高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法及其裝置的製作方法
2023-09-19 22:30:30 1
專利名稱：高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法及其裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測微量白蛋白的技術，特別涉及一種高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法及其裝置。
背景技術：
血清白蛋白(HSA)是血清中含量最多的蛋白，大約佔血清蛋白總量的40％～60％。它在藥物的運輸和維持血液正常滲透壓發揮著重要的作用。
目前，分析白蛋白常用的方法有(1)幹試紙帶檢測法；利用指示劑的蛋白質誤差原理(即拽示劑離子因與白蛋白攜帶電荷相反而結合，故使其反應顯示的pH顏色變為較高pH顏色變化，這種pH顏色改變的幅度與白蛋白含量成正比)而建立的。(2)加熱乙酸法；加熱煮沸使蛋白變性、凝固，然後加酸使PH接近蛋白質等電點(pH4.7)有利於已變性蛋白下沉，同時可消除某些磷酸鹽因加熱析出所致的混濁。(3)磺基水楊酸法；其基本原理為在略低於蛋白質等電點的pH條件下，蛋白質帶有正電荷的氨基與帶負電荷的磺基水楊酸根相結合，形成不溶性蛋白質鹽而沉澱。這些檢測方法雖然簡單、藥品便宜，但是靈敏度不夠、檢測線性範圍窄，誤差較大。而在定量分析檢測白蛋白方面主要有以下幾種方法(1)考馬斯亮藍G-250法；考馬斯亮藍G-250溶液可呈現兩種顏色，即紅色和藍色酸性考馬斯亮藍為紅色試劑，與蛋白質結合後變成藍色，與標準液相比，即可測出蛋白質含量；(2)電化學法；利用某種物質在特定的pH條件下有及譜還原峰，加入白蛋白後其峰電位不變而峰電流下降。峰電流下降值同白蛋白的濃度在一定範圍內有線性關係；(3)分光光度法；利用與白蛋白形成複合物，而這複合物有特徵吸收峰；用特定波長的光激發複合物的得到吸收值；複合物濃度一定範圍內服從比爾定律，對比標準溶液吸收值可以算出樣品中白蛋白的濃度。(4)免疫化學技術；一定波長的光線通過免疫反應樣品時被免疫複合物反射、吸收而減弱，在一定範圍內，透射光被吸收的量(A值變化)與複合物量呈正相關，而複合物量與抗原和抗體的量呈函數關係。固定某一物量可從標準曲線得知另一物量。這些方法雖然靈敏度比較高，但是操作比較複雜，所用儀器昂貴，檢測成本高。
發明內容
本發明的目的在於針對現有檢測方法存在的缺點和不足，提供一種快速、高靈敏、低成本、抗幹擾性強的檢測微量白蛋白的方法；同時將一種高選擇性、高靈敏度檢測單態氧(1O2)的化學發光探針(海螢螢光素類似物，簡稱FCLA)巧妙運用來測定白蛋白的濃度。
本發明的另一目的在於提供一種實現上述方便的高靈敏、快捷、抗幹擾性強的檢測白蛋白的裝置。
本發明的目的通過下述技術方案實現一種高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於包括下述步驟(1)製備穩定單態氧源。
(2)將單態氧迅速與一種對單態氧高選擇、高靈敏度的海螢螢光素類似物(FCLA)反應，經過脫羧和質子化形成激發態羰基化合物，隨後退激發輻射出特定波長的光子，形成化學發光。
(3)加入白蛋白(HSA)增敏化學發光光強；經過內塗純硫酸鋇(BaSO4)的積分球將發散到各個方向的化學發光收集起來並均勻化處理；積分球可大大提高化學發光的收集效率。
(4)安放在檢測窗的透鏡擴大收集角，將積分球均勻化化學發光聚焦到高靈敏度的光電倍增管(PMT)的陰極感光板上，將光信號轉換成電信號。
(5)將電信號通過前置放大後將電信號轉化成數位訊號，由計算機軟體處理得出化學發光隨時間衰減信號圖。
(6)將數位訊號輸入計算機後由軟體統計出化學發光積累量。
所述步驟(1)中穩定單態氧的製備方法可為以下幾種(1)光敏反應；(2)化學反應(過氧化氫與次氯酸鹽反應)；(3)生物體系的氧化(超氧陰離子自由基的氧化、過氧化物酶催化H2O2的反應、臭氧低溫分解、內氧化物的熱分解作用、唾液過氧化物產生1O2等)。其中化學反應體系相比其它方式具有如下的優點無需激發光源，避免激發光幹擾，能提高信噪比，並且1O2的產率高；其中過氧化氫與次氯酸鈉生產單態氧的效率幾乎為100％。
所述化學反應製備單態氧源中次氯酸鈉的濃度優選為5～50mmol/L；所述過氧化氫的濃度優選為1～5mmol/L。
所述海螢螢光素類似物(FCLA)能特異性地檢測單態氧(1O2)和超氧陰離子，所述海螢螢光素類似物的濃度優選為1～10umol/L；化學發光的波長是522nm。
所述步驟(3)中積分球在可見光區(400～760nm)反射率為0.98～0.99，由積分球原理，散射光在球面上經歷無數次反射，不斷衰減最終均勻化，也就是說球面上的每點光強是相等的。由公式E=4R21-]]>知道檢測窗的光強可以推算出整個反應的發光強度。
所述步驟(5)中處理數據反應光強時只需求5秒內的化學發光積累量；因為反應速度相當快，單態氧相當快就衰減完。
一種實現上述方法的高靈敏度檢測微量白蛋白化學發光裝置，包括暗室、樣品池、微量進樣器、積分球、化學發光接收組件、電脈衝處理組件、計算機，所述樣品池、微量進樣器、積分球、化學發光接收組件設置於暗室內，化學發光接收組件、電脈衝處理組件依次與計算機連接；微量進樣器懸在樣品池上；樣品池固定在積分球球壁上。
所述化學發光接收組件包括透鏡、光電倍增管，所述透鏡通過光纖與光電倍增管相連接；透鏡增大化學發光的收集角，將光會聚後由光纖輸入光電倍增管。因為化學發光比較弱並且時間短，所以所用的接收組件必須是高靈敏、低噪音、能快速響應的。
所述電脈衝處理組件包括前置放大器、計數卡，前置放大器與計數卡相連接。
所述計算機處理軟體可採用National Instruments公司開發的Labview軟體。
本發明的作用原理是化學反應體系產生穩定的單態氧，單態氧壽命極短(十幾微秒)；單態氧迅速被選擇性的與高靈敏度發光探針捕獲，化學反應通過脫羧和質子化形成激發態羰基化合物、隨後退激發輻射出特定波長的光子；光子經超微弱高靈敏度的光電倍增管轉換成數位訊號反映到計算機上；控制溫度、pH值等條件加入一定量的白蛋白，從計算機軟體統計上可以明顯知道白蛋白提高化學發光；化學發光增敏的程度在一定範圍內與白蛋白的濃度成線性關係。
分析FCLA與HSA的吸收光譜發現，當兩者混合後FCLA的吸收峰有5nm的紅移；HSA在279nm光激發下337nm處出現螢光峰，加入FCLA後螢光強度下降，並且隨著FCLA濃度的增加HSA螢光強度不斷下降。我們分析了FCLA淬滅HSA的機制是屬於靜態淬滅，利用Forster能量轉移理論，可以計算出FCLA與HSA的結合距離以及結合位點的數目。這些都說明FCLA與HSA存在分子間的締合。締合後存在分子內的能量轉移。HSA與單態氧反應後生成蛋白羰基，其激發態能在分子內轉移給FCLA。這樣就有兩個FCLA介入的化學發光過程。一個是FCLA與單態氧反應的化學發光過程。FCLA+1O2.FCLA＝O*.FCLA＝O+h.′，FCLA與單態氧反應後化學結構會發生改變。另一個發光過程是激發態FCLA退激發的過程，可以不斷的產生光子。兩個反應累加大大增強了化學發光。
本發明與現有技術相比具有如下的優點及有益效果(1)靈敏度高、檢測速度快本發明運用一種高靈敏度的化學發光探針FCLA與單態氧反應化學發光，極微量的白蛋白都能夠提高發光強度，從數值信號的統計上可以明顯檢測出。這比觀測顏色變化、吸收值變化以及電流變化都要靈敏多；同時，控制實驗處於最適條件下(溫度、pH值、反應濃度等)，反應物混合均勻迅速化學反應生成單態氧，而FCLA能高靈敏地檢測單態氧，但單態氧壽命極短，檢測時間也就5秒左右；白蛋白增敏化學發光也處於FCLA檢測單態氧的過程，故檢測白蛋白速度快，時間為5秒左右，這與其他方法(螢光光譜法、甲苯酚藍等需要十幾分鐘)相比迅速得多。
(2)低成本本發明所採用的裝置結構簡單，生產裝配較為容易，造價相對較低；在操作過程中使用的藥品用量少，操作使用方便，整體成本較為低廉。
(3)利用本發明檢測微量白蛋白具有一定的抗幹擾性，為以後生產實踐中高靈敏地檢測白蛋白提供一種有益的借鑑。
圖1是本發明高靈敏度檢測微量白蛋白化學發光裝置的結構示意圖。
圖2是FCLA-HSA體系中由Labview統計的實時化學發光信號衰減圖。
圖3是有無白蛋白條件下化學發光強度比較圖。
圖4是微量白蛋白濃度與增敏化學發光強度柱狀關係圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例圖1示出了本發明裝置的具體結構，由圖1可見，本高靈敏度檢測微量白蛋白化學發光裝置包括暗室1、透明超薄樣品池2、微量進樣器3、積分球4、化學發光接收組件、電脈衝處理組件、計算機10、電源11、光電倍增管的穩壓器12；所述透明超薄樣品池2、微量進樣器3、積分球4、化學發光接收組件設置於暗室內，化學發光接收組件、電脈衝處理組件依次與計算機10連接；微量進樣器3懸在樣品池2上；樣品池2固定在積分球4球壁上；化學發光接收組件、計算機10與電源11連接。所述化學發光接收組件包括透鏡5、光電倍增管6、光纖7，所述透鏡5通過光纖7與光電倍增管6相連接；所述透鏡5可選用8mm凸透鏡，所述光纖7可選用8mm光纖；所述電脈衝處理組件包括前置放大器8、計數卡9，前置放大器8與計數卡9相連接；所述計數卡9選用ADVANTECH PCL-836；積分球4是向上海億奧光學科技有限公司定做的；球體直徑150mm，球壁開2個窗口(兩個窗口呈直角，一個窗口為放置樣品池的，另外一個為檢測窗口)，樣品窗開口直徑8mm，檢測窗直徑為8.5mm。計算機10選用Intel公司的Pentium III型微機。
利用上述裝置實現的高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法具體操作如下在室溫(25℃)條件下，並在黑暗環境中將pH7.4的磷酸緩衝液(PBS)660uL、50umol/LHSA 10uL、100umol/L FCLA 30uL、濃度為100umol/L的NaClO 100uL按順序加入透明超薄樣品池2中，用微量進樣器注射濃度為10umol/L的H2O2200uL，迅速打開PMT模塊檢測化學發光，計算機的軟體程序開始計數化學發光強度，得到如圖2所示的實時化學發光信號衰減圖。
將pH7.4的磷酸緩衝液體積660uL、濃度為100umol/L的NaClO 100uL、，100umol/L FCLA 30uL、10umol/L的H2O2200uL，其它實驗條件不變，分別不加入白蛋白和加入50umol/L白蛋白10uL，每次實驗重複3次統計的化學發光強度(選取前5秒計數值的積累量)，取平均值，得出存在白蛋白和不存在白蛋白條件下化學發光強度的積累量如圖3。
改變HSA的濃度分別選用0umol/L、0.01umol/L、0.03umol/L、0.05umol/L，0.08umol/L，其它實驗條件不變，每個實驗樣重複3次取實驗結果(選取統計結果前100個點的數據積累)的平均值，測得化學發光強度減去無HSA發光強度與白蛋白濃度的柱狀關係圖4。
操作結果分析(1)由圖2所示FCLA-HSA體系中檢測到實時化學發光信號衰減圖可看出次氯酸鈉和過氧化氫的化學反應非常迅速，單態氧壽命極短，但FCLA能靈敏探測到單態氧。從圖2中看出，化學發光收集的有效數據也就是前100個點，其後化學發光迅速衰減到本底。
(2)圖3是有無白蛋白條件下化學發光強度比較圖；可以看出加入0.05umol/L的白蛋白能夠明顯提高化學發光強度。
(3)圖4是微量白蛋白濃度與增敏化學發光強度柱狀關係圖。根據圖4可明顯知道在一定範圍隨著白蛋白濃度的增加，化學發光強度不斷增加；並且0.01umol/L白蛋白與無白蛋白化學發光相比一定的差別，這暗示提高靈敏度還有大的空間，將數據作線性擬合線性關係良好，相關係數為0.978。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於包括下述步驟(1)製備穩定單態氧源；(2)將單態氧迅速與海螢螢光素類似物反應，經過脫羧和質子化形成激發態羰基化合物，隨後退激發輻射出特定波長的光子，形成化學發光；(3)加入白蛋白增敏化學發光光強；經過內塗純硫酸鋇(BaSO4)的積分球將發散到各個方向的化學發光收集起來並均勻化處理；(4)安放在檢測窗的透鏡擴大收集角，將積分球均勻化化學發光聚焦到高靈敏度的光電倍增管(PMT)的陰極感光板上，將光信號轉換成電信號；(5)將電信號通過前置放大後將電信號轉化成數位訊號，由計算機軟體處理得出化學發光隨時間衰減信號圖；(6)將數位訊號輸入計算機後由軟體統計出化學發光積累量。
2.根據權利要求1所述的高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於所述步驟(1)中穩定單態氧的製備方法為以下幾種(1)光敏反應；(2)化學反應；(3)生物體系的氧化。
3.根據權利要求2所述的高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於所述化學反應為過氧化氫與次氯酸鹽反應或過氧化氫與腈反應。
4.根據權利要求3所述的高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於所述次氯酸鈉的濃度為5～50mmol/L；所述過氧化氫的濃度為1～5mmol/L。
5.根據權利要求1所述的高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於所述海螢螢光素類似物檢測單態氧和超氧陰離子，所述海螢螢光素類似物的濃度為1～10umol/L；化學發光的波長是522nm。
6.根據權利要求1所述的高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於所述步驟(3)中積分球在可見光區反射率為0.98～0.99，收集所有的散射光子並將其均勻化。
7.根據權利要求1所述的高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，其特徵在於所述步驟(5)中處理數據反應光強時只求5秒內的化學發光積累量。
8.一種實現權利要求1～7任一項所述方法的高靈敏度檢測微量白蛋白化學發光裝置，其特徵在於包括暗室、樣品池、微量進樣器、積分球、化學發光接收組件、電脈衝處理組件、計算機，所述樣品池、微量進樣器、積分球、化學發光接收組件設置於暗室內，化學發光接收組件、電脈衝處理組件依次與計算機連接；微量進樣器懸在樣品池上；樣品池固定在積分球球壁上。
9.根據權利要求8所述的高靈敏度檢測微量白蛋白化學發光裝置，其特徵在於所述化學發光接收組件包括透鏡、光電倍增管，所述透鏡通過光纖與光電倍增管相連接；透鏡增大化學發光的收集角，將光會聚後由光纖輸入光電倍增管。
10.根據權利要求8所述的高靈敏度檢測微量白蛋白化學發光裝置，其特徵在於所述電脈衝處理組件包括前置放大器、計數卡，前置放大器與計數卡相連接。
全文摘要
本發明提供一種高靈敏度檢測微量白蛋白的化學發光方法，包括化學反應產生穩定的單氧源；單態氧和高選擇性、高靈敏度的化學發光探針FCLA反應產生高能量的中間產物，迅速退激發發出光子；微量的白蛋白與FCLA結合後很大地增敏化學發光強度，化學發光增敏的大小與白蛋白的濃度成線性關係；通過發光強度的變化對應白蛋白濃度的改變，從而檢測出微量白蛋白。一種實現前述方法的裝置，包括暗室、樣品池、微量進樣器、積分球、化學發光接收組件、電脈衝處理組件、計算機等。本發明所需樣品少，裝置容易實現，耗時短，成本低，操作簡單，靈敏度高，有一定的抗幹擾性。
文檔編號G01N21/76GK1900718SQ20061003670
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月27日 優先權日2006年7月27日
發明者邢達, 徐未, 周靜 申請人:華南師範大學