一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法

2023-09-19 18:07:40 2

一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法
【專利摘要】本發明公開了一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，包括如下步驟：(1)取新鮮的液體樣品；(2)先將液體樣品進行程序降溫貯藏：在13～17℃下貯藏1～2h，然後將溫度降至3～7℃貯藏1～2h；(3)將液體樣品升溫至35～40℃，立即進行脈衝電場處理。本發明能在較低的脈衝電場強度下達到有效殺滅單增李斯特菌的效果，更加高效，安全，節能。
【專利說明】一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及食品非熱加工領域，特別涉及一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法。

【背景技術】
[0002]脈衝電場殺菌高壓脈衝電場殺菌(PEF)作為一種非熱殺菌技術，與傳統的熱加工相比，以其能夠很好地保持食品營養成分、色澤、風味，有效延長食品的貨架期等特點備受關注，是一種非常有前景實現工業化應用的食品非熱加工技術。目前人們就脈衝電場對微生物的殺菌效果方面已有了大量深入的研究，並證實脈衝電場對微生物的營養體細胞均有較好的殺滅作用，但對脈衝電場抗性較高的單增李斯特菌，芽孢的殺滅效果不十分理想。
[0003]研究表明脈衝電場對微生物的殺滅作用主要作用位點為微生物的細胞膜，廣泛認可的機理為:由鑲嵌蛋白質的磷脂雙分子層構成的微生物細胞膜，它帶有電荷，具有一定的通透性和機械強度。膜的內外表面間具有一定的電勢差，當細胞膜上外加一個電場時，這個電場將使膜內外的電勢差增大。由於細胞膜兩表面堆積的異號電荷相互吸引，引起膜的擠壓；當電場強度增大到一個臨界值時，細胞膜的通透性劇增，壁上出現許多小孔，使膜的強度降低；電場強度進一步增大使細胞膜產生不可修復的大穿孔，使細胞組織破裂、崩潰，導致微生物失活，從而達到滅菌的效果。
[0004]單增李斯特菌是一種短小的革蘭氏陽性無芽胞桿菌，具有強嗜冷性，其最適生長溫度為37°C，但其生存環境可塑性大，能在2-42°C下生存、繁殖，是一種人畜共患病的致病菌，該菌在自然界中廣泛存在，土壤是主要的貯主，各種野生和家養動物以及健康人群被認為是該菌的攜帶者，家庭環境和多種食品均可被汙染，如果汁，牛奶，豆奶，液態蛋等液體食品。食品中存在的單增李斯特菌對人類的安全具有危險，該菌在4°C的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。近年來，單增李斯特菌在法國、美國、加拿大等國曾多次引起食物中毒，輕者為一般胃腸炎症狀，重症者主要表現為敗血症、腦膜炎、神經症狀及單核細胞增多等，臨床死亡率高達20% -70%，因此引起了世界各國的高度關注。
[0005]已有研究表明，微生物細胞膜作為微生物與外界交流的屏障，保持穩定適宜的流動性，為微生物生長及與外界環境進行物質，能量的交換，對維持其正常功能是十分重要的。為適應特殊的生長環境衝擊，如溫度，滲透壓，酸鹼度等的極端變化，微生物通過調節細胞膜磷脂雙分子層中脂肪酸鏈組成，如在低於正常生長溫度的情況下，細胞膜磷脂脂肪酸鏈的不飽和脂肪酸，脂肪酸支鏈，短鏈脂肪酸的含量增加等，從而使細胞膜的流動性增加和相變溫度降低以適應低溫環境，維持細胞膜膜蛋白正常的生理功能及細胞膜可溶性物質正常的通透性。這種變化機制對環境的反應非常快，通常在幾小時內完成。
[0006]單增李斯特菌作為一種嗜冷，強致病菌，其對環境的適應性強。特別是對低溫的適應能力特別強。大量的研究表明單增李斯特菌對低溫的適應能力來自於其對磷脂脂肪酸鏈飽和度，支鏈數目，脂肪酸鏈長度的迅速的調節。相比其它微生物如酵母菌，金黃色葡萄球等更能適應低溫環境。Russell, Piiettman, Annous, Mastronicolis等人的研究表明，當單增李斯特菌在低於最適生長溫度(37°C )7°C培養，其C15:0/C17:0比例顯著增大，同時C18:1的比例增加。單增李斯特菌磷脂雙分子層磷脂脂肪酸鏈變化及不飽和度增加使磷脂雙分子層的相變溫度降低，從而使細胞膜在低溫下保持其正常生長所需的流動性。
[0007]中國發明專利CN1354018A公布了一種脈衝電場殺菌方法及其裝置。中國發明專利CN1014854484A公布了一種高壓脈衝電場對濃縮蘋果汁進行滅菌的方法。該方法使用5-100kV/cm的脈衝電場強度，脈衝頻率1-120HZ，脈衝數2-150個，能達到有效殺滅濃縮蘋果濁汁的有害微生物，最大限度保持食品原有的風味效果。中國專利CN101297712A公布了一種液態物料低溫電場殺菌的方法，該方法先將液態物料濃縮並降溫到其溫度介於零度和濃縮液的凍結點溫度之間，再用脈衝電場殺菌處理。其利用在電導率受溫度影響大，低溫果汁的電導率小原理，從而利用高強度脈衝電場殺菌處理過程中產生的電流小，達到減小電場處理過程中溫升對果汁品質的影響。
[0008]近年來，脈衝電場對液體食品殺菌滅酶效果，及食品品質的影響進行大量的研究，為脈衝電場殺菌技術工業化應用奠定了良好的基礎，但現行研究仍處在實驗室小規模的條件下，要實現工業化應用仍有很多的不足之處:
[0009](I)現行脈衝電場所用殺菌的場強高，高的脈衝電場強度對設備要求高，同時高的電場強度對脈衝電場設備中關鍵元件的損傷大，減低使用壽命，增加生產成本。
[0010](2)液體食品電解質含量高，從而電導率大，在高電場強度場強作用下，物料升溫大，對液體食品的品質廣生影響。
[0011](3)對脈衝電場抗性高的致病菌，單增李斯特菌、芽孢等殺滅效果不明顯。
[0012](4)脈衝電場殺菌過程中產生的潛熱沒有綜合利用。


【發明內容】

[0013]為了克服現有技術的上述缺點與不足，本發明的目的在於提供一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，能在較低的脈衝電場強度下達到有效殺滅單增李斯特菌的效果，更加高效，安全，節能。
[0014]本發明的目的通過以下技術方案實現:
[0015]一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，包括如下步驟:
[0016](I)取新鮮的液體樣品；
[0017](2)先將液體樣品進行程序降溫貯藏:在13?17°C下貯藏I?此，然後將溫度降至3?7°C|C藏I?2h ;
[0018](3)將液體樣品升溫至35?40°C，立即進行脈衝電場處理。
[0019]步驟(3)所述脈衝電場處理的參數為:
[0020]電場強度15?30kV/cm，脈衝數50?200個，頻率為100Hz，脈寬為2?100 μ S。
[0021]步驟(3)所述將液體樣品升溫至35?40°C，具體為:
[0022]在I?2min內將所述液體樣品通過熱交換器升溫至35?4(TC。
[0023]在需要多批次處理液體樣品時，將經步驟(I)?(3)處理後的上一批次的液體樣品和經步驟(I)?(2)處理後的下一批次的液體樣品泵入熱交換器，使下一批次的液體樣品升溫至35?40°C。
[0024]步驟(3)之後還包括以下步驟:
[0025](4)對脈衝處理後的液體樣品進行無菌灌裝保存。
[0026]本發明的利用單增李斯特菌嗜冷，在低溫環境下能正常生長的特性，利用冷激的預處理增強脈衝電場對單增李斯特菌的殺滅效果。其技術原理為:單增李斯特菌為適應低溫的貯藏條件，維持細胞膜正常的流動性。細胞膜磷脂的脂肪酸的結構發生相應的變化，不飽和脂肪酸、支鏈脂肪酸、短鏈脂肪酸的含量增加，從而使細胞膜流動性增加，相變溫度降低。當單增李斯特菌在低於最適生長溫度(37°C )7°C培養時，其C15:0/C17:0比例顯著增大，同時C18:l的比例增加。單增李斯特菌磷脂雙分子層磷脂脂肪酸鏈變化及不飽和度增加使磷脂雙分子層的相變溫度降低，從而使細胞膜在低溫下保持其正常生長所需的流動性。大量研究表明微生物細胞膜磷脂雙分子的相變溫度比生長溫度一般低2-5 °C。在37°C培養的單增李斯特菌其相變溫度在32-35°C之間。本發明採用程序降溫貯藏條件，使單增李斯特菌細胞膜磷脂脂肪酸鏈結構發生變化，從而相變溫度進一步減低，其中程序的降溫目的在於使其能更快的適應低溫環境，避免迅速的降溫對單增李斯特菌造成亞致死，而使其處於休眠狀態。經過冷激處理，後續升溫過程，使細胞膜的流動性對溫度的變化更為敏感。在脈衝電場處理前，提高液體樣品的溫度，使處於凝膠相的細胞膜向液晶相轉變，轉變過程中，細胞膜磷脂雙分子層變得疏鬆、厚度減小，流動性增加，疏水的脂肪酸鏈的無序度增加，細胞膜的粘彈性增加，機械強度降低。細胞膜的厚度變小，使得脈衝電場在細胞膜上的產生的跨膜電壓相應增大，細胞膜的機械強度降低，粘彈性增加，使其更容易壓縮。從而導致細胞膜穿孔的臨界跨膜電壓降低，使其在較低的脈衝電場強度下就能穿孔，使胞內物質洩漏，達到殺滅微生物的效果。
[0027]與現有技術相比，本發明具有以下優點和有益效果:
[0028](I)本發明在進行脈衝電場之前，首選進行程序降溫貯藏，先在13?17°C下貯藏l-2h，然後將溫度降至3?7°C貯藏I?2h，再將液體樣品升溫至35?40°C進行脈衝電場處理，與普通的脈衝電場殺菌相比，能在較低的脈衝電場強度下達到有效殺滅單增李斯特菌的效果，從而減低對設備的要求，及殺菌過程中的能耗。
[0029](2)本發明在需要多批次處理液體樣品時，綜合利用了脈衝電場殺菌過程產生的熱量，到達降低能耗的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為不同的處理條件下單增李斯特菌減少對數與脈衝數的關係圖。。

【具體實施方式】
[0031]下面結合實施例，對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式不限於此。
[0032]實施例1
[0033]新鮮的荔枝汁分成兩份，一份不接種單增李斯特菌，另一份接種單增李斯特菌使其數量達到1.0X107Cfu/Cm;對兩份新鮮的荔枝汁進行程序降溫貯藏:先在15°C下貯藏lh，然後在5°C下貯藏lh。然後，將荔枝汁升溫至40°C，整個升溫過程在Imin內完成；立即進行脈衝電場處理，脈衝電場處理的電參數為:電場強度30kV/cm，脈衝數200個，頻率為1000Hz，脈寬為2μ s ;經脈衝電場處理後的荔枝汁用蠕動泵入熱交換器，另外將已經過程序降溫貯藏但未經過脈衝電場處理的荔枝汁也泵入熱交換器，使已經過程序降溫貯藏但未經過脈衝電場處理的荔枝汁升溫至40°C ;經脈衝電場處理後的荔枝汁在熱交換後立即在無菌的條件下進行灌裝；已經過程序降溫貯藏但未經過脈衝電場處理的荔枝汁則進行後續的脈衝電場處理。採用熱交換器對上一批次經脈衝電場處理的荔枝汁和下一批次的需要升溫的荔枝汁進行熱交換，綜合利用了脈衝電場殺菌過程產生的熱量，到達降低能耗的效果。
[0034]同時用平板計數法測定接種單增李斯特菌的荔枝汁的單增李斯特菌的數量，測定不接種單增李斯特菌的荔枝汁的菌落總數。
[0035]為說明本發明的方法的效果，本實施例將本發明的方法與以下方法的殺菌效果進行對比:1、處理條件:不加脈衝電場、不經程序降溫貯藏過程、升溫至40°C ;2、處理條件:脈衝電場強度30kV/cm、不經程序降溫貯藏過程、在25°C下殺菌；3、處理條件:脈衝電場強度30kV/cm、經程序降溫貯藏過程、升溫至40°C殺菌。對比結果如圖1所示。可知，與未經過程序降溫貯藏預處理的脈衝電場殺菌方法相比，本實施例的經過程序降溫貯藏預處理的脈衝電場殺菌方法對單增李斯特菌的殺滅效果增加約2個對數級，當脈衝處理數為200個時，由
6.06降至4.21 ;同時溫度與脈衝電場的協同作用能有效增加李斯特菌殺滅效果，與室溫處理相比(25°C )，協同處理溫度為40°C時對李斯特菌殺滅效果增加約I個對數級，當脈衝處理數為200個時，由4.21降至3.07。
[0036]本實施例的未接種李斯特菌荔枝汁菌落總數測定結果:沒有檢出。
[0037]實施例2
[0038]新鮮的牛奶分成兩份，一份不接種單增李斯特菌，另一份接種單增李斯特菌使其數量達到1.0X 107cfU/cm ;對兩份牛奶進行程序降溫貯藏:先在15°C下貯藏lh，然後在5°C下貯藏2h。然後，用熱交換器將牛奶升溫至35°C，整個熱交換過程在Imin內完成，立即進行脈衝電場處理，脈衝電場處理的電參數為:電場強度25kV/cm，脈衝數100個，頻率為1000Hz，脈寬為40μ S。經脈衝電場處理後的牛奶用蠕動泵入熱交換器，另外將已經過程序降溫貯藏但未經過脈衝電場處理的牛奶也泵入熱交換器，使已經過程序降溫貯藏但未經過脈衝電場處理的牛奶升溫至35°C ;經脈衝電場處理後的牛奶在熱交換後立即在無菌的條件下進行灌裝；已經過程序降溫貯藏但未經過脈衝電場處理的牛奶則進行後續的脈衝電場處理。
[0039]同時用平板計數法測定接種單增李斯特菌的牛奶的單增李斯特菌的數量，測定不接種單增李斯特菌的牛奶的菌落總數。與不經程序降溫貯藏的脈衝電場殺菌方法相比，本實施例的經過程序降溫貯藏的脈衝電場殺菌方法對單增李斯特菌的殺滅效果增加3個對數級。
[0040]本實施例的未接種李斯特菌牛奶菌落總數測定結果:沒有檢出。
[0041]實施例3
[0042]新鮮的蛋液分成兩份，一份不接種單增李斯特菌，另一份接種單增李斯特菌使其數量達到1.0X 107cfU/cm ;對兩份蛋液進行程序降溫貯藏；先在15°C下貯藏2h，然後在5°C下貯藏2h。然後，用熱交換器將牛奶升溫至38°C，整個熱交換過程在1.5min內完成，立即進行脈衝電場處理，脈衝電場處理的電參數為:電場強度15kV/cm，脈衝數50個，頻率為1000Hz，脈寬為100 μ S。脈衝電場處理後的蛋液用蠕動泵入熱交換器與處理前的蛋液進行熱交換後，立即在無菌的條件下進行灌裝。
[0043]同時用平板計數法測定接種單增李斯特菌的蛋液的單增李斯特菌的數量，測定不接種單增李斯特菌的蛋液的菌落總數。
[0044]不經程序降溫貯藏的蛋液，脈衝電場處理後其單增李斯特菌數量減少至1.2X106Cfu/Cm，經過程序降溫貯藏的蛋液，脈衝電場後其單增李斯特菌數量減少至
4.3X104cfu/cmo與不經程序降溫貯藏的脈衝電場殺菌方法相比，本實施例的經程序降溫貯藏的脈衝電場殺菌方法對單增李斯特菌的殺滅效果增加約3個對數級。
[0045]本實施例的未接種李斯特菌蛋液菌落總數測定:沒有檢出。
[0046]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受所述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)取新鮮的液體樣品； (2)先將液體樣品進行程序降溫貯藏:在13?17°C下貯藏I?2h，然後將溫度降至3?7°C貯藏I?2h ; (3)將液體樣品升溫至35?40°C，立即進行脈衝電場處理。
2.根據權利要求1所述的低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，其特徵在於，步驟(3)所述脈衝電場處理的參數為: 電場強度15?30kV/cm，脈衝數50?200個，頻率為100Hz，脈寬為2?100 μ S。
3.根據權利要求1所述的低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，其特徵在於，步驟(3)所述將液體樣品升溫至35?40°C，具體為: 在I?2min內將所述液體樣品通過熱交換器升溫至35?40°C。
4.根據權利要求1所述的低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，其特徵在於，在需要多批次處理液體樣品時，將經步驟(I)?(3)處理後的上一批次的液體樣品和經步驟(I)?(2)處理後的下一批次的液體樣品泵入熱交換器，使下一批次的液體樣品升溫至 35 ?40°C。
5.根據權利要求1所述的低溫應激強化脈衝電場殺滅單增李斯特菌的方法，其特徵在於，步驟(3)之後還包括以下步驟: (4)對脈衝處理後的液體樣品進行無菌灌裝保存。
【文檔編號】A23L2/50GK104222715SQ201410421710
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月25日 優先權日:2014年8月25日
【發明者】曾新安, 劉志偉, 韓忠, 王啟軍 申請人:華南理工大學