一種用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法
2023-09-19 23:18:55
專利名稱：一種用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種裂解酶的製備方法，具體涉及一種用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法。
背景技術：
目前國內外有利用溶菌酶作為治療細菌性疾病藥物的例子，但是還沒有利用長梗木酶的裂解酶作為治療真菌性疾病的研究與文獻報導，也沒有相關的關於其製備方法的文獻的公開。
發明內容
本發明的目的在於提供一種用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法， 該方法發酵時間短、成本低；採用該方法製備的目標酶的得率高，目標酶表達量高以及目標酶的純度和酶活性高。本發明的第一個目的是通過如下技術手段來實現的一種用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，含以下步驟配製長梗木黴的發酵培養基，在發酵培養基中加入長梗木黴菌種，調節溫度為25-30°C，pH值為6. 0-7. 5，溶氧為40%_55%，進行發酵3_6天， 得長梗木黴的發酵液；將所得的長梗木黴發酵液進行分離純化，獲得長梗木黴的裂解酶。本發明所述的發酵培養基含以下重量百分含量的組分蔗糠3-8%、鼓皮 1.0-5. 5%、硫酸銨1.5-4%、磷酸二氫鉀0.5-2%、硫酸鎂0. 5-2. 5%、瓊脂1. 0-3. 0%、微量元素0. 05-0. 5%、其餘為去離子水。本發明長梗木黴的接種量為發酵培養基總體積的5-20%，長梗木黴菌種的菌濃度為 15-25%。本發明長梗木黴發酵液的分離純化包括以下具體步驟
(1)將長梗木黴發酵液離心除去懸浮菌體，採用超濾膜進行過濾，收集粗酶液；
(2)調節粗酶液溫度為-6-10°C，加入冰乙醇，混勻，靜置後，離心得沉澱物，在沉澱物中加入醋酸緩衝液溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)將濃縮粗酶液採用SartobindQ離子交換膜上樣，並用平衡緩衝液和含有NaCl 的醋酸緩衝液按線性梯度從0到100%進行洗脫，分別收集洗脫峰，對各洗脫液進行活性檢測；
(4)將各洗脫液採用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱上樣，用含有NaCl的醋酸緩衝液洗脫，收集各組分，採用HPLC檢測各收集組分的純度，收集純度大於85%的組分，即為長梗木黴裂解酶。在上述長梗木酶發酵液的分離純化步驟中
步驟(1)中離心時的溫度為0°c，離心機的轉速為3000 r/min ；超濾膜為中空纖維超濾膜，其截留分子量為lOOOODa。步驟⑵中冰乙醇的加入量為粗酶液總體積的3-3. 5倍，靜置時的溫度為4士 1°C，醋酸緩衝液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L—1，其加入量為粗酶液總體積的2-2. 5倍。步驟(3)中Sartobind Q離子交換膜上樣前用醋酸緩衝液進行平衡，平衡時採用的醋酸緩衝液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L—1 ；洗脫時的平衡緩衝液為醋酸緩衝液，其pH 為5. 8，濃度為20 mmol化―1 ；洗脫時的含有NaCl的醋酸緩衝液中NaCl的濃度為1 mol · Λ 醋酸緩衝液的PH為5. 4，濃度為20 mmol · L—1，平衡緩衝液和含有NaCl的醋酸緩衝液的體積比為1:1。步驟(4)中kphacryl S-200HR凝膠過濾柱上樣用醋酸緩衝液進行平衡，平衡時採用的醋酸緩衝液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L—1 ；洗脫時的含有NaCl的醋酸緩衝液中 NaCl的濃度為1 mol · L—1，醋酸緩衝液的ρΗ為5. 4，濃度為20 mmol. L-1。與現有技術相比，本發明具有如下優點
(1)菌體得率高，達1(Γ75克菌體溼重/L發酵液；
(2)目標酶表達量高(包括相對含量和絕對含量)，其表達量可達到10000單位/升到 18000單位/升；
(3)發酵時間短；
(4)發酵成本低；
(5)分離工藝精密，獲得產物純度高，獲得酶活高。
圖1是粗酶液經Sartobind Q離子交換的洗脫液各組分的洗脫峰洗脫順序圖； 圖2是濃縮粗酶液經kphacryl S-200HR分離獲得長梗木黴裂解酶的洗脫峰E2 ； 圖3是經分離純化後裂解酶的HPLC圖4是長梗木黴裂解酶的最適PH圖； 圖5是長梗木黴裂解酶的最適溫度圖。
具體實施例方式實施例 1
A、用於培養長梗木黴以產生長梗木黴裂解酶的發酵培養基的配方如下 蔗糠 3%、鼓皮1.0%、硫酸銨1.5%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.5%、瓊脂 1.0% 、微量元素0.05%、其餘為去離子水，以重量百分比計。B、利用上述發酵培養基製備長梗木黴裂解酶的方法如下
按上述配方配製20L發酵液(用去離子水)於發酵罐中，取長梗木黴菌種，其中長梗木酶菌種購自廣東省微生物研究所，為長梗木黴(Trichoderma Longibrachiatum Rifai) 958-11菌株進行選育獲得，經滅菌後接種菌種，菌種的接種量按發酵液體積的5%，菌濃為 15%，菌濃是指菌液離心後計算固體菌絲佔整個菌液的體積比例，同時設定溶氧水平為50%， 用氫氧化鈉和鹽酸調節PH值為7.0，其中ρΗ值可以採用酸鹼自動平衡調節，開始進行培養， 保持溫度沈士 1 °C，發酵時間為3天。發酵完畢，經分離純化，分離純化的具體步驟為
(1)將長梗木黴的發酵液於0°c，3000 r/min離心去除懸浮菌體，採用截留分子量為 10000的中空纖維超濾膜，對發酵液進行超濾收集粗酶液；(2)取粗酶液，在-6°C的條件下，按體積1:3的比例加入冰乙醇，攪拌混勻於4°C靜置， 離心得沉澱物，加入50 mL20 mmol.L—1醋酸緩衝液(pH 5.4)溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)採用SartobindQ離子交換膜，上樣前用20 mmol -L"1的醋酸緩衝液(pH 5.4)進行平衡後，取上述粗酶液上樣，用體積比為1:1的平衡緩衝液(PH為5. 4，濃度為20 mmol. L-1的醋酸緩衝液)和含有1 mol · L-1 NaCl的20 mmol · L-1醋酸緩衝液(pH 5. 4)，按線性梯度從0到100%進行洗脫，分別收集洗脫峰，對各組分進行活性檢測，如附圖1所示；
(4)採用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱，上樣品前用20 mmol化―1的醋酸緩衝液(pH 5. 4)進行平衡後，取離子交換層析得到的活性組分上樣，收集各組分；如附圖2所示；
(5)利用HPLC檢測分級收集產物純度，收集純度大於85%的組分，即為長梗木黴裂解酶；如附圖3所示；其中HPLC的流動相配製為=NaCl 8 g，L-Arg-HCl 42 g,Na2HPO4. 12H20 8g ,H2O 1000ml ；色譜柱GF-450 (agilent 9.4 X 250mm, 6 μ m)；流速1. 5 ml/min ；柱溫 25 0C ；檢測波長:280nm ；
(6)對長梗木黴裂解酶進行活性測試，觀察其去除真菌效果，具體可參見下表1。經上述分離純化步驟後，長梗木黴裂解酶的菌體的得率為30克菌體溼重/升發酵液，目標酶效價12000單位/升，純度86. 4%，其最適宜溫度和pH值如附圖4和5所示。實施例2
A、用於培養長梗木黴以產生長梗木黴裂解酶的發酵培養基的配方如下 蔗糠5%、鼓皮2. 0%、硫酸銨2. 5%、磷酸二氫鉀1. 5%、硫酸鎂1. 5%、瓊脂2. 0%、微量元素0.3%、其餘為去離子水，以重量百分比計。B、利用上述發酵培養基製備長梗木黴裂解酶的方法如下
按上述配方配製20L發酵液(用去離子水)於發酵罐中，取長梗木黴菌種，其中長梗木酶菌種由廣東省微生物研究所提供，為長梗木黴(Trichoderma Longibrachiatum Rifai) 958-11菌株進行選育獲得，經滅菌後接種菌種，菌種的接種量按發酵液體積的10%，菌濃為 20%，菌濃是指菌液離心後計算固體菌絲佔整個菌液的體積比例，同時設定溶氧水平為40%， 用氫氧化鈉和鹽酸調節PH值為7.5，其中pH值可以採用酸鹼自動平衡調節，開始進行培養， 保持溫度27 士 1 °C，發酵時間為4天。發酵完畢，經分離純化，分離純化的具體步驟為
(1)將長梗木黴的發酵液於0°c，3000r/min離心去除懸浮菌體，採用截留分子量為 10000的中空纖維超濾膜，對發酵液進行超濾收集粗酶液；
(2)取粗酶液，在-6°C的條件下，按體積1:3.5的比例加入冰乙醇，攪拌混勻於5°C靜置，離心得沉澱物，加入50 mL20 mmol. Γ1醋酸緩衝液(pH 5.4)溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)採用SartobindQ離子交換膜，上樣前用20 mmol -L"1的醋酸緩衝液(pH 5.4)進行平衡後，取上述粗酶液上樣，用體積比為1:1的平衡緩衝液(PH為5. 4，濃度為20 mmol. L-1的醋酸緩衝液)和含有1 mol · L-1 NaCl的20 mmol · L-1醋酸緩衝液(pH 5. 4)，按線性梯度從0到100%進行洗脫，分別收集洗脫峰，對各組分進行活性檢測，如附圖1所示；
(4)採用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱，上樣品前用20 mmol化―1的醋酸緩衝液(pH 5. 4)進行平衡後，取離子交換層析得到的活性組分上樣，收集各組分；如附圖2所示；
(5)利用HPLC檢測分級收集產物純度，收集純度大於85%的組分，即為長梗木黴裂解酶；如附圖3所示；其中HPLC的流動相配製為=NaCl 8 g，L-Arg-HCl 42 g,Na2HPO4. 12H20 8g ,H2O 1000ml ；色譜柱GF-450 (agilent 9.4 X 250mm, 6 μ m)；流速1. 5 ml/min ；柱溫 25 0C ；檢測波長:280nm ；
(6)對長梗木黴裂解酶進行活性測試，觀察其去除真菌效果，具體可參見下表1。經上述分離純化步驟後，長梗木黴裂解酶的菌體得率為45克菌體溼重/升發酵液，目標酶效價14500單位/升。純度85. 5%，其最適宜溫度和pH值如附圖4和5所示。實施例3
A、用於培養長梗木黴以產生長梗木黴裂解酶的發酵培養基的配方如下 蔗糠 8%、鼓皮5. 5%、硫酸銨4%、磷酸二氫鉀2%、硫酸鎂2. 5%、瓊脂3. 0%、微量元素 0. 5%、其餘為去離子水，以重量百分比計。B、利用上述發酵培養基製備長梗木黴裂解酶的方法如下
按上述配方配製20L發酵液(用去離子水)於發酵罐中，取長梗木黴菌種，其中長梗木酶菌種由廣東省微生物研究所提供，為長梗木黴(Trichoderma Longibrachiatum Rifai) 958-11菌株進行選育獲得，經滅菌後接種菌種，菌種的接種量按發酵液體積的15%，菌濃為 25%，菌濃是指菌液離心後計算固體菌絲佔整個菌液的體積比例，同時設定溶氧水平為45%， 用氫氧化鈉和鹽酸調節PH值為6.0，其中pH值可以採用酸鹼自動平衡調節，開始進行培養， 保持溫度四士 1 °C，發酵時間為6天。發酵完畢，經分離純化，分離純化的具體步驟為
(1)將長梗木黴的發酵液於0°C，3000r/min離心去除懸浮菌體，採用截留分子量為 10000的中空纖維超濾膜，對發酵液進行超濾收集粗酶液；
(2)取粗酶液，在-6°C的條件下，按體積1:3的比例加入冰乙醇，攪拌混勻於;TC靜置， 離心得沉澱物，加入50 mL20 mmol.L—1醋酸緩衝液(pH 5.4)溶解得到濃縮粗酶液，備用；
(3)採用SartobindQ離子交換膜，上樣前用20 mmol -L"1的醋酸緩衝液(pH 5.4)進行平衡後，取上述粗酶液上樣，用體積比為1:1的平衡緩衝液(PH為5. 4，濃度為20 mmol. L-1的醋酸緩衝液)和含有1 mol · L-1 NaCl的20 mmol · L-1醋酸緩衝液(pH 5. 4)，按線性梯度從0到100%進行洗脫，分別收集洗脫峰，對各組分進行活性檢測，如附圖1所示；
(4)採用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱，上樣品前用20 mmol化―1的醋酸緩衝液(pH 5. 4)進行平衡後，取離子交換層析得到的活性組分上樣，收集各組分；如附圖2所示；
(5)利用HPLC檢測分級收集產物純度，收集純度大於85%的組分，即為長梗木黴裂解酶；如附圖3所示；其中HPLC的流動相配製為=NaCl 8 g，L-Arg-HCl 42 g,Na2HPO4. 12H20 8g ,H2O 1000ml ；色譜柱GF-450 (agilent 9.4 X 250mm, 6 μ m)；流速1. 5 ml/min ；柱溫 25 0C ；檢測波長:280nm ；
(6)對長梗木黴裂解酶進行活性測試，觀察其去除真菌效果，具體可參見下表1。經上述分離純化步驟後，長梗木黴的裂解酶菌體得率為70克菌體溼重/升發酵液，目標酶效價18700單位/升。純度86. 2% ；其最適宜溫度和pH值如附圖4和5所示。隨機選擇上述實施例1-3中製備獲得的長梗木黴裂解酶，對其進行抗菌試驗，如下表1所示，統計結果表明，採用本發明方法製備獲得的長梗木黴裂解酶具有較強的抗真菌作用，可以作為抗真菌藥物進行開發和利用。
權利要求
1.一種用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是含以下步驟 配製長梗木黴的發酵培養基，在發酵培養基中加入長梗木黴菌種，調節溫度為25-30°C，PH 值為6. 0-7. 5，溶氧為40-55%，進行發酵3-6天，得長梗木黴的發酵液；將所得的長梗木黴發酵液進行分離純化，獲得長梗木黴的裂解酶。
2.根據權利要求1所述的用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是所述的發酵培養基含以下重量百分含量的組分蔗糠3-8%、鼓皮1.0-5.5%、硫酸銨 1.5-4%、磷酸二氫鉀0.5-2%、硫酸鎂0.5-2. 5%、瓊脂1. 0-3. 0%、微量元素0. 05-0. 5%、其餘為去離子水。
3.根據權利要求1所述的用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是長梗木黴的接種量為發酵培養基總體積的5-20%，長梗木黴菌種的菌濃度為15-25%。
4.根據權利要求1所述的用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是長梗木黴發酵液的分離純化包括以下具體步驟(1)將長梗木黴發酵液離心除去懸浮菌體，採用超濾膜進行過濾，收集粗酶液；(2)調節粗酶液溫度為-6-10°C，加入冰乙醇，混勻，靜置後，離心得沉澱物，在沉澱物中加入醋酸緩衝液溶解得到濃縮粗酶液；(3)將濃縮粗酶液採用SartobindQ離子交換膜上樣，並用平衡緩衝液和含有NaCl 的醋酸緩衝液按線性梯度從0到100%進行洗脫，分別收集洗脫峰，對各洗脫液進行活性檢測；(4)將各洗脫液採用kphacrylS-200HR凝膠過濾柱上樣，用含有NaCl的醋酸緩衝液洗脫，收集各組分，採用HPLC檢測各收集組分的純度，收集純度高於85%的組分，即獲得長梗木黴裂解酶。
5.根據權利要求4所述的用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是步驟(1)中離心時的溫度為0°c，離心機的轉速為3000 r/min ；超濾膜為中空纖維超濾膜，其截留分子量為lOOOODa。
6.根據權利要求4所述的用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是步驟O)中冰乙醇的加入量為粗酶液總體積的3-3.5倍，靜置時的溫度為4 士 1°C，醋酸緩衝液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L \其加入量為粗酶液總體積的2-2. 5倍。
7.根據權利要求4所述的用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是步驟(3)中Sartobind Q離子交換膜上樣前用醋酸緩衝液進行平衡，平衡時採用的醋酸緩衝液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L 1 ；洗脫時的平衡緩衝液為醋酸緩衝液，其 PH為5. 8，濃度為20 mmol L 1 ；洗脫時的含有NaCl的醋酸緩衝液中NaCl的濃度為1 mol L S醋酸緩衝液的pH為5. 4，濃度為20 mmol. L \平衡緩衝液和含有NaCl的醋酸緩衝液的體積比為1:1。
8.根據權利要求4所述的用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，其特徵是步驟(4)S-200HR凝膠過濾柱上樣用醋酸緩衝液進行平衡，平衡時採用的醋酸緩衝液的PH為5. 4，濃度為20 mmol. L 1 ；洗脫時的含有NaCl的醋酸緩衝液中NaCl 的濃度為lmol L \醋酸緩衝液的pH為5. 4，濃度為20 mmol. L ^
全文摘要
本發明公開了一種用於治療真菌性疾病的長梗木黴裂解酶的製備方法，含以下步驟配製長梗木酶的發酵培養基，在發酵培養基中加入長梗木黴菌種，調節溫度為25-30℃，pH值為6.0-7.5，溶氧為40%-55%，進行發酵3-6天，得長梗木黴的發酵液；將所得的長梗木黴發酵液進行分離純化，獲得長梗木黴的裂解酶。該方法獲得的目標酶的菌體得率高、目標酶表達量高，純度和酶活高；並且本發明方法發酵時間短、發酵成本低、分離工藝精密；並且採用本發明方法獲得的長梗木黴裂解酶具有較強的抗真菌作用，可以作為抗真菌藥物進行開發和利用。
文檔編號C12R1/885GK102229921SQ201110155298
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者安鴻, 尹海濱 申請人:廣州明新醫藥科技有限公司