通過使用hdac調節劑誘導復能基因而重編程細胞的製作方法

2023-09-19 23:32:55 3

專利名稱：通過使用hdac調節劑誘導復能基因而重編程細胞的製作方法
技術領域：
本發明的實施方案涉及細胞生物學、幹細胞、細胞分化、體細胞核轉移和基於細胞 的治療法的領域。更具體地，本發明的實施方案涉及用於重編程細胞以及基於細胞的治療 法的方法、組合物和試劑盒。
背景技術：
再生醫學作為許多人疾病的治療極具潛力，但是還伴隨著一些困難的技術挑戰， 這些挑戰包括低克隆效率、可能的復能(pluripotent)組織供應不足、和對於如何控制細 胞分化和哪種類型的胚胎幹細胞可用於選擇的治療的知識的普遍缺乏。儘管ES細胞具有 極大的可塑性，但是未分化的ES細胞可以形成含有組織類型混合物的畸胎瘤(良性腫瘤)。 此外，從一種來源向另一來源移植ES細胞將可能需要施用藥物來防止新細胞的排斥。已經進行了嘗試來鑑定由非胎兒來源的組織產生幹細胞的新途徑。一種方法包括 操縱自體的成體幹細胞。使用自體的成體幹細胞用於再生醫學的優點在於它們來源於並返 回同一患者，並且因此不會經受免疫介導的排斥。缺點是這些細胞缺乏ES細胞的可塑性 和復能性，並且因此它們的潛能是不確定的。另一方法著眼於將來自成體組織的體細胞重 編程以產生復能ES樣細胞。然而，這種方法是困難的，因為多細胞生物體中的每種細胞類 型具有獨特的表觀遺傳學標記，認為該標記在細胞分化之後或從細胞周期退出之後是固定 的。細胞DNA —般以染色質的形式存在，染色質是由核酸和蛋白質構成的複合體。事 實上，大部分的細胞RNA分子還以核蛋白複合體的形式存在。如本領域技術人員已知的，染 色質的核蛋白結構已成為廣泛的研究主題。一般而言，染色體DNA被包裝成核小體。核小 體包含核心和連接區。核小體核心包含核心組蛋白(H2A、H2B、H3和H4各兩個)八聚體， 約150個鹼基對的染色體DNA纏繞在該八聚體周圍。此外，約50個鹼基對的連接區DNA區 段與連接區組蛋白Hl締合。核小體被組織成更高階的染色質纖維並且染色質纖維被組織 成染色體。參見,例如,Wolffe" Chromatin Structure and Function(染色質結構和功 能)「第 3 版，Academic Press, San Diego,1998。染色質的結構不是靜態的，而是易於經受統稱為染色質重建的過程的修飾。染色 質重建可以用於例如，從DNA區清除核小體；將核小體從一個DNA區移到另一個DNA區； 改變核小體之間的間距；或添加核小體到染色體中的DNA區。染色質重建還可以導致更高階結構的改變，從而影響轉錄活性的染色質(開放染色質(open chromatin)或常染色質) 與無轉錄活性的染色質(閉合染色質(closed chromatin)或異染色質)之間的平衡。染色體蛋白易經受大量類型的化學修飾。這些核心組蛋白的翻譯後修飾的一種機 制是高度保守的鹼性N-末端賴氨酸殘基的氨基的可逆乙醯化。組蛋白乙醯化的穩態 是由競爭性的組蛋白乙醯基轉移酶與組蛋白脫乙醯酶之間的動態平衡建立的，組蛋白脫乙 醯酶在本文稱為HDAC。HDAC依據序列同一性和結構域組織被分為至少四類I類HDAC1、HDAC2、 HDAC3、HDAC8 ；II 類HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAClO ；III 類哺乳動物中的 sirtuin (SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)；以及 IV 類HDAC11。I 類 HDAC 是最類似於酵母轉錄調節蛋白RPD3的那些HDAC。II類HDAC是最類似於酵母HDAl酶的那 些 HDAC。 早已將組蛋白乙醯化和脫乙醯化與轉錄控制聯繫起來。可逆的組蛋白乙醯化可以 導致染色體重建並且如此可以作為基因轉錄的控制機制起作用。一般而言，組蛋白的高度 乙醯化有利於基因表達，而組蛋白脫乙醯化則與轉錄抑制相關聯。據顯示組蛋白乙醯基轉 移酶充當轉錄輔激活蛋白，而脫乙醯酶則被發現是屬於轉錄抑制途徑的。組蛋白乙醯化與脫乙醯化之間的動態平衡是正常細胞生長所必需的。組蛋白脫乙 醯化的抑制導致細胞周期停滯、細胞分化、凋亡和轉化的表型逆轉。復能細胞或全能(totipotent)細胞向分化的、特化的表型的發育是由發育期間 表達的特定組的基因決定的。基因表達是由可以實現正調節或負調節的基因調節蛋白的序 列特異性結合直接介導的。然而，這些調節蛋白的任一種直接介導基因表達的能力至少部 分取決於它們在細胞DNA內的結合位點的可接近性。如上面所討論的，細胞DNA中序列的 可接近性通常取決於在其中包裝細胞DNA的細胞染色質的結構。因此，鑑定可以誘導復能性所需的基因表達的方法、組合物和試劑盒，包括可以抑 制參與阻抑轉錄的HDAC活性的方法、組合物和試劑盒將是有用的。發明簡述本發明涉及重編程細胞的方法、組合物和試劑盒。本發明的實施方案涉及包括誘 導復能基因或多能(multipotent)基因表達的方法。在又一實施方案中，本發明還涉及制 備重編程的細胞。在再一實施方案中，本發明涉及包括通過使用HDAC抑制劑抑制至少一 種HDAC的活性、表達、或活性和表達的方法。在又一實施方案中，本發明涉及包括通過使用 HDAC調節劑改變至少一種HDAC的活性、表達、或活性和表達的方法。方法還包括誘導至少 一種復能基因或多能基因的表達以及重編程細胞。本發明的實施方案還涉及重編程細胞的方法，所述方法包括使細胞、細胞群、細胞 培養物、來自細胞培養物的細胞亞群、同質細胞培養物或異質細胞培養物接觸HDAC調節 劑；誘導至少一種復能基因或多能基因表達；以及重編程細胞。所述方法還包括使重編程 的細胞再分化。在另一實施方案中，本發明涉及使用劑以抑制HDAC的表達、活性、或表達和活性。 所述劑可以是可以抑制HDAC的表達、活性、或表達和活性的任何分子或化合物，包括但不 限於HDAC抑制劑、小分子、核酸序列、DNA序列、RNA序列、shRNA序列以及RNA幹擾。在另一實施方案中，本發明涉及使用劑以誘導抑制HDAC活性的蛋白的活性、表達、或活性和表達。所述劑可以是可以誘導抑制HDAC的蛋白的表達、活性、或表達和活性的 任何分子或化合物，包括但不限於小分子、核酸序列、DNA序列、RNA序列、shRNA序列以及 RNA幹擾。HDAC抑制劑可以用於抑制HDAC的活性，並且其包括但不限於TSA、丁酸鈉、丙 戊酸、沃瑞諾斯特(vorinostat)、LBH-589、apicidin、TPX-HA 類似物、CI-994、MS-275、 MG⑶0103以及上面所提及的物質的衍生物或類似物。在一些實施方案中，至少一種HDAC抑制劑可以抑制至少一種HDAC。在又一實施方 案中，多於一種的HDAC抑制劑可以同時或順序地抑制至少一種HDAC。HDAC抑制劑可以針 對於I類、II類、III類、IV類的HDAC或未知的或未分類的HDAC。HDAC抑制劑可以針對於 多於一類的HDAC或所有類的HDAC。HDAC抑制劑的組合可以抑制多於一種的HDAC，並且可 以同時或順序地使用。在另一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將細胞群暴露於 抑制組蛋白脫乙醯酶的活性、表達、或活性和表達的劑；誘導復能基因或多能基因的表達； 選擇表達指示復能細胞或多能細胞的細胞表面標記物的細胞；以及擴增所述選擇的細胞以 製備細胞群，其中所述細胞已恢復分化潛能。在又一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將細胞暴露於抑 制HDAC的活性、表達、或表達和活性的第一劑；將所述細胞暴露於抑制第二調節蛋白的活 性、表達、或表達和活性的第二劑，其中所述第二調節蛋白具有與HDAC不同的功能；誘導復 能基因或多能基因的表達；以及選擇細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。在另一實施方案 中，細胞或細胞群可以同時或順序地暴露於第一劑和第二劑。在又一實施方案中，本發明涉及包括下列的方法將具有第一表型的細胞暴露於 抑制至少一種HDAC的活性、表達、或活性和表達的劑；比較細胞的所述第一表型與將所述 細胞暴露於所述劑後所獲得的表型；以及選擇已被重編程的細胞。在又一實施方案中，方法 包括比較在將細胞暴露於所述劑之前細胞的基因型與將所述細胞暴露於所述劑之後所獲 得的細胞基因型。在再一實施方案中，方法包括比較在將細胞暴露於抑制至少一種HDAC的 活性、表達、或活性和表達的劑之前細胞的表型和基因型與將所述細胞暴露於所述劑之後 細胞的表型和基因型。在又一實施方案中，方法包括將選擇的細胞培養或擴增為細胞群。在又一實施 方案中，方法包括使用與由復能基因或多能基因所編碼的蛋白結合的抗體或使用與多能 標記物或復能標記物結合的抗體分離細胞，所述多能標記物或復能標記物包括但不限於 SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。還可以使用有效分離細胞的任何方法分離細胞，包括 但不限於螢光細胞激活的分選儀、免疫組織化學和ELISA。在另一實施方案中，方法包括選 擇與原始細胞相比具有較低分化狀態的細胞。在又一實施方案中，本發明還包括比較暴露於所述劑之前復能基因或多能基因的 染色質結構與暴露於所述劑之後所獲得的染色質結構。在另一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將具有第一轉 錄模式的細胞暴露於抑制HDAC的活性、表達、或活性和表達的劑；誘導復能基因或多能基 因的表達；比較細胞的所述第一轉錄模式與暴露於所述劑之後所獲得的轉錄模式；選擇細 胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。
在又一實施方案中，選擇細胞包括鑑定轉錄模式至少5-10%、10-20%、20_30%、 30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-94%、95%或 95-99%類似於分 析的胚胎幹細胞的轉錄模式的細胞。不需要比較胚胎幹細胞的整個轉錄模式，儘管這是可 以的。相反，可以比較的胚胎基因的亞組包括但不限於1-5個、5-10個、10-25個、25-50 個、50-100 個、100-200 個、200-500 個、500-1，000 個、1，000-2，000 個、2，000-2，500 個、 2，500-5, 000個、5，000-10, 000個和多於10，000個基因。轉錄模式可以以二元形式比較， 即，可以進行比較來確定基因是轉錄的還是未轉錄的。在另一實施方案中，可以比較每種基 因或基因亞組的轉錄速率和/或程度。可以使用本領域中已知的任何方法來確定轉錄模 式，包括但不限於RT-PCR、定量PCR、微陣列、DNA印跡和雜交。本發明的實施方案還包括包含使用根據本文所公開的方法產生的重編程的細胞 治療多種疾病的方法。在又一實施方案中，本發明還涉及重編程的細胞和再分化的重編程 的細胞的治療用途。本發明的實施方案還涉及由本發明的方法製備的重編程的細胞。重編程的細胞可 以再分化為單個譜系或多於一種譜系。重編程的細胞可以是多能的或復能的。在又一實施方案中，本發明涉及根據包括下列步驟的方法製備的富集的重編程的 細胞群將細胞群暴露於抑制組蛋白脫乙醯酶的活性、表達、或活性和表達的劑；誘導復能 基因或多能基因的表達；選擇表達指示復能細胞或多能細胞的細胞表面標記物的細胞；以 及擴增所述選擇的細胞以製備細胞群，其中所述細胞已恢復分化潛能。在又一實施方案中，重編程的細胞表達指示復能細胞的細胞表面標記物，所述細 胞表面標記物選自由下列組成的組SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。在又一實施方案 中，重編程的細胞表達復能基因，所述復能基因包括但不限於0ct-4、SoX-2和Nanog。在又 一實施方案中，重編程的細胞佔富集的細胞群的至少5-10%、10-20%,20-30^^30-40 ^ 40-50 %、50-60 %、60-70 %、70-80 %、80-90 %、90-95 %、96-98 % ；或至少 99 %。本發明的實施方案還涉及用於製備本發明的方法和組合物的試劑盒。該試劑盒尤 其可用於重編程細胞和產生ES樣細胞和幹細胞樣細胞。附圖簡述

圖1是報導在用丙戊酸(VPA)處理的原代人肺細胞中Oct-4的上調的柱形圖。圖2是報導在用HDAC抑制劑(VPA)處理的原代人肺細胞中賦予幹細胞樣特徵的 幾種基因的上調的柱形圖。圖3是報導在用VPA處理的細胞中Oct-4的第一外顯子中的兩個胞嘧啶脫甲基化 的圖解。圖4A是報導在成人皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA幹擾期 間mRNA表達的倍數改變而測量的對基因Nanog的作用的圖。圖4B是報導在人新生兒皮 膚成纖維細胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA幹擾期間mRNA表達的倍數改變而測量的 對基因Nanog的作用的圖。圖4C是報導在人胎兒皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7或 HDACllshRNA幹擾期間mRNA表達的倍數改變而測量的對基因Nanog的作用的圖。圖5A是報導在成人皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA幹擾期 間mRNA表達的倍數改變而測量的對基因Oct-4的作用的圖。圖5B是報導在人新生兒皮 膚成纖維細胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA幹擾期間mRNA表達的倍數改變而測量的對基因Oct-4的作用的圖。圖5C是報導在人胎兒皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7或 HDACllshRNA幹擾期間mRNA表達的倍數改變而測量的對基因0ct_4的作用的圖。
圖6是報導在人胎兒皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA幹擾期間 mRNA表達的倍數改變而測量的對基因Sox-2的作用的圖。 圖7是報告在人皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7shRNA幹擾期間的mRNA表達而 測量的對各種HDAC和SIRT基因的作用的圖。圖8是報導在成人皮膚成纖維細胞(HDh)、人新生兒皮膚成纖維細胞(HDi^n)和人 胎兒皮膚成纖維細胞(HDFf)中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙幹擾期間mRNA表達的倍 數改變而測量的對基因Nanog的作用的圖。圖9是報導在成人皮膚成纖維細胞(HDh)、人新生兒皮膚成纖維細胞(HDi^n)和人 胎兒皮膚成纖維細胞(HDFf)中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙幹擾期間mRNA表達的倍 數改變而測量的對基因Oct-4的作用的圖。圖10是報導在成人皮膚成纖維細胞(HDh)、人新生兒皮膚成纖維細胞(HDi^n)和 人胎兒皮膚成纖維細胞(HDFf)中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙幹擾期間mRNA表達的 倍數改變而測量的對基因Sox-2的作用的圖。圖11是報導在成人皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙幹擾期 間mRNA表達的倍數改變而測量的對多種HDAC基因和SIRT基因的作用的圖。圖12是報導在人胎兒皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙幹擾 期間mRNA表達的倍數改變而測量的對多種HDAC基因和SIRT基因的作用的圖。圖13是報導在人新生兒皮膚成纖維細胞中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙幹 擾期間mRNA表達的倍數改變而測量的對多種HDAC基因和SIRT基因的作用的圖。圖14A是報導在成人皮膚成纖維細胞中HDAC7a shRNA對HSAC7a和HDACl 1表達 的作用的圖。報導了在不存在和存在嘌呤黴素兩種情況下細胞生長的數據。圖14B是報導在人新生兒皮膚成纖維細胞中HDAC7a shRNA對HSAC7a和HDACll 表達的作用的圖。報導了在不存在和存在嘌呤黴素兩種情況下細胞生長的數據。圖14C是報導在人胎兒皮膚成纖維細胞中HDAC7a shRNA對HSAC7a和HDACll表 達的作用的圖。圖15A是人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖15B是用DNMTlshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖15C是用HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖15D是用DNMTl和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖15E是用DNMTl和HDACllshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖15F是用HDACll和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖15G是人胚胎幹細胞的照片。圖16A是人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖16B是用DNMTlshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖16C是用DNMTl和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖16D是用DNMTl和HDACllshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖16E是用HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。
圖16F是用HDACll和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖16G是人胚胎幹細胞的照片。優選實施方案詳述定義除非另外指明，否則本公開內容中的數字範圍是近似的，並且因此可以包括該範 圍之外的值。數字範圍包括來自以一個單位遞增的下限值和上限值之間的所有值並且包 括下限值和上限值，前提條件是在任何下限值和任何上限值之間存在至少兩個單位的分 隔。作為實例，如果成分特徵、物理特徵或其他特徵諸如分子量、粘度、熔化指數等是100至 1，000，則旨在清楚地列舉所有單個的值，例如100、101、102等，和子範圍，例如100至144、 155至170、197至200等。對於含有小於1的值或含有大於1的分數數字(例如，1. 1、1.5 等)的範圍，一個單位視情況被認為是0.0001、0.001、0.01或0.1。對於含有小於10的單 數字的範圍(例如，1至5)，通常認為一個單位是0. 1。這些僅是具體意指的實例，認為在所 列舉的最低值和最高值之間的所有可能的數值組合均清楚地在本公開內容中陳述。在本公 開內容中尤其提供的數字範圍是混合物中組分的相對量和方法中所引用的各種溫度以及 其他參數範圍。除非明確限制為相反的情況，否則細胞(「cell」或「cells」)包括任何體細 胞、胚胎幹(EQ細胞、成體幹細胞、器官特異性幹細胞、核轉移(NT)單位以及幹樣細胞 (stem-like cell)。細胞可以由任何器官或組織獲得。細胞可以是人或其他動物的。例如， 細胞可以是小鼠的、豚鼠的、大鼠的、牛的、馬的、豬的、綿羊的、山羊的等。細胞還可以來自 非人的靈長類。「培養基」或「生長培養基」意指能夠支持細胞生長的合適的培養基。「分化」意指在胚胎發育期間細胞變得在結構和功能上特化的過程。「表觀遺傳學」意指關於在不改變核苷酸序列的條件下功能上的可遺傳改變的DNA 狀態。表觀遺傳學改變可以是由諸如甲基化和脫甲基化等DNA修飾引起的，而沒有任何DNA 核苷酸序列改變。「組蛋白」意指存在於染色體中的一類蛋白質分子，它負責將DNA壓縮得足以使 DNA適於在核內。「組蛋白脫乙醯酶抑制劑」和「組蛋白脫乙醯酶的抑制劑」意指能夠與組蛋白脫乙 醯酶相互作用並抑制其酶活性的化合物。「抑制組蛋白脫乙醯酶活性」意指降低組蛋白脫乙 醯酶從合適的底物例如組蛋白或其他蛋白移除乙醯基的能力。在一些實施方案中，組蛋白 脫乙醯酶活性的這種降低是至少約10-25 %，在另一實施方案中，至少約50 %，在其他實施 方案中，至少約75 %，並且還在其他的實施方案中，至少約90 %。還在其他實施方案中，組 蛋白脫乙醯酶活性降低了至少95 %，並且在其他實施方案中降低至少99 %。「敲低(knock down)」意指以基因特異性方式阻抑基因的表達。具有一種或多種 基因被「敲低」的細胞被稱為敲低生物體或簡單稱為「敲低」。「復能」意指能夠分化成3胚層細胞類型或基本組織類型。「復能基因」意指促使細胞為復能的基因。「復能細胞培養物」在表現出將它們與胚胎或成體來源的分化的細胞明顯區別開 的形態時被稱為是「基本上未分化的」。復能細胞通常具有高的核/胞質比、突出的核仁以及具有差的辨識度的細胞連接的緊密集落形成，並且容易被本領域技術人員識別。認識到 未分化的細胞集落可以被分化的鄰近細胞環繞。然而，當在適當的條件下培養時，基本上未 分化的集落繼續存在，並且在分離培養的細胞後，未分化的細胞構成了大部分的細胞。本公 開內容中描述的可用的細胞群含有任何比例的具有這些標準的基本上未分化的復能細胞。 基本上未分化的細胞培養物可以含有至少約20^^40^^60%或甚至80%未分化的復能細 胞(以群中總細胞的百分比計)。「調節蛋白」意指調節生物過程的任何蛋白，包括正向和負向的調節。調節蛋白可 以對生物過程具有直接或間接的作用，並且可以直接施加影響或通過參與到複合體中來施 加影響。「重編程」意指移除核中的表觀遺傳學標記，然後建立不同組的表觀遺傳學標記。 在多細胞生物體的發育期間，不同的細胞和組織獲得不同的基因表達程序。這些不同的基 因表達模式表現為實際上由諸如DNA甲基化、組蛋白修飾和其他染色質結合蛋白等表觀遺 傳學修飾調節。因此多細胞生物體中的每種細胞類型具有獨特的表觀遺傳學標誌，常規上 認為該標誌在細胞分化後或退出細胞周期之後變成「固定的」且不變的。然而，一些細胞在 正常發育或某些疾病期間會進行主要的表觀遺傳學「重編程」。「全能」意指能夠發育成整個胚胎或器官。本發明的實施方案涉及包括誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達的 方法。在另一實施方案中，本發明涉及包括誘導促使細胞為多能的至少一種基因表達的方 法。在一些實施方案中，方法包括誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達；和製備 能夠定向分化成至少一個譜系的重編程的細胞。本發明的實施方案還涉及包括下列的方法修飾染色質結構和將細胞重編程為復 能或多能的。在又一實施方案中，修飾染色質結構包括抑制HDAC的活性。在另一實施方案中，方法包括抑制HDAC的活性，以及誘導促使細胞為復能或多能 的至少一種基因表達。在又一實施方案中，方法包括抑制HDAC的活性和製備重編程的細 胞。在又一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將細胞暴露於抑 制HDAC的活性、表達、或活性和表達的劑；誘導復能基因或多能基因表達；以及選擇細胞， 其中所述細胞已恢復分化潛能。復能基因或多能基因可以被誘導為表達增加任何倍數，包 括但不限於 0. 25-0. 5,0. 5-1,1. 0-2. 5,2. 5_5、5_10、10-15、15-20、20-40、40-50、50_100、 100-200,200-500和大於500。在另一實施方案中，方法包括鋪板分化的細胞；將所述分化 的細胞暴露於抑制HDAC的活性、表達、或活性和表達的劑；培養所述細胞；以及鑑定已被重 編程的細胞。在另一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將細胞暴露於誘 導抑制HDAC活性的調節蛋白的表達、活性、或表達和活性的劑，誘導復能基因或多能基因 的表達；以及選擇細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。調節蛋白的活性或表達可以增 加任何量，包括但不限於1-5 %,5-10 %、10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 %、 60-70 70-80 80-90 90-95 % 和 95-99 99-200 200-300 300-400 400-500 % 以及大於 500 %。在又一實施方案中，方法還包括使用針對由復能基因或多能基因編碼的蛋白或蛋白片段的抗體或針對復能表面標記物的抗體選擇細胞。可以使用任何類型的抗體，包括但 不限於單克隆的、多克隆的、抗體片段、肽模擬物、活性區域的抗體以及蛋白保守區域的抗 體。在又一實施方案中，方法還包括使用由復能基因或多能基因驅動的報導分子或復 能或多能表面標記物選擇細胞。可以使用任何類型的報導分子，包括但不限於螢光蛋白、 綠色螢光蛋白、青色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、細菌螢光素酶、水母發光蛋白、 增強型綠色螢光蛋白、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、dsRED、β-半乳糖苷酶和鹼性磷酸酶。在又一實施方案中，方法還包括使用抗性作為選擇標記來選擇細胞，所述抗性包 括但不限於抗生素抗性、殺真菌劑抗性、嘌呤黴素抗性、潮黴素抗性、二氫葉酸還原酶抗 性、胸苷激酶抗性、新黴素抗性(neo)、G418抗性、麥考酚酸抗性(gpt)、博來黴素(zeocin) 抗性蛋白和鏈黴素抗性。在又一實施方案中，方法還包括比較在將細胞暴露於抑制HDAC的活性、表達、或 活性和表達的劑之前所述細胞的復能基因或多能基因的染色質結構與用所述劑處理之後 所獲得的復能基因或多能基因的染色質結構。可以比較染色質結構的任何方面，包括但不 限於常染色質、異染色質、組蛋白乙醯化、組蛋白甲基化、組蛋白或組蛋白組分的存在和不 存在、組蛋白的定位、組蛋白的排列以及與染色質締合的調節蛋白的存在或不存在。可以比 較基因任一區域的染色質結構，包括但不限於增強子元件、激活子元件、啟動子、TATA盒、 轉錄起始位點的上遊區域、轉錄起始位點的下遊區域、外顯子和內含子。在又一實施方案中，方法包括抑制至少一種HDAC的活性；去甲基化CpG 二核苷酸 中的至少一個胞嘧啶；以及誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因的表達。在又一實施方案中，方法包括使細胞接觸HIDAC抑制劑；抑制HDAC的活性；以及 誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達。在又一實施方案中，方法還包括製備重 編程的細胞。重編程的細胞可以是復能或多能的。本發明的方法、組合物和試劑盒的HDAC抑制劑可以與任何HIDAC相互作用。例 如，本發明的HDAC抑制劑可以與來自HDAC的四種已知類之一的HDAC相互作用。本發明的 HDAC抑制劑可以與I類、II類、III類或IV類的HDAC相互作用。HDAC抑制劑可以與一種 特定類的HDAC、所有類的HDAC或與多類HDAC相互作用，所述多類HDAC包括但不限於I類 和II類；I類和III類；I類和IV類；II類和III類；II類和IV類；III類和IV類；I、II 和III類；II、III和IV類；以及I、II、III和IV類。HDAC抑制劑還可以與不屬於已知類 之一的HDAC相互作用。HDAC抑制劑可以具有不可逆的作用機制或可逆的作用機制。HDAC抑制劑可以具 有任何結合親和力，包括但不限於毫摩爾(mM)、微摩爾(μΜ)、納摩爾(ηΜ)、皮摩爾(ρΜ) 和分摩爾(fentamolar，fM)。優選地，這種抑制是特異性的，S卩，組蛋白脫乙醯酶抑制劑降低組蛋白脫乙醯酶從 組蛋白移除乙醯基的能力所用的濃度低於該抑制劑產生另一不相關的生物作用所需的濃 度。優選地，組蛋白脫乙醯酶抑制活性所需的抑制劑濃度比產生不相關的生物作用所需的 濃度低至少2倍、更優選低至少5倍，甚至更優選低至少10倍，並且最優選低至少20倍。在另一實施方案中，HDAC抑制劑可以通過與含鋅的HDAC催化結構域結合而起作 用。具有這種作用機制的HDAC抑制劑屬於幾組⑴氧肟酸，例如曲古抑菌素A ;(ii)環四肽；(iii)苯甲醯胺；(iv)親電子的酮；和(ν)化合物的脂肪酸基團，例如苯丁酸鹽和丙戊酸。在又一實施方案中，HDAC抑制劑可針對於sertuin III類HDAC，它們是NAD+依賴 性的，並且包括但不限於煙醯胺、NAD的衍生物、二氫香豆素、萘吡喃酮和2-羥基萘醛。在又一實施方案中，HDAC抑制劑可以改變非組蛋白效應分子的乙醯化程度並從而 增加基因的轉錄。本發明的方法、組合物和試劑盒的HDAC抑制劑不應被認為是僅作為HDAC 的酶抑制劑起作用。已知大量非組蛋白轉錄因子和轉錄輔調蛋白通過乙醯化被修飾，包括 但不限於ACTR、cMyb、p300、CBP、E2Fl、EKLF、FEN l、GATA、HNF-4、HSP90、Ku70、NF κ B、PCNA、 p53、RB、Runx, SF1、Sp3、STAT、TFIIE、TCF和YYl。可以用本發明的方法增加參與激活轉錄 的被乙醯化的任何轉錄因子或蛋白的活性。表I提供了可以充當HDAC抑制劑的化合物的代表性列表。表I中「同種型」的含 義是指僅提供了關於化合物對於特定類的HDAC是否具有偏愛的理解。列出特定同種型或 類的HDAC不應解釋為意指化合物僅對該同種型或類具有親和力。本發明的HDAC抑制劑包 括本文所提及的任何HDAC抑制劑的衍生物和類似物。丁酸或丁酸鹽是被鑑定的首個HDAC抑制劑。然而，毫摩爾濃度的丁酸鹽可能對 HDAC不是特異性的，它還可以抑制核蛋白的磷酸化和甲基化以及DNA甲基化。類似物苯基 丁酸鹽以類似方式起作用。更具體的是曲古抑菌素A(TSA)和trapoxinCTPX)。TPX和TSA 已作為組蛋白脫乙醯酶抑制劑出現。TSA可逆地抑制HDAC酶，而TPX不可逆地結合併滅活 HDAC酶。與丁酸鹽不同，還沒有報導TSA或TPX對其他酶系統的非特異性抑制。丙戊酸也抑制組蛋白脫乙醯酶活性。VPA是依據不同的分子作用機制而具有多種 生物活性的已知藥物。VPA是抗癲癇藥物。VPA是致畸的。當在妊娠期間用作抗癲癇藥物 時，VPA可以在少數百分比的出生兒中誘導出生缺陷(神經管閉合缺陷和其他畸形)。在小 鼠中，VPA在正確給藥時在大多數小鼠胚胎中是致畸的。VPA激活核激素受體(PPAR-δ)。表I.可以充當HDAC抑制劑的化合物的代表性列表。
權利要求
1.一種重編程細胞的方法，所述方法包括將細胞群暴露於抑制組蛋白脫乙醯酶的活 性、表達、或活性和表達的劑；誘導復能基因的表達；選擇表達指示復能細胞的細胞表面標 記物的細胞；以及擴增所述選擇的細胞以製備細胞群，其中所述細胞已恢復分化潛能。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述選擇細胞還包括比較所述細胞在暴露於所述劑 之前和之後的表型，以及鑑定具有與復能細胞一致的表型的細胞。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述選擇細胞還包括使用針對由復能基因編碼的蛋 白的抗體或針對細胞表面標記物的抗體。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述細胞表面標記物選自由下列組成的組SSEA3、 SSEA4、Tra-1-60 和 Tra-1-81。
5.如權利要求1所述的方法，所述方法還包括在擴增所述細胞之前，比較所述細胞在 暴露於所述劑之前存在的復能基因的染色質結構與暴露於所述劑之後獲得的染色質結構。
6 如權利要求5所述的方法，其中所述比較染色質結構包括比較組蛋白的乙醯化狀態。
7.如權利要求5所述的方法，其中所述復能基因選自由下列組成的組0ct-4、SOX-2和Nanog0
8.如權利要求1所述的方法，其中所述劑選自由下列組成的組小分子抑制劑、核酸序 列和shRNA構建體。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述組蛋白脫乙醯酶選自由下列組成的組HDAC1、 HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、 SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6 和 SIRT7。
10.一種重編程細胞的方法，所述方法包括將細胞暴露於抑制HDAC的活性、表達、或 表達和活性的第一劑；將所述細胞暴露於抑制第二調節蛋白的活性、表達、或表達和活性的 第二劑，其中所述第二調節蛋白具有與HDAC不同的功能；誘導復能基因的表達；以及選擇 細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。
11.如權利要求10所述的方法，其中將所述細胞同時暴露於所述第一劑和所述第二劑。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述選擇細胞包括使用針對由復能基因編碼的蛋 白的抗體或針對細胞表面標記物的抗體來分離細胞。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述細胞表面標記物選自由下列組成的組 SSEA3、SSEA4、Tra-1-60 和 Tra-1-81。
14.如權利要求10所述的方法，其中選擇所述細胞包括比較所述細胞在暴露於所述第 一劑和所述第二劑之前和之後的表型。
15.如權利要求10所述的方法，其中所述第一劑和第二劑選自由下列組成的組小分 子抑制劑、核酸序列和shRNA構建體。
16.如權利要求10所述的方法，其中所述第二調節蛋白選自由下列組成的組組蛋白 脫乙醯酶、組蛋白乙醯基轉移酶、賴氨酸甲基轉移酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白脫甲基酶、 賴氨酸脫甲基酶、sirtuin和sirtuin激活蛋白。
17.一種富集的重編程的細胞群，所述重編程的細胞群根據包括下列步驟的方法製備 將細胞群暴露於抑制組蛋白脫乙醯酶的活性、表達、或活性和表達的劑；誘導復能基因的表達；選擇表達指示復能細胞的細胞表面標記物的細胞；以及擴增所述選擇的細胞以製備細 胞群，其中所述細胞已恢復分化潛能。
18.如權利要求17所述的富集的重編程的細胞群，其中所述重編程的細胞表達選自由 下列組成的組的細胞表面標記物SSEA3、SSEA4、Tra-I-60和Tra-I-81。
19.如權利要求17所述的富集的重編程的細胞群，其中所述復能基因選自由下列組成 的組0ct-4、Nanog 和 Sox_2。
20.如權利要求17所述的富集的重編程的細胞群，其中所述重編程的細胞佔所述群的 至少60%。
全文摘要
本發明涉及重編程細胞的方法、組合物和試劑盒。在一個實施方案中，本發明涉及包括誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達的方法。在又一實施方案中，方法包括用HDAC抑制劑抑制HDAC的活性，並誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達。在又一實施方案中，本發明涉及重編程的方法，該方法包括將細胞暴露於抑制多於一種類型的調節蛋白的多於一種的劑。在又一實施方案中，本發明涉及重編程的細胞或富集的重編程的細胞群，該重編程的細胞或富集的重編程的細胞群可以具有ES樣細胞的特徵，它可以再分化或轉分化為多種分化的細胞類型。
文檔編號C12N15/113GK102083981SQ200980120752
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月7日 優先權日2008年4月7日
發明者K·J·埃勒特森, 瓊·S·瑞姆, 瑞秋·A·帕沃爾 申請人:紐珀滕索有限公司