用鏈黴菌製備外源蛋白的方法
2023-09-19 23:30:00 1
專利名稱：用鏈黴菌製備外源蛋白的方法
由歐洲專利的公開號為(EP-A)0289936可知，製備融合蛋白質的方法，是將欲得到的蛋白質的結構基因偶聯到按需要交換了的串聯基因密碼鏈的3′-末端上，這個結構基因在宿主細胞鏈黴菌上得到表達，分泌出合的融合蛋白質自細胞中分離出，一種優選的實施形式是於3′-末端縮短串聯基因，為此，限制性內切酶BstEII的酶切位點在三聯體31和32處，Stui在三聯體的43和44處，Sau3A在三聯體的52和53處。
本發明思想的進一步發展，是提出了製備融合蛋白質的方法，此時，被縮短的前胰島素跟隨串聯部分，它的C-鏈只是由一個或兩個賴氨酸殘基組成(「小型前胰島素」)。再進一步發展，提出了在該融合蛋白中，串聯部分也被縮短了(見1990年5月9日公開的EP-A-0367163。
現在卻意外地發現，在鏈黴菌中具有非常短的串聯部分的融合蛋白質是很穩定的，並且可從培養基中分離出，由於非常短的串聯鏈，這樣得到的融合蛋白有「成熟蛋白」的特點，並且在培養基中通常以富三級結構的形式存在。
EP-A0177827報導了表達系統中為使蛋白質運載的合成密碼順序，其特徵是，該DNA基本上相當於天然的密碼順序，但核酸內切酶的或多或少的酶切位置表明，它並不含於天然DNA中。若將負責運載蛋白的基因偶聯到某個DNA序列中，這個融合基因在一載體上建成，因而宿主細胞發生轉化，將外引物蛋白(ex-primierteProtein)自細胞漿中轉運出。因此，可在原核生物細胞和真核生物細胞中製備真核生物、原核生物或病毒蛋白。作為實例的胞漿外蛋白鹼性磷酸酶表明，在大腸桿菌的表達中，下面是有利的在連結原順序時，鹼性磷醯酶的大約前40個胺基酸的密碼要植於所需蛋白質的結構基因之前。在多數情況下，要補充少許胺基酸，例如大約10個，最合適是大約5個。具有猿原胰島素的相應的融合蛋白大約有90%轉運到胞漿外周空間。
在WO91/03550(1991年3月21日公開)也提到了製備融合蛋白質的方法，即組建混合型的寡核苷酸，它構成融合蛋白的壓載(Ballast)部分的密碼，這些寡核苷酸插接在這樣的區段，以便使它偶聯在起調控功能的部位和所需蛋白結構基因上。由此得到的質粒宜於宿主細胞的轉化，並選擇出編碼有高產率的融合蛋白的克隆，寡核苷酸以4-12個三聯體組成為好，尤以4-8個三聯體最好。
已試圖製備具有短壓載部分的融合蛋白，例如製備了這樣的融合基因，這種為製備融合蛋白的基因有β-半乳糖苷酸的前10個胺基酸及生長因素釋放抑制因子的密碼。然而實驗表明，為了保護融合蛋白免受宿主細胞中特異的蛋白酶的破壞，這樣短的β-半乳糖苷酸的片斷是不夠的(US-A4366246，第15欄，第2段)，而相應於歐洲專利EP-A-0290005和0292763報導的融合蛋白的壓載片段卻有多於250個胺基酸組成。
但是融合蛋白是串聯基因的大約前10個氨基端的胺基酸和所需的蛋白質(例如前胰島素)時，在鏈黴菌宿主細胞中卻出人意料地穩定並分泌到介質中，由介質中可以得到高產率的融合蛋白，這也意外地適用於較小的蛋白質如「小型前胰島素」。
此外「大約10個胺基酸」表明，也涉及較少的胺基酸，例如串聯的只有7個N-端胺基酸，但最好不超過10個。優選的融合蛋白是它的串聯部分的7位和/或9位為脯氨酸(如天然順序那樣)。但是，按照已知的或預定的結構類型選擇較大的串聯-壓載部分顯然也是可能的，不過微小的「壓載部分」的優點自然會越來越喪失掉。
改變串聯部分的天然胺基酸次序、交換或刪去某些胺基酸，或者插入在天然胺基酸順序中不存在的胺基酸是可以的甚至是有利的。
本發明思想的特別有利的融合技術，可以通過簡單的預試驗得到了解。
另外，還可以用其它革蘭氏陽性細菌來實現本發明思想，例如用桿菌或葡萄球菌細胞，使用這些宿主已知的信息順序列。
按照本發明得到的融合蛋白以溶解的形式存在於培養基，這對進一步處理和精製有許多優點。例如用酶法進一步直接處理分泌產物以裂解掉壓載部分，否則必須進行處理步驟，如同對不溶性的融合蛋白質所必須處理的那樣。在進一步處理之前可以進行濃縮或純制，例如用親和色譜，超過濾，沉澱，離子交換色譜，吸附色譜，凝膠過濾或高壓液相色譜。
如下的實施例是對本發明作進一步說明。
質粒結構的原料是在EP-A0367163提及的質粒PKK500。該質粒與EP-A0289936提及的質粒PKK400的區別是用類似的基因代替前胰島素基因，該類似的基因在C-鏈處只有賴氨酸密碼，並且在連結該「小型前胰島素」基因處插入一個終止密碼順序。在EP-A0367163中的表1和表2重列出「小型前胰島素」基因和終止密碼順序，作為附錄列於其上。
質粒PKK400和PKK500在α-澱粉酶抑制劑基因中含有XmaIII內切點(在三聯體-5～-7處)。
實施例1PKK500用限制酶EcoRI和XmaIII切開，大片段於0.8%瓊脂糖凝膠中經凝膠電泳分離，並用電洗脫分出。該片段與用磷酸脒方法合成的DNA片段(1)(SEQIDN0∶1)連結，並將此連結混合物轉化到大腸桿菌中。
-5-1AlaGlyProAlaSerAla5'GGCCGGGCCGGCCTCCGCC3'CCCGGCCGGAGGCGG(XmaIII)AspThrThrValSerGluProGACACGACCGTCTCCGAGCCG3'CTGTGCTGGCAGAGGCTCGGCTTAA5'(EcoRI)得到的質粒PKK510含有原前胰島素密碼，串聯的7個胺基酸按照串聯編碼順序複製，並由此制出小型前胰島素鏈。
實施例2用類似於EP-A0289936所述將質粒PKK400轉變成表達質性PGF1的方法，將質粒PKK510轉變成表達質粒PKF1將分離出的PKK510質粒DNA用限制性內切酶的SphI和SstI切割，小片段同融合基因分離，市售的表達質粒PIJ702(在英國諾維治的JohnInnes基金會可以買到)用同樣的酶進行酶切，分離出大片段。將分出的兩個片段連接，連接的混合物轉化到變鉛青鏈黴菌TK24。從抗硫鏈絲菌素，白色的轉化子中分離質粒。對攜帶有插入片段的克隆菌株進行振搖培養對生成的融合蛋白加以研究。
編碼融合蛋白基因的表達以已知的方法進行將轉化的菌株於25℃擺瓶中培養4天，培養液中的菌絲體離心分離，用20μl培養濾液，進行15%聚丙醯胞凝膠電泳杆測培養液中的融合蛋白電泳後，考馬斯藍染色可清楚地看到蛋白帶，這條蛋白帶在對照實驗中不出現，對照實驗的菌株採用含PIJ702轉化子進行。
培養濾液若用賴氨醯蛋白酶處理，可用凝膠電泳鑑定出脫-(B30)-蘇-胰島素，後者用已知對照樣品確證了。
此外，培養基濾液中的融合蛋白不還可用免疫血中的胰島素抗體或者用胰島素-RIA確證。
實施例3按照實施例1和2的方法，若加入SEQ ID NO2合成片段，則得到質粒PK320或PKF2。
-5-1AlaGlyProAlaSerAla5'GGCCGGGCCGGCCTCCGCC3'CCCGGCCGGAGGCGG(XmaIII)5AspThrThrValSerGluProAspProGACACGACCGTCTCCGAGCCCGACCCG3'CTGTGCTGGCAGAGGCTCGGGCTGGGCTTAA5'(EcoRI)
該質粒偏吸融合蛋白的密碼，該融合蛋白與實施例1和2得到的蛋白區別在於在串聯的前7個胺基酸中有門冬醯氨(代替了天然胺基酸丙氨酸的位置)，以及隨後的在串聯中新生成的胺基酸脯氨酸。門冬醯胺代替了丙氨酸後，融合蛋白的多餘部分引入了附加的正電荷。產率意外地比實施例2高大約20-30%。
實施例4按照實施例1和2的方法，但加入具有SEQINNO3的合成片段，則得到質粒PKK330或PKF。
-5-1AlaGlyProAlaSerAla5'GGCCGGGCCGGCCTCCGCC3'CCCGGCCGGAGGCGG(XmaIII)5AspThrThrValSerGluProAlaProGACACGACCGTCTCCGAGCCCGCACCG3'CTGTGCTGGCAGAGGCTCGGGCGTGGCTTAA5'該質粒與實施例1和2的區別是，它含有串聯前4個天然胺基酸的密碼，與實施例相比，產率大約高10%。
實施例5由PKK500編碼的融合蛋白在串聯部分和前胰島素B鏈之間含有一個連段序列，它含有胺基酸Asn-Ser-Asn-Glv-Lys的密碼，如下面所述的那樣，該末端的賴氨酸和C鏈生成的賴氨酸被精氨酸置換了，在這裡利用了前胰島素順序的密碼範圍為B30到A1的單一的StyI切點。
分離出的PKK500質粒DNA用StyI酶切切用Sl核酸酶消化的除掉伸出的末端，過剩的核酸酶同酚-氯仿萃取。線型的質粒最後再用EcoRI切開，用電泳方法將大的片段分離，並用電洗脫分出。該片段與合成的片段(4)連接(SEQINNO4)B110Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser HisAAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CACGC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG(EcoRI)
2030Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe PheCTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTCGAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAGB30 C(B31)Tyr Thr Pro Lys Thr ArgTAC ACC CCC AAG ACC CGCATG TGG GGG TTC TGG GCG並將連接的混合物轉化到大腸桿菌對質粒進行限制性內切酶酶切分析以確定所需克隆，形成了SstII新酶切位點。此外，對SphI-SstI片段進行了序列分析。
為了表達融合蛋白的編碼基團，已測序的將(用順序分析檢查的)片段與用同樣的酶切的PIJ702片段連接，從而形成表達載體PGF4。
由PGF4編碼和分泌的融合蛋白，一方面可以用α-澱粉的抑制劑平皿試驗(EP-A0161629，實施例3)證明，另一方面可以用類似於實施例2的方法由振搖的培養基液來證明。
實施例6若按實施例5將片段(4)連到載體PKK510，520和530上，則得到載體PKK610，620和630，將帶有融合蛋白密碼序列各個SphI-SstI片段裝到載體PIJ702上，則得到表達載體PKF11，12和13。分泌出的融合蛋白的表達按實施例2進行檢定。
關施例77為了提高質粒PIJ702衍生物的表達，通過PstI和SphI酶切，由質粒上除掉黑色素啟動子，並加入合成片段(5)(SEQIDNO5)1020304050CTGCAGTGATCAGGGGGACCCTTGTGCGAATTTCCGTTACGGGTTTGGGTGGTAGGGGACGTCACTAGTCCCCCTGGGAACACGCTTAAAGGCAATGCCCAAACCCACCATCCCSphI607080ACGCACCCGAAGAGGAGGCCCCAGCATGCTGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG這樣，合成的和串聯啟動子可以得到重組構造，該質粒命名PGR110的標記。
若用SphO和SstI酶切後，將合成的片段(1)，(2)和(3)連至PGR110中，則得到表達載體PGR200，210和220。同樣，用片段(4)得到表達載體PGR250，260和270。
實施例8合併應用胰蛋白酶成類似作用酶和羧肽酶作用於胰島素前體形成人胰島素則在降解反應中迅速地裂解掉氨基末端的壓載部分，這是很有利的，目的是使裂解反應有利於向B31(精氨酸)-胰島素的方向進行。胺基酸的改變在胺基酸B1(苯丙氨酸)之前，可按如下進行按照實施例1進行，用內切酶EcoRI和DraIII切開質粒PKK500，然後，原來的片段被用磷醯脒方法合成的DNA片段(6)代替(SEQIDNO6)B1Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu5'AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3'3' GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG 5'(EcoRI)(DraIII)在大腸桿菌中克隆和變鉛青鏈黴菌表達分別按實施例1和2進行。分別得到質粒PKK640和表達質粒PKF14。
按照實施例5(連接上片段(4)後)用此質粒也可進行類似的處理，這樣得到質粒PKK650和PKF15。
表1B110ASN SER ASN GLY LYS PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HISAAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CACGC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG(EcoRI)2030LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHECTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTCGAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAGCA140TYR THR PRO LYS THR LYS GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SERTAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCCATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG50ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STPATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAATAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATTGTC GAC CTG CAG CCACAG CTG GAC GTC GGT TCG ASalI(HindIII)表權利要求
1.製備融合蛋白的方法，其特徵是，將欲得到的蛋白的結構基因偶聯到信號序列編碼和串聯的大約前10個氨基端的胺基酸的密碼上，該基因結構在鏈黴菌宿主細胞中得到表達，並由培養基中分離出分泌的融合蛋白，該融合蛋白上的串聯基團順序可以變換。
2.製備基因結構的方法，其特徵是，將信息序列和串聯的前10個密碼偶聯到其它蛋白的結構基因上。
3.按照權利要求2的方法，其特徵是，在串聯部分中胺基酸的密碼被刪去，交換或添加。
4.按照權利要求2和3的方法，其特徵是，在欲得的蛋白質的串聯基因和結構基因之間，插入連接基因序列。
5.製備雜合子的方法，其特徵是，將權利要求2，3或4的一個結構基因插入到鏈黴菌的載體上，
6.鏈黴菌細胞轉化的方法，其特徵是，將權利要求5的一種載體引入到該細胞中。
全文摘要
在鏈黴菌宿主細胞以高產率進行了基因結構，該基因含有信息順序、串聯的前10個胺基酸和所希望的蛋白質密碼，在培養介質中分泌出融合蛋白。
文檔編號C07K14/36GK1055952SQ9110254
公開日1991年11月6日 申請日期1991年4月20日 優先權日1990年4月21日
發明者克勞斯-培特·考勒, 古瑟·裡斯 申請人:赫徹斯特股份公司