一種與植物耐低溫相關的基因及其應用的製作方法

2023-09-19 23:20:00 3

專利名稱：一種與植物耐低溫相關的基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其是一種與植物耐低溫相關的基因及其應用。
背景技術：
大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。低溫對大豆生長造成嚴重影響，特別是在生長後期，冷脅迫往往對大豆產量造成嚴重破壞，成為限制大豆產量提高的重要因素。長期以來，人們主要用傳統遺傳育種的方法對大豆的抗寒性進行改良，然而這種方法具有效率低、周期性長的缺點，並且隨著長期的使用其效果越來越不明顯。利用轉基因技術將抗寒相關基因轉化到大豆中是提高大豆抗寒性的一個更直接有效的途徑和必然趨勢。目前，植物抗冷機制在擬南芥中研究較多，其中研究的最為清楚的是 CBFs (CRT-binding factorl)轉錄因子，包括CBFs的上下遊發揮功能的各個基因所介導的冷信號通路(Jaglo-Ottosen et al.，1998 ；Gilmour et al.，2000)。另外，除了 CBFs 轉錄因子介導的冷信號通路外，其他獨立於CBFs轉錄因子之外的冷信號通路的研究也取得了一些進展(Zhu et al.，2004 ；Xin et al.，2007 ；Zhu et al.，2008)。大豆抗冷機理的研究相對較少，冷相關基因的克隆和功能研究相對滯後。目前，主要通過同源克隆的方法在大豆中克隆了一些冷相關的基因。這些基因主要包括一些Ap2、 bZIP、MYB、WRKY等家族的轉錄因子。Chen等通過同源搜索大豆EST資料庫得到一個含有Ap2 結構域的基因GmDREB3，其可以和乾旱應答元件DRE結合，此基因受冷誘導上調，同時此基因轉化擬南芥的過表達植株能增強對冷、乾旱、鹽等脅迫條件的抗性(Chen et al.，2008)。 Liao等以擬南芥bZIP結構域為探針對大豆EST序列搜索、拼接，最終鑑定了 4個bZIP家族的基因，其表達受到不同脅迫條件的調節，可以同ABRE元件結合併且其轉化擬南芥的過表達植株增強了對冷凍和鹽脅迫條件的抗性(Liao et al.，2008)。跑皿等通過同源比對的方法鑑定了數個含有WRKY結構域的基因，能同W-box作用元件結合，其表達受鹽、乾旱、冷等脅迫條件的調節，其轉基因過表達擬南芥植株對鹽、乾旱、冷等脅迫的抗性增加(Zhou et al.，2008)。Cheng等利用cDNA_AFLP技術在大豆胚軸中得到一個受冷上調的基因，其過表達擬南芥植株增強了對冷、乾旱和鹽的抗性(Cheng et al.，2009)。Xie等利用RACE技術得到2個trihelix家族的轉錄因子，其蛋白被定為在細胞核中表達，其過表達擬南芥植株增強了對冷、乾旱和鹽的抗性(Xie et al.，2009)。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種與植物耐低溫相關的基因及其應用。為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案如下。一種與植物耐低溫相關的基因，其具有序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。含有上述基因的重組表達載體，所用空載體為PEGAD。將目的基因插入到PEGAD的限制性內切酶Sma I和BamH I酶切識別位點之間，得
到重組表達載體。
含有上述基因的重組表達載體，所用空載體為PTCK303。將目的基因連入pTCK303上的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間， 以及SpeI和McI酶切識別位點之間，得到重組表達載體。上述基因在培育耐低溫轉基因植物中的應用。首先構建含有SEQ ID NO :1所示基因的重組表達載體，然後利用所得重組表達載體構建轉化體，再利用所得轉化體轉化目的植物，篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的與正常植物相比具有高抗寒性的轉基因植物。所述目的植物為大豆。採用上述技術方案所產生的有益效果在於發明人通過大量科學研究證明本發明的基因對植物的低溫脅迫具有應答性，證明其與植物的耐寒性具有緊密聯繫，基於此，利用現有常規基因工程方法能夠得到具有高耐寒性的轉基因植物，對提高作物的產量具有重大意義。


圖1為低溫脅迫下定量PCR檢測到的GmICTl在大豆根及葉中的表達特徵。圖2以毛狀根體系分析低溫脅迫時GmICTl在大豆根中的表達模式分析。
具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發明。本發明所使用的各種原料及各項設備均為常規市售產品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗， 結果取平均值。本發明的基因及其編碼的蛋白質，來源於大豆屬大豆(Glycine max L.)，將其命名為 GmICTl。實施例1、GmICTl基因的逆境及組織表達模式利用RT-PCR技術對GmICTl基因的逆境及組織表達模式進行分析驗證；(1)、脅迫處理實驗所用材料為威廉士82 (簡稱W^)；幼苗期脅迫材料按照以下流程進行大豆種子用70%的灑精滅菌30S，dH20衝洗6遍後播種於無菌培養皿中，皿底置2張無菌濾紙，dH20浸溼，28°C暗萌發3天。芽長至2cm時，低N水培，10，OOOlux，溫度為^TC,相對溼度為70%，培養15天，進行幼苗期脅迫處理，取材根、葉；①對照的處理直接取正常環境培養的大豆材料各組織於-80°C凍存作為對照(O小時) 』②)低溫處理幼苗期或成株期材料在4°C分別處理0. 5、3、6、12及M小時後，取其各組織，於液氮速凍，-80°C 保存備用；(2)、mRNA的分離採用Trizol法提取大豆總RNA，①先將組織剪切成小塊，放入研磨中用液氮研磨3次，將研磨好的組織50-100mg加入1. 5mL離心管中然後加入Iml RNAVzol，裂解產物應呈澄清的透明粘稠液體.室溫放置5分鐘；②加200 μ 1氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，12，000r/min，4°C離心IOmin ；③取500 μ 1上清於另一離心管，加等體積異丙醇，室溫放置lOmin，12，OOOr/min，4°C離心IOmin ；④加入Iml 75%乙醇洗沉澱， 8，000r/min，4°C離心5min，重複兩次；室溫風乾IOmin左右，加20 μ 1左右DEPC處理過的 RNase Free水(DEPC水)溶解沉澱；
(3)、反轉錄為cDNA 將提取的mRNA用!Iomega公司的反轉錄酶AMV反轉錄為 cDNA ；cDNA第一鏈的合成配置第一種混合液totalRNA,7y 1(2μ g) ；oligo dT (10 μ Μ)，3 μ 1 ；總體積 10 μ 1，PCR儀上70°C放置8min，立即置於冰上；配置第二種混合液5XBuffer，4y1 ；dNTPs(dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2. 5mmol/ L each), 4 μ 1 ； RNase inhibitor (40U/μ 1) ,0. 5μ 1 ；RNase-free 水，0· 5 μ 1 ；M-MLV (200U/ μ D反轉錄酶， μ ι ；混勻，將第二種混合液加入到第一種混合液中，每管10μ 1，pcr儀上 42°C孵育90min，然後70°C，IOmin終止反應；(4)、利用RT-PCR技術對GmICTl基因的逆境及組織表達模式進行分析驗證以上述cDNA作為模板，設計引物，以18srRNA為內參，使用TaKaRa公司出品的STOR Premix Ex TagTM進行定量PCR分析。在20 μ 1體系中加入cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0. 4 μ 1、 SYBRPrimix Ex taqTM(2X) 10μ 1, ROX Reference Dye II (50 X) 0. 4 μ 1、ddH20 6. 8 μ L· 擴增程序為95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,45cycles ；95°C 15s，60°C lmin，95°C 15s ；引物序列分別為qICTl-F 5' -AACTGGGTAATAAGTCGTTG-3，(SEQ ID NO 3)；qICTl-R 5' -CCGTAAACTGGTTGAGATC-3，(SEQ ID NO 4)；18srRNA-F 5' -CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAAT-3，(SEQ ID NO 5)；18srRNA-R 5' -ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3，(SEQ ID NO 6)；(5)、結果結果如圖1所示，橫坐標為4°C低溫處理的時間點，縱坐標為GmICTl基因的相對表達量；低溫處理0. 5小時後GmICTl基因的表達在大豆根及葉中均受到顯著誘導，低溫處理時間延長可以明顯下調GmICTl基因的表達；結果表明，GmICTl基因參與了大豆對低溫脅迫的響應過程。這樣，可以利用空載體PEGAD或pTCK303等構建含有SEQ ID NO :1所示基因的重組表達載體，然後利用所得重組表達載體構建轉化體，再利用所得轉化體轉化目的植物，篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的與正常植物相比具有高抗寒性的轉基因植物。實施例2、gmictl基因的逆境及組織表達模式利用⑶S染色技術對GmICTl基因的逆境表達模式進行分析驗證；(1)、gmictl啟動子的克隆根據ICTl的Promoter的序列(ATG上遊取1473bp，參見SEQ IDNO 2)設計引物對，根據載體PCAMBIA3301多克隆位點，引物末端分別引入EcoRI和NcoI酶切識別位點，以 CTAB法提取的大豆測序品種Williams82的DNA為模板，PCR擴增ICTl基因的啟動子；引物序列為Pro-ICTl-F-EcoRI :CGGAATTC GAATGAACGGTTTGAAGGTG(SEQ IDNO :7)；Pro-ICTl-F-NcoI :CATGCCATGG TAGTTGCGACAAGAAGGGAG(SEQID NO :8)；PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，採用上海生工膠回收試劑盒回收純化 1473bp左右的條帶；連T載體(PMD19-T)，挑陽性克隆，測序；o)、重組表達載體的構建①提取含有正確測序的ICTlPromoter序列的T載體質粒，用限制性內切酶EcoRI和NcoI酶切，回收酶切產物；②用限制性內切酶EcoRI和NcoI酶切空載體pCAMBIA3301，回收載體骨架；③用T4連接酶將步驟1的酶切產物和步驟2的載體骨架連接；④將步驟3的連接產物熱激轉化感受態DH5 α菌株，37°C過夜培養，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒pCAMBIA330I-Pmcti:⑶S ；(3)大豆材料準備及低溫處理以W82大豆品種為材料，將材料用氯氣消毒10小時後，在B5培養基上萌發4天進行毛狀根轉化，利用重組表達載體轉化農桿菌GV3101，再利用農桿菌轉化體轉化目的植物， 得到轉基因植物；外植體轉至共培培養基上生長2天後，再轉至MS/2培養基上培養，15天後，毛狀根長出，選擇發育階段接近的長度約1-2釐米的毛狀根分別在4°C處理0、3、6、12、 24小時後，取樣進行GUS染色，染色時間限定為3小時；0)、⑶S染液的配製首先配製⑶S反應緩衝液Tris Buffer，其中包括IOOmM Tris和50mM NaCl，以濃鹽酸調pH至7. 4。然後以iTris buffer配製0. 5mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按lmg/ml的濃度稱取x-glu (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10 μ 1 DMSO ( 二甲基亞碸)的比例溶解x-glu，加入1Tris buffer配製的0. 5mM K3 [Fe (CN)6]溶液定容，可加入幾滴TritonX-IOO以增強染色效果。迅速分裝後於_20°C避光保存；(5)、⑶S 染色將待測定的毛狀根取植物樣品放入⑶S反應緩衝液中，浸沒，37°C暗中保溫。每隔半小時在解剖鏡下觀察顯色效果。染色3小時後，吸出⑶S反應緩衝液，加入70%乙醇終止反應並在37°C脫色，每隔數小時更換一次；(6)、結果見圖2，其中圖 A 為轉化了 pCAMBIA3301 (Control)和 PGmICTl GUS 的大豆毛狀根中⑶S的積累量在4 °C低溫處理0. 5小時前後的對比圖片，圖B是對有⑶S積累的毛狀根佔總毛狀根數目的比率進行分析比對的結果。圖2的結果顯示，空載體 PCAMBIA3301 (Control)的轉化根中GUS積累並未受到4°C低溫處理0. 5小時的影響，而 PGmICTl: AUS的轉化根中⑶S的積累量在4°C處理0. 5小時後出現了明顯的增加；結果表明，GmICTl參與大豆根系對低溫脅迫的響應。這樣，可以利用空載體PEGAD或pTCK303等構建含有SEQ ID NO: 1所示基因的重組表達載體，然後利用所得重組表達載體構建轉化體， 再利用所得轉化體轉化目的植物，篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的與正常植物相比具有高抗寒性的轉基因植物。上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一限制條件。
權利要求
1.一種與植物耐低溫相關的基因，其特徵在於其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述基因的重組表達載體，其特徵在於所用空載體為PEGAD。
3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特徵在於將目的基因插入到PEGAD的限制性內切酶Sma I和BamH I酶切識別位點之間，得到重組表達載體。
4.含有權利要求1所述基因的重組表達載體，其特徵在於所用空載體為PTCK303。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於將目的基因連入PTCK303上的限制性內切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，以及SpeI和McI酶切識別位點之間， 得到重組表達載體。
6.權利要求1所述的基因在培育耐低溫轉基因植物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於首先構建含有SEQIDNO :1所示基因的重組表達載體，然後利用所得重組表達載體構建轉化體，再利用所得轉化體轉化目的植物，篩選陽性植株，經過三代篩選得到純合的與正常植物相比具有高抗寒性的轉基因植物。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其特徵在於所述目的植物為大豆。
全文摘要
本發明公開了一種與植物耐低溫相關的基因，其對植物的低溫脅迫具有應答性，證明其與植物的耐寒性具有緊密聯繫，基於此，利用現有常規基因工程方法能夠得到具有高耐寒性的轉基因植物，對提高作物的產量具有重大意義。
文檔編號C12N15/29GK102226192SQ20111015524
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者李東曉, 李霞, 王幼寧, 石磊, 陳亮 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所