一種骨質疏鬆相關基因及其編碼蛋白和用途的製作方法
2023-09-19 23:39:10 6
專利名稱：一種骨質疏鬆相關基因及其編碼蛋白和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種骨質疏鬆相關的人類新基因及其編碼蛋白，蛋白的抗體。本發明還涉及這種新的基因及其編碼蛋白在在製備預防和/或治療骨質疏鬆症、與人體細胞轉錄因子AP-1有關的疾病的藥物中的用途，或在製備調節細胞增殖、凋亡、存活、分化、癌變等的藥物或試劑中的用途。本發明還涉及該基因在宿主細胞中外源表達會抑制AP-1的活化。
背景技術：
骨質疏鬆症是一個骨骼系統的疾病，以骨強度下降，骨折風險增加為特徵。對於婦女絕經後的5-10年內還有一個松質骨丟失的加速過程。骨質疏鬆症後果嚴重，是老年人群致死、致殘的常見原因，預計到2050年，全世界髖骨骨折人數將由1990年的170萬人增至630萬人，骨質疏鬆症醫療費用高，由其引起的骨折導致巨大的醫療資源佔用，給社會帶來沉重負擔。
骨質疏鬆症重在預防。目前，可以用於治療骨質疏鬆症的藥物有二膦酸鹽、降鈣素等，但都為治療藥物，不適用於預防，並且價格昂貴；雌激素對於骨質疏鬆症的預防、治療效果確切，但作用範圍廣泛，作用不僅限於骨骼。因此，有必要尋找新的藥物治療靶點，發明新的副作用小、具有預防和治療效果的藥物。
信號通路是目前研究熱點。通過規模化的篩選影響信號通路的基因是研究新功能基因、發現新藥物靶點的有效方法。激活蛋白-1(AP-1)是最早被鑑定的細胞轉錄因子，是多種細胞信號傳導通路在細胞核內的交匯點(Karin etal.，1997)。AP-1屬於鹼性亮氨酸拉鏈類超家族成員，由bZIP類蛋白組成異源或同源二聚體發揮功能。在哺乳動物中，這類bZIP蛋白主要包括Jun、Fos、Maf和ATF四類亞家族。AP-1通常是由fos和jun互相結合形成異二聚體。AP-1識別TPA應答元件(TRE)或cAMP應答元件(CRE)。TPA是一個強的腫瘤啟動子，可通過活化PKC而誘導AP-1並與AP-1結合位點結合。
AP-1活性受到嚴謹、動態的調控，多種生理刺激、環境因素和胞內的調節蛋白都可以調控AP-1的活性。包括血清、生長因子、佛波醇酯和癌基因、細胞因子、神經遞質、多肽激素、細胞-基質相互作用、細菌和病毒感染以及許多物理和化學應激都可誘導AP-1的活性。這些刺激可以激活MAPK級聯反應，進而通過磷酸化特異亞基來激活AP-1的轉錄活性。另外，基因抑制也可調節AP-1的一些生物效應。
AP-1是人體最重要的轉錄因子之一，作為細胞內信號轉導途徑的樞紐，它參與了人體多種生理與病理過程，如凋亡，學習過程，胚胎發育，藥物引發的行為反應，骨的生長與分化。它參與誘導多種多樣的細胞及病毒化基因的表達，在多種類型細胞的基因表達調節中起多效性作用，特別對於增殖和細胞周期中多種基因的表達都起作用。這些基因對細胞增殖、凋亡、存活、分化、癌變信號進行應答而被激活，其中包括許多細胞因子、生長因子、神經遞質、多肽激素等。
AP-1參與了腫瘤侵襲/轉移的多個環節。多種癌基因如Ras，通過活化AP-1而參與腫瘤的轉化和轉移。AP-1也能與其他轉移因子協同參與轉移，研究發現AP-1家族成員與ATF/CREB家族成員的bZIP基序結合，形成雜合二聚體，在人黑色素瘤細胞轉移中起重要作用[Xie S，Price J E，Luca M，et al.Oncogene，1997，15(17)2069-2075]；AP-1還可影響瘤細胞運動，如用JNk顯性負性突變體阻斷AP-1活化，能顯著抑制細胞遷移能力；AP-1也與粘附分子表達密切相關；AP-1的活化參與血管生成介質的異常表達。基於AP-1在轉移相關基因表達調控中的重要正性作用，抑制AP-1可能有防治腫瘤轉移的意義如肝素能抑制AP-1相關的轉移通路而抑制血管生成，抑制MMPs等多種基質降解酶的激活。
另外，AP-1對於病毒性肝炎的發病機制研究有重要意義，病毒性肝炎的病毒蛋白通過與AP-1的相互作用可以部分解釋病毒感染髮病的分子生物學機制。Lee et al研究發現B型肝炎病毒(HBV)基因增強子1(EnhI)上有特異的AP-1結合位點。病毒蛋白和一些其他的激活因子可通過與AP-1結合位點的作用調控HBV的轉錄與表達。與Jun和Fos家族的相互作用也是影響AP-1功能的重要方式；Tsutsumi et al研究發現在HCV感染相關HCC中，c-Jun氨基末端激酶，AP-1的活性及下遊的效應因子活性均升高，因此，體內細胞因子的表達伴隨AP-1的激活和核心蛋白的表達可能在持續HCV感染的肝細胞惡性轉化中有重要作用。
此外，AP-1在心肌纖維化過程中起了重要作用，慢性酗酒者中常存在維生素A不平衡，並可引起肝視黃酸水平下降，阻礙視黃醇信號的傳遞，增強AP-1，故可引起肝星狀細胞的增殖和活化；AP-1也可以促使激活的HSC產生更多的基質金屬蛋白酶抑制劑-1，抑制膠原分解，誘導並加劇肝纖維化的產生。還有，誘導細胞凋亡或抗滑膜增生的AP-1、增生細胞核抗原(PCNA)等又是類風溼關節炎基因治療的靶基因。而最近日本國立遺傳學研究所和捷克南波希米亞大學的研究人員發現了AP-1蛋白可調控生物體的防禦系統，並受MBF1蛋白而免於被氧化。常染色體顯性遺傳多囊性腎病(ADP-KD發病至少與PKD1、PKD2和PKD3三個基因有關。PKD1和PKD2基因突變導致AP-1活化障礙，腎小管上皮細胞不能發育成熟，從而形成ADPKD[Amuld T，Sellin L，Benzing T，et al.Mol Cell Biol，1999；1946(8)]。感覺神經釋放的神經肽(P物質)對傷口癒合的質量和速度有重要影響，原癌基因c-fos、c-jun可能是P物質調控內源性生長因子表達的又一核轉錄因子。AP-1調控NFAT介導的IL-2基因啟動子轉錄活性對於闡明引起膿毒症免疫功能障礙的詳細發病機制，明確機體所處的免疫狀態提供新思路。Vallian等發現早幼粒細胞白血病PML的轉錄調節活性與AP-1複合體有關。PML生長抑制作用可能是通過作用於AP-1的組成成分或調控生長的相關因子激活AP-1所致。而AP-1在藥物產生渴求效應中也有一定作用。
研究表明，AP-1在骨骼發育、骨量維持中發揮重要作用。過表達C-Fos的轉基因小鼠和嵌合體小鼠的骨、軟骨及造血細胞的發育會受到明顯影響，發生骨肉瘤。純合子的C-Fos基因敲除小鼠生長遲滯、缺少破骨細胞、骨重建缺如、發生骨質疏鬆。因此，c-Fos是巨噬細胞/破骨細胞系及骨重建的重要調節因子。過表達Fra-1或FosB使骨形成增加，轉基因小鼠出現骨硬化症。FosB是Fos缺少羧基端的剪切體，能與其他AP-1如JunD形成異源二聚體而影響轉錄。對改變Fra-2表達的基因工程小鼠的研究表明，Fra-2對成骨細胞和破骨細胞的發育均有重要作用。Fra-2基因敲除小鼠骨量減少，破骨細胞數目明顯升高。JunB基因缺失小鼠骨量減少，骨轉換明顯升高。JunD在骨中的作用尚不清楚，JunD基因敲除小鼠出生後生長受抑，但並未發現骨表型的改變。JunD和Fra-2主要表達於分化過程中的成骨細胞。Menin基因可以通過拮抗JunD而抑制成骨細胞發育。
隨著研究的深入，目前發現很多調節骨量、影響骨發育的激素都與AP-1之間存在著聯繫。所有核受體可以抑制AP-1調控基因的轉錄，如包括糖皮質激素受體、雌激素受體、甲狀腺素受體等。AP-1與核受體之間存在著複雜的相互作用，從而調控核受體發揮轉錄激活或轉錄抑制作用。老年性骨質疏鬆是一種常見的疾病，除於雌激素水平不足有關外，成骨細胞功能受損也參與骨質疏鬆的發病機理，Tohjima等人報導AP-1活性下降可能與老化的成骨細胞功能受損有關係。
發明內容
針對現有技術及現有藥物或試劑的不足，本發明的目的是提供一種骨質疏鬆相關的人類新基因GMSS555，該基因的表達受雌激素抑制，另外，該基因在宿主細胞中外源表達具有抑制AP-1活化的作用，且抑制AP-1活化的作用明顯、穩定。
本發明的另一目的是提供上述基因所編碼的蛋白質。
本發明的另一目的是提供含有上述基因的載體，和該基因及其載體轉化或轉導的宿主細胞。
本發明的另一目的是提供上述基因所編碼的蛋白質的抗體和用於檢測的核酸分子。
本發明的另一目的是提供上述基因及其編碼多肽的用途。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案在本發明的第一方面，提供了一種骨質疏鬆相關的新基因，該基因的核苷酸序列選自(a)SEQ ID NO1的編碼序列或全長序列；(b)編碼SEQ ID NO2的胺基酸序列的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)限定的核苷酸序列具有至少90％相似性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(d)在高嚴謹條件下可與(a)或(b)或(c)限定的多核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
上述高「嚴謹條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與本發明所述的多肽有相同的生物學功能和活性。
在本發明的第二方面，提供了骨質疏鬆相關的新基因GMSS555編碼的蛋白質，該蛋白質的胺基酸序列選自(a)SEQ ID NO2的胺基酸序列；(b)與SEQ ID NO2的胺基酸序列具有至少90％相似性的胺基酸序列；(c)將SEQ ID NO2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加衍生的胺基酸序列。
在本發明的第三方面，提供了含有新基因GMSS555或其片段的載體，還提供了該基因或該載體轉化或轉導的宿主細胞。
本發明中的基因可以插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒，如腺病毒、逆轉錄病毒，或者其他載體。在本發明中適用的載體可以是原核表達載體，也可以是真核表達載體，如在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)，在哺乳動物細胞中高表達的真核表達載體pcDNATM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen)。只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以應用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。用本領域的技術人員熟知的方法來構建含有本發明所述多核苷酸序列和轉錄/翻譯控制信號的表達載體即可。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組DNA技術等(Sambrook，et al.MolecularCloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。
本發明的多核苷酸序列可有效地連接到表達載體中的適當的啟動子上來指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。表達載體優選的包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性、或真核細胞培養用的綠色螢光蛋白(GFP)、新黴素抗性及二氫葉酸還原酶。
本發明還涉及用上述載體或者本發明的多核苷酸經基因工程產生的宿主細胞。本發明的載體和多核苷酸可以用於轉化適當的宿主細胞。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞； 293T、Hela細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常有10-300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。例子有在複製起始點下遊的100-270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點下遊的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域的普通技術人員都知道如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主細胞為原核細胞如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收集，用CaCl2法處理，所用步驟是本領域眾所周知的。可供選擇的是MgCl2處理，也可用電穿孔的方法處理。當宿主是真核細胞時，可選擇以下轉染方法磷酸鈣共沉澱法、常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，來表達本發明的多核苷酸所編碼的多肽。根據所選的宿主細胞選擇合適的常規培養基，在適於宿主細胞生長的條件下培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用適當的方法如溫度轉化或化學誘導，來誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
上述方法中的重組多肽可包被於細胞內、細胞外或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其他特性通過各種分離方法分離和純化重組多肽。這些方法是本領域技術人員所熟知的，如常規的復性處理，用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種液相層析技術或這些方法的結合。
在本發明的第四方面，提供了與GMSS555基因所編碼的蛋白質特異性結合的抗體，還提供了用於檢測的核酸分子，它含有權利要求1所述基因的核苷酸序列中的8-100連續的核苷酸。
本發明的多肽及其片段、衍生物、類似物或表達它們的細胞可以作為抗原來生產抗體。這些抗體包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的抗體。本發明的多肽的抗體可用本領域公知的抗體製備方法來生產。例子有單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。多克隆抗體的生產可用本發明的多肽免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術產生(Morrison et al.PNAS，1985，816851)。單鏈抗體也可用已有的技術生產(U.S.Pat No.4946778)。
本發明還涉及與本發明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含有15個核苷酸，較好的是至少30個核苷酸，更好的是至少50個核苷酸，最好的是至少100個核苷酸。此核酸片段通常是在本發明的核苷酸序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。上述核酸片段可以用於PCR擴增技術(如作為引物)以確定和/或分離編碼具有誘導人體細胞凋亡功能的多核苷酸；也可以作為雜交所用的探針。也可以用於RNA幹擾技術。本發明的多核苷酸的一部分或全部也可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片上，用於分析組織中基因的差異表達和基因診斷。探針的標記可用放射性同位素，螢光素或酶(如鹼性磷酸酶)等。
在本發明的第五方面，提供了基因GMSS555在宿主細胞中外源表達會抑制AP-1活化的應用，還提供了GMSS555基因或其編碼多肽在製備預防和/或治療骨質疏鬆症或與人體轉錄因子AP-1有關的疾病的藥物中的用途。
雌激素幹預可以影響本發明基因的表達水平。雌激素對於骨質疏鬆症的預防、治療效果確切，但作用範圍廣泛，不僅限於骨骼。
本發明的基因在宿主細胞中外源表達還可以抑制人體轉錄因子AP-1的活化。人體細胞轉錄因子AP-1活化與炎症、腫瘤等多種疾病相關，尤其與細胞增殖、凋亡、存活、分化、癌變等密切相關。
本發明的多肽可以單獨或與合適的藥用載體組合使用。這種組合物可以包含治療有效量的多肽或拮抗劑以及藥學可接受的載體或賦型劑，這樣的載體包括但不限於鹽水，緩衝鹽水，葡萄糖，水，甘醇，乙醇，或混合物，這些製劑應適合給藥方式。
本發明的藥物組合物可以以適當的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹腔內、肌內、皮下等途徑給藥。給藥於患者的用量取決於許多因素，如給藥方式，待治療者的身體條件和診斷醫生的判斷。
本發明的多肽也可以通過在活體表達這些多肽來使用。例如患者的細胞可以通過在體外用編碼本發明多肽的基因進行基因工程操作，然後將工程細胞提供給患者，使工程細胞在體內高表達這種多肽，從而達到治療的目的。
在本發明的第六方面，提供了一種骨質疏鬆症或炎症或腫瘤的體外檢測方法，利用上述核酸片段或抗體來檢測宿主樣品中的蛋白質的存在或水平。
本發明的其他方面由於本文的技術的公開，對本領域技術人員而言是顯而易見的。
本發明為進一步研究雌激素或人體轉錄因子與本發明中的基因的調控關係，以及開發治療骨質疏鬆症、炎症、和腫瘤以及調節細胞增殖、凋亡、存活、分化、癌變等的新藥物，為開創新的臨床診斷、療效評價及預後指標奠定必要的基礎。
圖1表達載體pDrive-GMSS555的構建示意圖。
圖2GMSS555的表達受雌激素抑制的RT-PCR鑑定。第一泳道為標準品；第二泳道為未加雌激素時GMSS555表達；第三泳道為雌激素作用七天時GMSS555表達；第四泳道為未加雌激素時內參照β-actin表達；第五泳道為雌激素作用七天內參照β-actin表達。
圖3真核表達載體pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555的構建示意4pX-luc螢光素酶基因報告質粒的結構圖(X為NF-κB、NFAT、AP-1、CRE、STAT1其中之一)。
圖5GMSS555外源表達抑制PMA和離子黴素對AP-1的活化。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等箸，科學出版社)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1、雌激素作用前後骨外膜細胞差異表達基因文庫的構建、測序及驗證採用胰酶、膠原酶兩步消化法分離人原代骨膜組織；1×105/孔的密度接種於6孔培養板，含有1nM 17-βE2(Sigma)及對照(等體積無水乙醇)的無酚紅的成骨誘導培養液，每三天更換1次培養液，共培養七天；採用RNeasyMini Kit試劑盒(QIAGEN，74104)提取細胞總RNA，OligotexmRNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN，70022)純化mRNA；PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit(Clontech，K1804-1)獲得雌激素作用骨外膜細胞中特異性表達的cDNA和雌激素未作用細胞中特異表達的cDNA；純化PCR產物，去除引物、單核苷酸和鹽類雜質；使用PCR Cloning Kit(QIAGEN，231122)，將差異DNA連接到pDrive克隆載體上，如圖1所示；將連接產物在2.0Kv，200Ω，25μF條件下進行電轉入DH5α感受態細胞中。
將轉化後菌液塗布含有氨苄青黴素和卡那黴素的LB固體培養基上，並進行藍白斑選擇，挑取白色菌落，常規擴增、提取質粒、測序。
根據測序結果，Cross-match程序去除載體、宿主菌序列，以Phrap程序進行聚類、拼接，根據Genbank資料庫將每條序列進行注釋，選擇其中未報導功能的基因，進一步對差減庫結果進行RT-PCR驗證。
驗證細胞培養採用建庫時相同的方法，提取RNA，逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)按照SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen，18064-014)試劑盒說明書進行。經反轉錄後，以β-actin作為內參照，引物序列為GMSS555正向引物AGGTGTATCTGCGCTGTGCG反向引物AGGCTCGTGGGTAACTTGCTGβ-actin正向引物GGCGGCACCACCATGTACCCT反向引物AGGGGCCGGACTCGTCATACT反應條件如下25μl PCR體系，其中含有10×TaqDNA聚合酶緩衝液2.5μl
dNTP 2μl 終濃度各200μM逆轉錄cDNA模板1μl (200ng)GMSS555引物 2μl 各1μMβ-actin引物 2μl 各1μMTaq DNA聚合酶 2.5U用雙蒸水補足至25μl按94℃ 5分鐘一個循環，94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 1分鐘25個循環，72℃ 10分鐘一個循環進行PCR擴增；PCR結束後取8微升進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果以天能凝膠成像系統(天能GIS-2016)進行圖像分析。
結果如圖2所示第一泳道為標準品；第二泳道為未加雌激素時GMSS555表達；第三泳道為雌激素作用七天時GMSS555表達；第四泳道為未加雌激素時內參照β-actin表達；第五泳道為雌激素作用七天內參照β-actin表達。經圖像分析軟體分析表明雌激素幹預前後GMSS555表達差異具有顯著性。
實施例2、從骨膜組織中PCR獲得目的基因實施例1中得到的基因GMSS555的序列為序列表中的序列1，根據該序列設計全長閱讀框架的特異性引物正向引物5『GAGCCGGCGCCAGAGCATG 3』反向引物5『GGAGTCAGTCCGTGCCAACCT 3』取胎兒骨膜組織，用Trizol試劑(invitrogen)按廠方說明書提取總RNA，SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System(Invitrogen，18064-014)獲得的骨膜cDNA做為模板進行PCR擴增反應，反應條件如下反應體積50μl，其中含有骨膜cDNA模板 1μl(200ng)引物 正向引物、反向引物終濃度各0.4μMdNTP 終濃度各200μMTakara LA Taq DNA聚合酶2.5U2×GC緩衝液25μl用雙蒸水補足至50μl體積按94℃ 5分鐘一個循環，94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分鐘35個循環，72℃ 10分鐘一個循環進行PCR擴增，獲得含完整開放閱讀框序列的基因擴增產物，擴增產物進行測序驗證。隨後將目標PCR產物純化，與pDrive-T載體連接，測序，結果即為序列1；再以常規技術構建pcDNA3.1/mycHis(-)B為載體的真核表達質粒。
實施例3、雙螢光素酶報告基因法測定GMSS555對PMA+離子黴素誘導AP-1活化的抑制作用。
本發明採用雙螢光素酶報告基因法檢測GMSS555基因對AP-1活化的抑制功能，該方法採用的是體內信號轉導途徑順式報導系統，其中所用的報告質粒載有螢火蟲螢光素酶基因，該基因的表達由合成的啟動子所調控，其中包含基本的啟動子元件(TATA box)，以及轉錄因子的結合位點，報告質粒的結構圖如圖4所示。當細胞內的轉錄因子通過某種信號轉導途徑而被活化時，轉錄因子便會結合於報告質粒的增強子元件，從而啟動報告基因螢火蟲螢光素酶基因的轉錄，進一步胞內翻譯成螢光素酶，導致細胞內螢光素酶數量增加，活性增強；相反，當細胞內的轉錄因子活化受到抑制的時候，螢光素酶的表達量及活性就低。所以，通過檢測螢光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共轉染的目的基因對細胞內轉錄因子是否具有活化或者抑制活化的功能。pRL-TK報告質粒載有水母螢光素酶基因，該基因的表達由猿猴病毒40(SV40)增強子/啟動子所調控，轉染哺乳動物細胞後可以產生較強的基本水平的水母螢光素酶的表達，且表達的活性不受CRE活化與否的調節，所以在實驗中用作內對照報告基因。
用目的基因pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555和報告基因pAP-1-luc，pRL-TK共轉染人胚胎腎293T細胞，通過分別檢測兩種螢光素酶活性來測定AP-1的活性。共轉染的方法為陽離子非脂性轉染法，採用vigofect(威格拉斯生物技術(北京)有限公司)，按產品說明書所述進行。
轉染操作步驟如下(1)細胞培養將293T細胞(ATCC NumberCRL-11268)(2.0×104)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養基(Hyclone，SH0022.02)鋪在96孔細胞培養板(Costar，3599)上，接種密度1.2萬/孔，培養基體積100ul/孔，在5％CO2，37℃的培養箱中培養18-24小時。
(2)製備轉染複合物取2.5ul生理鹽水稀釋40ng報告基因pCRE-luc，4ng pRL-TK和50ng目的質粒pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555，緩慢混合均勻；同樣用2.5μl生理鹽水稀釋適當量的vigofect(一般為0.04ul/孔)，緩慢混合均勻，在室溫下放置5分鐘，與稀釋的DNA緩慢混合，室溫放置15分鐘，以形成轉染複合物。
(3)轉染將轉染複合物緩慢滴入細胞培養板(5μl/孔)，輕微搖勻。5％CO2，37℃的培養箱中培養18-24小時。
轉染18-24小時後用PMA(十四酸佛波酯，Calbiochem，524400，終濃度50ng/ml)+離子黴素(Calbiochem，407950，終濃度1uM)刺激細胞，37℃孵箱培養。6-8小時後棄去培養液，加入Passive Lysis Buffer(Promega，E1960)，放入-80℃冰箱。檢測時，取出細胞板，室溫下自然解凍，使細胞完全裂解，10μl細胞裂解液移至白色螢光板，加入Dual-luciferase雙報告系統檢測底物，通過tecan微孔板酶標儀(Genios Pro，Tecan)檢測螢光素酶活性。
實施例4、雙螢光素酶報告基因法測定GMSS555對PMA+離子黴素誘導NFAT活化的抑制作用。
報告基因為pNFAT-luc，其餘與實施例3相同。
實施例5、雙螢光素酶報告基因法測定GMSS555對毛猴素(Forskolin)誘導CRE活化的抑制作用。
報告基因為pCRE-luc，刺激物為毛猴素，其餘與實施例3相同。
實施例6、雙螢光素酶報告基因法測定BPY2IP1對PMA+離子黴素誘導NF-κB活化的抑制作用。
報告基因為pNF-κB-luc，其餘與實施例3相同。
實施例7、雙螢光素酶報告基因法測定BPY2IP1對γ-幹擾素誘導STAT1活化的抑制作用。
報告基因為pSTAT1-luc，刺激物為γ-幹擾素，其餘與實施例3相同。
設定轉染pcDNA3.1/mycHis(-)B空載體、不加刺激物時細胞內的螢光素酶活性比值(螢火蟲螢光素酶螢光強度/水母螢光素酶螢光強度表示)為1，其他條件下細胞內的螢光素酶活性比值以此為標準，用相對值表示。
結果參照圖5，用pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555和報告質粒共轉染293T細胞，未用刺激物時，在各個信號通路中293T細胞中螢光素酶的活性均有所下降；經過不同刺激物刺激後，AP-1信號傳導通路中的293T細胞中螢光素酶的活性明顯地下降，而在其他信號傳導通路中看不到螢光素酶的活性明顯下降，表明GMSS555基因在293T細胞中的表達產物對PMA+離子黴素誘導AP-1活化有強的抑制作用。因此，本發明可以用於闡明GMSS555基因的生物學功能及其在炎症、腫瘤發生中的作用，從而明確相關疾病的發生機制，為疾病的治療和藥物開發提供靶向位點。
實施例8、抗體製備抗原選用原核細胞或真核細胞表達的GMSS555蛋白全長或部分肽段，也可以合成多肽作為抗原。
多克隆抗體的製備免疫動物選用成年雄性紐西蘭兔或BALb/c小鼠，初次免疫用200ug(紐西蘭兔)或20ug(BALb/c小鼠)抗原與等體積弗氏完全佐劑(FCA)充分乳化後，於背部皮下多點注射。初次免疫後21、42、63天，用弗氏不完全佐劑(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加強免疫1次，用量同前。每次免疫後7~10天，ELISA方法檢測血清效價，達到1×10-4時，放血分離血清.Western blot鑑定抗體特異性。單克隆抗體製備免疫BALb/c小鼠同前，取脾臟製成B細胞懸液，與對數生長期的骨髓瘤細胞SP2/0融合，通過HAT(H，次黃嘌呤；A，氨基喋呤；T，胸腺嘧啶核苷)選擇性培養，獲得雜交細胞系，再通過ELISA方法檢測抗體效價，篩選出特定的雜交瘤細胞系，並得到單克隆抗體。
序列表110中國醫學科學院北京協和醫院北京諾賽基因組研究中心有限公司120一種骨質疏鬆相關基因及其編碼蛋白和用途130
1602170PatentIn version 3.32101211947212DNA213人220
221CDS222(247)..(936)4001ttacgggcct ctagactcga gcggccgcca ctgtgctgga tatctgcaga attcgattga 60gccggcgcca gagcatgcgg ggcgctcccg ctgctgctcc tgctcctggc cgggctgctg 120ggcggcgcgg gcgcgcagta ctccagcgac cggtgcagct ggaaggggag cgggctgacg 180
cacgaggcac acaggaagga ggtggagcag gtgtatctgc gctgtgcggc gggtgccgtg 240gagtgg atg tac cca aca ggt gct ctc atc gtt aac ctg cgg ccc aac288Met Tyr Pro Thr Gly Ala Leu Ile Val Asn Leu Arg Pro Asn1 5 10acc ttc tcg cct gcc cgg cac ctg acc gtg tgc atc agg tcc ttc acg 336Thr Phe Ser Pro Ala Arg His Leu Thr Val Cys Ile Arg Ser Phe Thr15 20 25 30gac tcc tcg ggg gcc aat att tat ttg gaa aaa act gga gaa ctg aga 384Asp Sec Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Thr Gly Glu Leu Arg35 40 45ctg ctg gta ccg gac ggg gac ggc agg ccc ggc cgg gtg cag tgt ttt 432Leu Leu Val Pro Asp Gly Asp Gly Arg Pro Gly Arg Val Gln Cys Phe50 55 60ggc ctg gag cag ggc ggc ctg ttc gtg gag gcc acg ccg cag cag gat 480Gly Leu Glu Gln Gly Gly Leu Phe Val Glu Ala Thr Pro Gln Gln Asp65 70 75atc ggc cgg agg acc aca ggc ttc cag tac gag ctg gtt agg agg cac 528Ile Gly Arg Arg Thr Thr Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Val Arg Arg His80 85 90agg gcg tcg gac ctg cac gag ctg tct gcg ccg tgc cgt ccc tgc agt 576Arg Ala Ser Asp Leu His Glu Leu Ser Ala Pro Cys Arg Pro Cys Ser95 100 105 110
gac acc gag gtg ctc cta gcc gtc tgc acc agc gac ttc gcc gtt cga 624Asp Thr Glu Val Leu Leu Ala Val Cys Thr Ser Asp Phe Ala Val Arg115 120 125ggc tcc atc cag caa gtt acc cac gag cct gag cgg cag gac tca gcc 672Gly Ser Ile Gln Gln Val Thr His Glu Pro Glu Arg Gln Asp Ser Ala130 135 140atc cac cgg cgc gtg agc aga ctc tat cgg cag aaa agc agg gtc ttc 720Ile His Arg Arg Val Ser Arg Leu Tyr Arg Gln Lys Ser Arg Val Phe145 150 155gag ccg gtg ccc gag ggt gac ggc cac tgg cag ggg cgc gtc agg acg 768Glu Pro Val Pro Glu Gly Asp Gly His Trp Gln Gly Arg Val Arg Thr160 165 170ctg ctg gag tgt ggc gtg cgg ccg ggg cat ggc gac ttc ctc ttc act 816Leu Leu Glu Cys Gly Val Arg Pro Gly His Gly Asp Phe Leu Phe Thr175 180 185 190ggc cac atg cac ttc ggg gag gcg cgg ctc ggc tgt gcc cca cgc ttc 864Gly His Met His Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe195 200 205aag gac ttc cag agg atg tac agg gat gcc cag gag ggg ggg ctg aac 912Lys Asp Phe Gln Arg Met Tyr Arg Asp Ala Gln Glu Gly Gly Leu Asn210 215 220cct tgt gag gtt ggc acg gac tga ctccaatcaa g 947Pro Cys Glu Val Gly Thr Asp
2252102211229212PRT213人4002Met Tyr Pro Thr Gly Ala Leu Ile Val Asn Leu Arg Pro Asn Thr Phe1 5 10 15Ser Pro Ala Arg His Leu Thr Val Cys Ile Arg Ser Phe Thr Asp Ser20 25 30Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Thr Gly Glu Leu Arg Leu Leu35 40 45Val Pro Asp Gly Asp Gly Arg Pro Gly Arg Val Gln Cys Phe Gly Leu50 55 60Glu Gln Gly Gly Leu Phe Val Glu Ala Thr Pro Gln Gln Asp Ile Gly65 70 75 80
Arg Arg Thr Thr Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Val Arg Arg His Arg Ala85 90 95Ser Asp Leu His Glu Leu Ser Ala Pro Cys Arg Pro Cys Ser Asp Thr100 105 110Glu Val Leu Leu Ala Val Cys Thr Ser Asp Phe Ala Val Arg Gly Ser115 120 125Ile Gln Gln Val Thr His Glu Pro Glu Arg Gln Asp Ser Ala Ile His130 135 140Arg Arg Val Ser Arg Leu Tyr Arg Gln Lys Ser Arg Val Phe Glu Pro145 150 155 160Val Pro Glu Gly Asp Gly His Trp Gln Gly Arg Val Arg Thr Leu Leu165 170 175Glu Cys Gly Val Arg Pro Gly His Gly Asp Phe Leu Phe Thr Gly His180 185 190Met His Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Lys Asp195 200 205
Phe Gln Arg Met Tyr Arg Asp Ala Gln Glu Gly Gly Leu Asn Pro Cys210 215 220Glu Val Gly Thr Asp22權利要求
1.一種骨質疏鬆相關的基因，其特徵在於，所述基因的核苷酸序列選自(a)SEQ ID NO1的編碼序列或全長序列；(b)編碼SEQ ID NO2的胺基酸序列的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)限定的核苷酸序列具有至少90％相似性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(d)在高嚴謹條件下可與(a)或(b)或(c)限定的多核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.權利要求1所述基因編碼的蛋白質，其特徵在於，所述蛋白質的胺基酸序列選自(a)SEQ ID NO2的胺基酸序列；(b)與SEQ ID NO2的胺基酸序列具有至少90％相似性的胺基酸序列；(c)將SEQ ID NO2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加衍生的胺基酸序列。
3.一種載體，其特徵在於，所述載體含有權利要求1所述的基因。
4.一種遺傳工程宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞選自(a)用權利要求3所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求1所述的基因轉化或轉導的宿主細胞。
5.一種抗體，其特徵在於，所述抗體是能與權利要求2所述的蛋白質特異性結合的抗體。
6.一種核酸片段，其特徵在於，所述核酸片段含有權利要求1所述的任一基因中8-100個連續的核苷酸。
7.權利要求1所述的骨質疏鬆相關基因或權利要求2所述的蛋白質在製備預防和/或治療骨質疏鬆症的藥物中的應用。
8.權利要求1所述的基因在抑制AP-1活化中的應用，其特徵在於所述基因在宿主細胞中外源表達會抑制AP-1的活化。
9.權利要求1所述的骨質疏鬆相關基因或權利要求2所述的蛋白質在製備預防和/或治療與人體細胞轉錄因子AP-1有關的疾病的藥物中的用途，或在製備調節細胞增殖、凋亡、存活、分化、癌變等的藥物或試劑中的用途。
10.一種骨質疏鬆症或炎症或腫瘤的體外檢測方法，其特徵在於，利用權利要求5所述的抗體或權力要求6所述的核酸片段來檢測宿主樣品中的多肽的存在或水平。
全文摘要
本發明公開了一種骨質疏鬆相關的人類新基因及其編碼蛋白和用途。該基因的核苷酸序列選自(a)SEQ ID NO1的編碼序列或全長序列；(b)編碼SEQ ID NO2的胺基酸序列的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)限定的核苷酸序列具有至少90％相似性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(d)在高嚴謹條件下可與(a)或(b)或(c)限定的多核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發明為進一步研究雌激素或人體轉錄因子與本發明中的基因的調控關係，以及開發治療骨質疏鬆症、炎症、和腫瘤以及調節細胞增殖、凋亡、存活、分化、癌變等的新藥物，為開創新的臨床診斷、療效評價及預後指標奠定必要的基礎。
文檔編號A61K38/17GK1982454SQ200510134520
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月15日 優先權日2005年12月15日
發明者林守清, 宮偉雁, 劉勇, 黃曼婷, 鄧唯唯, 石太平, 馬大龍 申請人:中國醫學科學院北京協和醫院, 北京諾賽基因組研究中心有限公司