。所述目的基因也可以包括標記基因(例如，編碼P-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白或其它螢光蛋白的基因)或其產物調節其它基因表達的基因。所述目的基因除可以是DNA夕卜，還可以是mRNA、tRNA或rRNA，還可以包括通常與轉錄序列相關的相關轉錄調控序列，例如轉錄終止信號、聚腺苷酸化位點和下遊增強子元件。.本發明還提供了一種感染有病毒的宿主細胞，其中，所述病毒為本發明的單純皰疹病毒載體和/或重組病毒。單純皰疹病毒載體可以定義為缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因的單純皰疹病毒，與正常單純皰疹病毒一樣，也需要在宿主細胞內完成其生活史，因此所述病毒載體和重組病毒的傳代增殖以及活化需要在宿主細胞中進行。而在體外感染有本發明單純皰疹病毒載體和/或重組病毒的宿主細胞，也可以作為基因治療的藥物導入體內。所述宿主細胞可以是各種能夠培養本發明病毒載體和/或重組病毒的宿主細胞，例如非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)、原代兔腎細胞、雞胚細胞、羊膜細胞、人宮頸癌細胞(Hela細胞)以及人胚肺二倍體成纖維細胞(WI-38細胞)。本發明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發明的單純皰疹病毒載體和/或重組病毒。本發明的單純皰疹病毒載體可以單獨使用裂解殺傷腫瘤細胞；還可以攜帶目的基因製備重組病毒，所述重組病毒單獨使用通過傳遞目的基因和/或裂解殺傷腫瘤細胞。本發明的單純皰疹病毒載體和本發明的重組病毒也可以同時使用。本發明的單純皰疹病毒載體、本發明的重組病毒以及它們的混合物都還可以包括藥物可接受的載體或賦形劑，以藥物組合物的形式使用。所述藥物可接受的載體或賦形劑指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料，例如，包括但不限於鹽水、緩衝鹽液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適於胃腸外、舌下、腦池內、陰道內、直腸內、頰內、腫瘤內或表皮給藥。胃腸外給藥包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下、關節內注射和輸注。適於胃腸外給藥的藥物組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用於在臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配製的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、內二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤溼劑、乳化劑、保護劑和分散劑佐劑，例如肌醇、山梨醇和蔗糖。優選加入滲透壓調節劑如糖類、氯化鈉、氯化鉀。表皮給藥包括在皮膚、黏膜上以及在肺和眼表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。直腸或陰道給藥的組合物優選為栓劑，它可以通過將本發明的載體與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合製備，所述賦形劑或載體在室溫為固態，在體溫下為液態，因此在直腸或陰道腔內熔化並釋放出活性化合物。優選所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的載體和本發明提供的單純皰疹病毒載體和/或重組病毒，每毫升所述注射液中含有10(2)-10(10)空斑形成數的所述病毒載體和/或重組病毒。所述藥學上可接受的載體可以為pH值為4.0-9.0的磷酸緩衝液。所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為0.01-30重量％，所述保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀。使用所述注射液進行時，給予的病毒量範圍為103-101空斑形成數(pfti)、優選105-108pfo、更優選106-108pfb。當注射本發明所述藥用組合物時，注射用量可以為本領域常用的劑量，至多500微升、一般1-200微升、優選1-10微升；但是根據所述腫瘤和接種部位，也可以使用至多10毫升的劑量。因為本領域技術人員能夠容易地確定最佳給藥途徑和劑量，所以所述給藥途徑和劑量僅作為參考。所述劑量可以根據各種參數、尤其根據待治療患者的年齡、體重和病症、疾病或病症的嚴重程度以及給藥途徑來確定。此外，對於癌症患者優選的給藥途徑是直接注射到腫瘤內。本發明所述藥物組合物注射液也可以系統給藥，也可以將本發明的藥物組合物注射液注射到為腫瘤供血的血管內給藥。最優選給藥途逕取決於所述腫瘤的位置和大小。下面結合實施例進一步說明本發明，除非特別說明，本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。實施例1本實施例說明本發明單純皰疹病毒載體的製備。(1)病毒的採集成年中國男性，37歲，漢族，多次口角皰疹反覆發作病史，無其他疾病，呈典型I型單純皰疹病毒復發感染臨床表現——口角周圍出現皰疹樣水泡兩天後取樣。取15毫升的無菌離心管，盛有3毫升無菌的含100微克/毫升卡那黴素的磷酸鹽緩衝液(PBS)，所述緩衝液中含有9克/升的NaCl、0.21克/升的KH2P04以及0.97克/升的Na2HP04.12H20;用無菌棉籤擠壓皰疹樣水皰至淡黃色分泌物流出，然後用棉籤蘸取該分泌物，將所得棉籤帶有分泌物的一端在上述PBS緩衝液中涮洗10秒鐘。取出棉籤，用滅菌微量加樣器將所得含有分泌物的緩衝液吹吸均勻。(2)病毒的接種、培養和純化用含10X胎牛血清的DMEM培養基，在六孔細胞培養板上以5X105個細胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)，37'C下在5XC02培養箱中培養24小時，至每孔Vero細胞長滿80X。然後在無菌環境下，向上述六孔細胞培養板的每孔中加入200微升的(1)得到含有分泌物的PBS緩衝液(採樣後l小時完成接種)。繼續在5XC02培養箱中37'C下培養24小時後，在無菌環境下，在光學顯微鏡下以100倍的放大倍數觀察Vero細胞，發現病毒噬斑;用滅菌微量加樣器吸取單個的病毒噬斑10微升，將10微升吸取的液體混入100微升的DMEM培養基中，並用微量加樣器將所得含有病毒的DMEM培養基吹吸均勻。在無菌環境下，向另外一個長滿80XVero細胞的六孔細胞培養板的每孔中加入上述得到含有純化病毒的DMEM培養基，感染該Vero細胞。在5%(^02培養箱中37'C下培養獲得純化的本發明單純皰疹病毒。(3)病毒的生物學特性分析如圖1所示，52000倍電鏡下觀察到(2)純化的病毒具有典型的單純皰疹病毒形態衣殼呈二十面體對稱，直徑為100納米左右。衣殼外由厚薄不勻的被膜覆蓋。病毒最外層為典型的脂質雙層囊膜，包括囊膜的病毒直徑為150至200納米。此外發明人委託杭州華大基因公司還對(2)純化的病毒進行了全基因組測序，測序結果如上述表l所示，所得病毒與NCBI中編號為ID:NC—001806的1型單純皰疹病毒17+的序列同源性為99.5%。本發明的發明人對得到的全基因組序列進行了分析，得到如SEQID:N0.2、SEQID:NO,4、SEQID:N0.6、SEQID:N0.8，以及SEQID:NO.10所示的編碼囊膜蛋白的基因核苷酸序列，並由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.l(病毒糖蛋白B)、SEQID:NO.3(病毒糖蛋白C)、SEQID:NO.5(病毒糖蛋白D)、SEQID:NO.7(病毒糖蛋白G),以及SEQID:NO.9(病毒糖蛋白M)所示的囊膜蛋白的胺基酸序列。通過與ID:NCJ)01806的相應基因比對，發現(2)得到的純化病毒編碼囊膜蛋白的基因核苷酸序列存在變異。此外還得到了如SEQID:N0.12以及SEQID:NO,14所示的編碼感染細胞多肽的立即早期基因的核苷酸序列，並由所述核苷酸序列得到如SEQID:NO.ll(感染細胞多肽a22)以及SEQID:NO.13(感染細胞多肽a27)。(4)編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的敲除。按照CN1283803C記載的方法，分別敲除編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因，得到如表2所示的一組單純皰疹病毒載體。表2tableseeoriginaldocumentpage33實施例2本實施例說明本發明的單純皰疹病毒載體對黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)的溶解能力。(1)單純皰疹病毒載體滴度的測定用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在7個六孔細胞培養板上以5X105個細胞/孔的密度接種非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)(美國ATCC)，37'C下在5%(302培養箱中培養24小時，至每孔Vero細胞長滿80%備用。無菌條件下，收集分別培養有實施例1表2所示7種單純皰疹病毒載體的Vero細胞培養物的上清培養液，用不含血清的DMEM培養基分別梯度稀釋成1X12倍液、1X103倍液、1X14倍液、1X105倍液、1X16倍液以及1X107倍液，每種稀釋液各100微升。無菌條件下，棄去上述六孔細胞培養板上培養好的Vero細胞培養物中含10X胎牛血清的DMEM培養基，然後每孔加入上述稀釋用的不含血清的DMEM培養基1毫升，接著將上述製得的6個濃度的一種病毒載體稀釋液分別加入6個孔中，每孔100微升。每種病毒載體加在一個六孔細胞培養板上，共得到7個加有病毒載體的六孔細胞培養板。轉染有病毒載體的Vero細胞六孔培養板置於5XC02培養箱中37'C下培養1小時，無菌條件下棄去孔中的培養基，每孔中加入2毫升羧甲基纖維素培養基(將羧甲基纖維素粉末與PBS溶液按照重量體積比2:125混合後，在4"C冰箱保存12小時，溶解完全後121.3t:滅菌30分鐘，無菌條件下，將所得無菌1.6重量體積％的羧甲基纖維素PBS溶液與含10Q%FBS的DMEM按體積1:2混合製得)。置於5%(:02培養箱中37"C下培養48小時後，棄去培養液，用PBS溶液將細胞潤洗2次，棄去PBS溶液，加入2毫升含有0.1體積％的戊二醛(美國Sigma)的PBS溶液，25"C下放置10分鐘。再次將細胞用PBS溶液潤洗兩次，棄去PBS溶液，加入l毫升0.1重量體積％的結晶紫溶液(用20體積%乙醇作為溶劑配製)，25。C下放置IO分鐘。用純淨水潤洗細胞兩次，用吸水紙擦乾六孔板背面的水，將六孔板置於100倍光學顯微鏡下觀察，計數空斑。計算得出如表3所示每毫升病毒載體原液形成的空斑數，即病毒載體原液的滴度，單位為空斑形成單位/毫升(pfWml)。表3tableseeoriginaldocumentpage35(2)人鼻咽癌細胞的培養37。C下在5XC02培養箱中用6毫升含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養接種在25平方釐米的培養瓶中的CNE-1細胞(購自中科院上海細胞研究所)48小時，用放大100倍的倒置顯微鏡CNE-1細胞處於對數生長期。無菌條件下，加入0.25°/。的胰蛋白酶1毫升，在37。C下消化所述處於對數生長期的CNE-1細胞5分鐘。用倒置顯微鏡觀察CNE-1細胞在培養基溶液中游離後，加入新鮮培養基稀釋成1乂104個/毫升的細胞懸液，微量進樣器吹打均勻後加入96孔板中，每孔加IOO微升細胞懸液，在37"C、5%(:02培養箱中繼續培養24小時。(3)病毒載體的轉染以及人鼻咽癌細胞存活率的測定用已知滴度的步驟(1)的單純皰疹病毒載體原液，按照步驟(1)的方法以感染複數(multiplicityofinfection,MOI)為0.1轉染上述培養的CNE-1細胞。其中對照孔加入與病毒原液等體積的含1。/。小牛血清DMEM培養基。對照孔CNE-1細胞和被轉染的CNE-1細胞都在37-C下5°/^02培養箱中培養，並分別在轉染後24小時、48小時和72小時用MTT法(具體方法記載在"測定細胞存活和增殖的MTT方法的建立"，鄭永唐等人，免疫學雜誌，1992年，第8巻，第4期，第266-269頁)測定細胞存活率。用型號為DG-3022的酶聯免疫儀(華東電子管廠製造)在570納米下測定OD值，細胞存活率由下式計算細胞存活率=(轉染孔光吸收值/對照孔光吸收值)xioo%。細胞存活率的測試結果見表5。對比例1本對比例說明現有技術的單純皰疹病毒載體對黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)的溶解能力。按照實施例1的方法，以單純皰疹病毒17+製備7種單純皰疹病毒載體，缺失基因情況如表4所示。表4tableseeoriginaldocumentpage36按照實施例2的方法，以相同病毒載體滴度的單純皰疹病毒17+轉染黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)(購自中科院上海細胞研究所)，在同樣的條件下培養轉染的CNE-1細胞，並按照實施例2的方法測定CNE-1細胞的存活率，測定結果見表5。tableseeoriginaldocumentpage36從表5可以看出，轉染本發明單純皰疹病毒載體的CNE-1細胞的存活率大大低於轉染現有技術單純皰疹病毒17+載體的CNE-1細胞的存活率，而CNE-1細胞為典型的黃色人種多發人鼻咽癌的腫瘤細胞，說明本發明的病毒載體，相對於現有技術的單純皰疹病毒17+載體而言，特異性對黃色人種的腫瘤細胞的溶解能力更強。實施例3本實施例說明本發明的單純皰疹病毒載體對一般腫瘤細胞的溶解能力。按照實施例2的方法，用本發明的單純皰疹病毒載體分別在兩種不同的感染複數(MOI=0.1和MOI=l)下轉染人乳腺癌細胞MCF-7、人結腸癌細胞HT-29和人肺腺癌細胞A549(購自軍事醫學科學院第二研究所)，並測試轉染後不同時間點腫瘤細胞的存活數，結果如表6所示。對比例2本對比例說明現有技術的單純皰疹病毒17+載體對一般腫瘤細胞的溶解能力。按照實施例2的方法，用單純皰疹病毒17+載體分別在兩種不同的感染複數(MOI=0.1和MOI=l)下轉染人乳腺癌細胞系MCF-7、人結腸癌細胞系HT-29和人肺腺癌細胞系A549，並測試轉染後不同時間點腫瘤細胞的存活數，結果如表6和表7所示。表6tableseeoriginaldocumentpage38從表6和表7可以看出，無論在低感染複數(MOI=0.1)還是高感染複數(MOI=l)的情況下，轉染本發明單純皰疹病毒載體24小時的三種腫瘤細胞系的存活率都大大低於轉染現有技術單純皰疹病毒17+載體的三種腫瘤細胞系的存活率，說明本發明的病毒載體對一般腫瘤細胞的溶解能力也好於現有技術的單純皰疹病毒17+載體。此外，圖2展示了正常人乳腺癌細胞系MCF—7培養96小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)，從圖2可以看出，正常人乳腺癌細胞系MCF—7培養96小時後，細胞結構完整，密集生長排列；圖3展示了培養MCF—7細胞48小時後，按病毒活性顆粒/細胞數的比值(MOI)為0.1轉染本發明病毒載體後再培養48小時的生長情況光學顯微鏡照片(放大400倍)，從圖3可以看出，多數細胞結構遭到破壞，細胞數目大大減少。從兩張照片對比可以看出，本發明的單純皰疹病毒載體對一般腫瘤細胞都具有更強的溶解能力。實施例4本實施例說明本發明提供的重組病毒及其製備方法。按照CN1283803C記載的方法，向實施例1中得到的病毒載體7中，分別在編碼感染細胞多肽34.5(infectedcellpolypeptides,ICP34.5)的基因位置上插入由hCMV的IE啟動子引導的人類GM-CSF基因、編碼感染細胞多肽6的基因位置上插入由MMLV啟動子引導的編碼綠色螢光蛋白的基因和編碼感染細胞多肽47的基因的基因位置上插入由RSV啟動子引導的編碼紅色螢光蛋白的基因。所述基因的序列可以在NCBI資料庫中查到，用得到的重組病毒按照實施例2的方法，以感染複數為0.1轉染人鼻咽癌細胞。轉染後24小時可以在100倍光學顯微鏡下觀察到如圖6所示的，表達綠色螢光蛋白的人鼻咽癌細胞。收集轉染後24小時、48小時和72小時的六孔細胞培養板中的上清液，用型號為DG-3022的酶聯免疫儀(華東電子管廠製造)在450納米下，按照ELISA試劑盒說明書(BDOptEIAsethumanGM-CSF，CatalogNo:555126、綠色螢光蛋白試劑盒和紅色螢光蛋白試劑盒)，分別測定人GM-CSF、綠色螢光蛋白以及紅色螢光蛋白在人鼻咽癌細胞中的表達量，結果如表8所示。對比例3按照實施例4所述的方法，不同的是用對比例2得到單純皰疹病毒17+載體G製備重組病毒，收集轉染後24小時、48小時和72小時的六孔細胞培養板中的上清液，用型號為DG-3022的酶聯免疫儀(華東電子管廠製造)在450納米下，按照ELISA試劑盒說明書(BDOptEIAsethumanGM-CSF，CatalogNo:555126、綠色螢光蛋白試劑盒和紅色螢光蛋白試劑盒)，分別測定人GM-CSF、綠色螢光蛋白(GFP)以及紅色螢光蛋白(RFP)在人鼻咽癌細胞中的表達量，結果如表8所示。表8tableseeoriginaldocumentpage40從表8可以看出，轉染本發明重組單純皰疹病毒24小時的黃色人種腫瘤細胞中目的基因的表達量，都大大高於轉染現有技術重組單純皰疹病毒17十的表達量，說明本發明的重組病毒感染黃色人種腫瘤細胞的能力更強。實施例5本實施例說明含有本發明病毒載體的藥物組合物及其製備方法。(1)注射液的配製將按照表9所示的劑量分別配製一組磷酸鹽緩衝液，121"C下滅菌60分鐘。在無菌條件下，以0.45微米的微孔濾膜過濾實施例2的步驟(1)已知滴度的單純皰疹病毒載體7原液，或者以0.45微米的微孔濾膜過濾按照實施例4所述的方法在單純皰疹病毒載體7編碼ICP34.5的基因位置上插入由hCMV的IE啟動子引導的人類GM-CSF基因的重組細胞原液(重組細胞原液的滴度按照實施例2的方法測定)去除細胞碎片，收集濾液至無菌離心管中，8000轉/分離心1小時，棄去上清，按照表9所示的病毒滴度，將所得病毒載體或重組病毒沉澱分散在上述高溫滅菌後的磷酸緩衝液中，即得兩組(分別包括病毒載體和重組病毒)本發明注射液。表9tableseeoriginaldocumentpage41本實施例中，陰性對照藥物為不含病毒的滅菌磷酸緩衝液；陽性對照藥物為注射用環磷醯胺(CTX)，批號050202，規格200毫克/支，上海華聯製藥有限公司生產。(2)細胞水平藥效學實驗按照實施例2的方法，以感染複數MOI=l的病毒注射液感染黃色人種多發的人鼻咽癌細胞(CNE-1)。結果如表10所示。表10tableseeoriginaldocumentpage41從表10可以看出，本發明的注射液對黃色人種多發的CNE-1細胞具有顯著的殺傷作用，陽性對照藥能在24小時內殺死腫瘤細胞，但是陽性對照藥對正常細胞的毒性也很大。此外，從表IO還可以看出，重組病毒對腫瘤的殺傷能力強於病毒載體對腫瘤細胞的殺傷能力，進而說明含有本發明重組病毒的藥物組合物不僅具有溶瘤作用，並且可以在被重組病毒轉染的細胞內表達目的基因。(3)人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長的抑制作用藥效學實驗人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤購自中國醫學科學院藥物研究所，Balb/c裸鼠，4-6周齡，16-20克，雌性，購自中國醫學科學院實驗動物中心。傳代荷瘤鼠皮下腫瘤生長至直徑約2-3釐米時，無菌條件下取出瘤塊，按照每克腫瘤組織3-4毫升生理鹽水的比例，製成腫瘤細胞勻漿，給予每隻小鼠右前肢腋部皮下接種0.2毫升；或者將瘤塊切割成1立方釐米的小瘤塊，用套管針接種到裸鼠右側腋部皮下。待各組動物接種的腫瘤生長到動物體表能觀察到約0.6釐米X0.6釐米的腫塊時，隨機分16組(本發明配方14組、陽性對照組、陰性對照組)，每組7隻開始用步驟(1)的本發明病毒注射液以及陽性對照藥物、陰性對照藥物腫瘤瘤體內局部注射給藥。於第1天、第4天和第7天瘤內注射，注射容積為100微升。本發明步驟(1)病毒載體或重組病毒的給藥劑量為2.5X107pfU/kg，陽性對照藥為環磷醯胺，陽性對照藥的給藥劑量為100mg/kg，陰性對照藥為與本發明病毒注射液等體積的磷酸緩衝液。最後一次給藥後，每周稱體重，測定動物體表能觀察到的腫瘤體積，繼續觀察2周左右，腫瘤體積變化曲線見圖5(本發明病毒載體7+配方2)，然後頸部脫臼處死動物，剝離取出瘤塊稱重，可得出腫瘤抑制率-10(^/。X本發明病毒注射液組或陽性對照藥組平均瘤塊重量/陰性對照藥平均瘤塊重量，結果見表ll。圖4為陰性對照藥(第一行)、陽性對照藥(第二行)、本發明病毒載體7配方2注射液(第三行)以及本發明重組病毒配方2注射液(第四行)所取出的瘤塊照片，空白位置的小鼠死亡。表11tableseeoriginaldocumentpage43從表11和圖4、圖5可以看出，本發明病毒載體和重組病毒對人結腸腺癌HT-29裸鼠移植瘤生長有明顯的抑制作用，本發明組的抑制率範圍為28.0%-77.0%，雖然陽性對照藥的抑制率對腫瘤的抑制作用也很明顯，但是陽性對照藥的死亡率很高，因而本發明的病毒載體或重組病毒的注射液更安全。此外，從表11還可以看出，含有重組病毒的注射液表達了抗腫瘤的GM-CSF，因此其對腫瘤的殺傷能力強於含有病毒載體的注射液。SEQUENCELISTING北京奧源和力生物技術有限公司單純皰疹病毒載體和重組病毒及宿主細胞及其藥物組合物I71990YH14PatentInversion3.41904PRT單純皰疹病毒I型(HerpesSimplexVirusTypeI)1MetArgGinGlyAlaProAlaArgGlyArgArgT卬Phe1510ValValTrp15AlaLeuLeuGlyLeuThrLeuGlyValLeuValAlaSerAlaAlaPro202530SerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsn354045GlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaProGlyProAlaProThr505560Gly65ProAspArgProProLysAlaProGly85Arg70AspLysAsnAsnAlaLysLysThrVal90ProLysPro75AlaAlaGlyProThrPro80HisAlaThr95LeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsn100105110PheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGlu115120125GinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGlu130135140GlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLys145150155160AlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGly165170175HisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProVal180185190ProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArg195200205SerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHis210215220ArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAla225230235240ThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnPro245250255SerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslie260265270ValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheVal275280285LeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArg290295300GluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLys305310315320GinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAla325330335ThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrVal340345350AlaT卬AspT卬ValProLysArgProSerValCysThrMetThrLys355360365TrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPhe370375380ArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThr385390395400GluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAsp405410415AlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThr420425430HislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPhe435440445formulaseeoriginaldocumentpage46ThrVallieHisAlaAspAlaAsnAlaAlaMetPheAlaGlyLeuGly725730735AlaPhePheGluGlyMetGlyAspLeuGlyArgAlaValGlyLysVal740745750ValMetGlylieValGlyGlyValValSerAlaValSerGlyValSer755760765SerPheMetSerAsnProPheGlyAlaLeuAlaValGlyLeuLeuVal770775780LeuAlaGlyLeuAlaAlaAlaPhePheAlaPheArgTyrValMetArg785790795800LeuGinSerAsnProMetLysAlaLeuTyrProLeuThrThrLysGlu805810815LeuLysAsnProThrAsnProAspAlaSerGlyGluGlyGluGluGly820825830GlyAspPheAspGluAlaLysLeuAlaGluAlaArgGluMetlieArg835840845TyrMetAlaLeuValSerAlaMetGluArgThrGluHisLysAlaLys850855860LysLysGlyThrSerAlaLeuLeuSerAlaLysValThrAspMetVal865870875880MetArgLysArgArgAsnThrAsnTyrThrGinValProAsnLysAsp885890895GlyAspAlaAspGluAspAspLeu90022715DNA單純皰疹病毒I型(He卬esSimplexVirusTypeI)2atgcgccagggcgcccccgcgcgggggcgccggtggttcgtcgtatgggcgctcttgggg60ttgacgctgggggtcctggtggcgtcggcggctccgagttcccccggcacgcctggggtc120gcggccgcgacccaggcggcgaatgggggccctgccactccggcgccgcccgcccctggc180cccgccccaacgggggacccgaaaccgaggaagaacaaaaaaccgaaacccccaacgccg240ccgcgccccgccggcgacaacgcgaccgtcgccgcgggccacgccaccctgcgcgagcac300ctgcgggacatcaaggcggagaacaccgatgcaaacttttacgtgtgcccaccccccacg360ggcgccacggtggtgcagttcgagcagccgcgccgctgcccgacccggcccgagggtcag420aactacacggagggcatcgcggtggtcttcaaggagaacatcgccccgtacaagttcaag480gccaccatgtactacaaagacgtcaccgtttcgcaggtgtggttcggccaccgctactcc540cagtttatggggatctttgaggaccgcgcccccgtccccttcgaggagg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一種具有促進該病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列，所述胺基酸序列選自SEQID:NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:NO.3所示的胺基酸序列、SEQID:NO.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO,7所示的胺基酸序列、SEQID:N0.9所示的胺基酸序列，以及對所述SEQID:NO.l、SEQID:N0.3、SEQID:NO,5、SEQID:NO.7或SEQID:NO.9所示的胺基酸序列進行一個或幾個胺基酸取代、添加或缺失而得到的具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列中的一種或幾種。4、根據權利要求3所述的病毒載體，其中，所述胺基酸序列選自SEQID-NO.l所示的胺基酸序列、SEQID:N0.3所示的胺基酸序列、SEQID:NO.5所示的胺基酸序列、SEQID:NO.7所示的胺基酸序列和SEQID:NO.9所示的胺基酸序列中的一種或幾種。5、根據權利要求3所述的病毒載體，其中，所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:NO.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列、SEQID:NO.10所示的核苷酸序列，以及對所述SEQID:N0.2、SEQID:N0.4、SEQID:N0.6、SEQID:NO.8或SEQID:NO.10所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的編碼蛋白不變的核苷酸序列中的一種或幾種。6、根據權利要求5所述的病毒載體，其中，所述編碼囊膜蛋白的基因包括一種編碼具有促進病毒載體侵染宿主細胞功能的胺基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID:NO.2所示的核苷酸序列、SEQID:N0.4所示的核苷酸序列、SEQID:N0.6所示的核苷酸序列、SEQID:NO.8所示的核苷酸序列和SEQID:NO.10所示的核苷酸序列中的一種或幾種。7、一種重組病毒，所述重組病毒包括病毒載體和目的基因，其特徵在於，所述病毒載體為權利要求1-6中任意一項所述的病毒載體。8、一種感染有病毒的宿主細胞，其特徵在於，所述病毒為權利要求1-6中任意一項所述的病毒載體和/或權利要求7所述的重組病毒。9、一種藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物包括權利要求1-6中任意一項所述的病毒載體和/或權利要求7所述的重組病毒。10、根據權利要求9所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的載體以及權利要求1-6中任意一項所述的病毒載體和/或權利要求7所述的重組病毒，每毫升所述注射液中含有102-101空斑形成數的所述病毒載體和/或重組病毒。11、根據權利要求IO所述的藥物組合物，其中，所述藥學上可接受的載體為pH值為4.0-9.0的磷酸緩衝液。12、根據權利要求IO所述的藥物組合物，其中，所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為0.01-30重量％，所述保護劑選自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀。全文摘要本發明提供了一種分離自黃色人種、缺失編碼感染細胞多肽34.5的基因、編碼感染細胞多肽6的基因和編碼感染細胞多肽47的基因中的一個或幾個基因的單純皰疹病毒載體，該病毒載體對於黃色人種宿主細胞的特異性侵染率高，複製速度快，毒性低，因此可以直接用於侵染並溶解黃色人種的腫瘤細胞，也可以攜帶基因藥物至黃色人種細胞內進行基因治療。文檔編號C12N15/33GK101376892SQ200710120848公開日2009年3月4日申請日期2007年8月28日優先權日2007年8月28日發明者琦李,李巍東,李秉珅,超田申請人:李小鵬