構建前列腺癌細胞體外浸潤模型的製作方法

2023-09-20 02:05:10 1

專利名稱：構建前列腺癌細胞體外浸潤模型的製作方法
技術領域：
本發明涉及構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，用於構建篩藥模型，屬生物醫藥技術領域。
背景技術：
建立篩藥模型，是提高藥物篩查效率的手段，如下述參考文獻
1、儲劍虹.前列腺癌淋巴道轉移相關基因的探索.2005年4月。2、新藥(西藥)臨床前的研究指導原則彙編。3、細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則(第二稿)2006年1月。4、鍾恩宏，孫祖越等，Bcl-2基因家族在前列腺增生與前列腺癌形成中的作用， 《實用癌症雜誌》2002，17 (5):553-560。5、鍾恩宏，孫祖越，顧正，吳建輝，朱焰，何桂林，劉桂明.依立雄胺前列腺癌細胞 (LNCaP)前列腺特異性抗原和Bcl-2蛋白體外表達抑制作用，《中國藥理學與毒理學雜誌》 2003，17(1)29-34。6、鍾恩宏，孫祖越，吳建輝，朱焰.依立雄胺對激素依賴型人前列腺癌細胞的體外抑制作用，《中國新藥與臨床雜誌》，2004，23 (8) :485-488。7、儲劍虹，孫祖越，人前列腺癌移植性轉移動物模型的研究進展，《實驗動物與比較醫學》2005，25 (2) :119-125。8、儲劍虹，吳建輝，朱焰，蔣秀蓉，劉桂明，何桂林，孫祖越，利用PC-3M-1E8細胞亞系建立人前列腺癌淋巴道轉移模型，《中國藥理學與毒理學雜誌》2005，19(2) 140-145。9、Jian-hong Chu, Zu-yue Sun, Xue Lian Meng, Jian Hui ffu, Gui Lin He, Gui Ming Liu and Xiu Rong Jiang. Differential metastasis-associated gene analysis of prostate carcinoma cells derived from primary tumor and spontaneous lymphatic metasis in nude mice with orthotopic implantation of PC—3M cells. Cancer Letters 2006，233(1) : 79-8 10、儲劍虹，李志玲，孟雪蓮，吳建輝，劉向雲，邱曉燕，朱焰，劉桂明，何桂林，蔣秀蓉，曹霖，孫祖越.利用基因晶片法探索人前列腺癌細胞PC-3M在裸鼠體內淋巴道轉移相關基因·《中國癌症雜誌》2006，16(1) :31-34。

發明內容
本發明的目的在於構建前列腺癌細胞體外浸潤模型。本發明目的通過下述技術方案實現
一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，取對數生長期生長良好的腫瘤細胞，採用侵襲小室法構建體外侵襲模型，將無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮多孔濾膜粘附於侵襲小室的上、 下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠於37°C下作用1小時，使膠凝固，前列腺癌細胞離心後以無血清的F12培養液重懸，加到侵襲小室的上室中，下室加入10%胎牛血清的F12培養液，置37°C、5%的(X)2培養箱中培養約10小時，計數。具體，提供一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型取對數生長期生長良好，長至 70%密度的前列腺癌細胞，用F12培養液預處理細胞兩天；在無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮 Sum孔徑多孔濾膜的上表面鋪以50ul的濃度為lg/L基質膠於37°C下作用1小時，使膠凝固，再以無血清培養液洗滌兩次後備用；將處理過的多孔濾膜粘附於侵襲小室的上室底部， 並在濾膜下室面做標記；下室加入10%胎牛血清的F12培養液；將粘有多孔濾膜的上室插入下室，並確保上、下室間無氣泡；取生長至對數期的上述癌細胞，用2. 5g/L胰酶消化離心後以無血清的F12培養液重懸，以IO5個細胞加到侵襲小室的上室中；蓋上帽子，置37°C、 5%的(X)2培養箱中培養約10小時；取出濾膜，用棉籤拭去濾膜上表面細胞；用0. 1%的結晶紫染色數分鐘，於200倍光鏡下計數多孔濾膜下室面侵襲的細胞數，計數中間和四周共5個視野，每組計數三份樣本，求出平均數，重複上述過程1次。本發明提供針對上述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型使用的侵襲小室，其特徵在於由有機玻璃或玻璃材質的下室、上室和帽部組成，其中，所述的下室設有一圓底形小孔， 圓底形小孔上方為一延至上表面的擴徑部，在擴徑部與圓底形小孔間形成一平臺；所述的上室外廓為T形，其內設一孔徑與圓底形小孔的孔徑相同的通孔，上室的下部插在擴徑部內，周向與擴徑部匹配，底部與平臺貼合，上室上部的底面與下室的上表面貼合。如上述所述的侵襲小室，至少上室的下部外廓與下室的擴徑部表面為磨砂玻璃狀，增加下室與上室的密配合度，提高氣密性。下室與上室的外廓為圓柱形，上室的上部與下室的外徑相同，當上室的下部插至下室的擴徑部的平臺時，上、下室形成一密配合的圓柱體，帽部蓋在上室的上部平面處，帽部與上室的上部外廓周圍有環隙。本發明提供針對上述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型的用途，用於構建腫瘤細胞體外浸潤篩藥模型。本發明的優越性在於
提供了一種腫瘤細胞體外浸潤模型，為藥物篩查提供了便利；自製的侵襲小室結構簡單，成本低廉，可重複使用，使實驗成本大大降低，因實驗時每個裝置為獨立的個體，徹底杜絕了交叉汙染，提高了實驗的準確率。


圖1 侵襲小室分解結構示意圖。圖2侵襲小室圖片，其中，圖a為粘上多孔濾膜的細胞上室，b為將上室插入下室， c為蓋上帽部的侵襲小室。圖3為培養瓶中生長的PC-3M細胞電鏡照片。圖4PC-3M細胞穿透多孔濾膜結晶紫染色，小孔中紫色顆粒為穿透的PC-3M細胞 400 X。圖 1 中
1一下室，11一圓底形小孔，12—擴徑部， 2—上室，21—通孔，3—帽部。
具體實施例方式一，侵襲小室的製備
如圖1侵襲小室分解結構示意圖所示，侵襲小室由玻璃材制的下室1、上室2和帽部3 組成，其中，下室1設有一直徑為0. 9cm圓底形小孔11，圓底形小孔11上方為一延至上表面的擴徑部12，在擴徑部12與圓底形小孔間形成一平臺；上室2外廓為T形，其內設一孔徑與圓底形小孔11的孔徑相同的直徑為0. 9cm通孔21，上室1的下部插在擴徑部12內，周向與擴徑部12匹配，底部與平臺貼合，上室2上部的底面與下室1的上表面貼合。方便清洗， 且可根據實驗需要選擇本發明的個數，各裝置間因獨立放置，不會有交叉汙染情況出現。其中，至少對上室2的下部外廓與下室1的擴徑部12表面進行粗糙處理的磨砂玻璃，增加上室2與下室1接觸面的密封性。本實施例中，下室1與上室2的外廓為圓柱形，上室2的上部與下室1的外徑相同， 當上室的下部外徑為1. 6cm，下室1的擴徑部徑向尺寸亦為1. 6cm,當上室2的下部插至下室1的擴徑部12的平臺時，上、下室形成一密配合的圓柱體，帽部3蓋在上室2的上部平面處，帽部與上室的上部外廓周圍有環隙，以利於透氣。二，構建前列腺癌細胞體外浸潤模型
一)實驗材料 1、主要試劑
(1)Matrigel (基質膠)北京寶曼科技有限公司，批號BM_1803 ；
(2)胎牛血清(FBS)=HyClone生物化學製品(北京)有限公司，批號NSK0069 ；
(3)F12培養基=HyClone生物化學製品(北京)有限公司，批號NUC0151。2、主要儀器
(1)超淨工作檯=Boxun；
(2)CO2 培養箱=Heraeus ；
(3)倒置相差顯微鏡=Motic公司；
(4)多聚碳酸酯膜上海歡奧科貿有限公司；
二)細胞資料
1、細胞PC_3M細胞由北京大學醫學部病理學教研室提供；
2、細胞株培養條件
PC-3M細胞株於含10%胎牛血清，青鏈黴素各100U/ml的F-12培養基，37°C ,5% CO2的飽和溼度下培養，細胞成貼壁生長，用0. 25%的胰酶消化傳代。三)細胞侵襲重建基底膜實驗
1，取對數生長期生長良好，長至70%密度的癌細胞，用F12培養液預處理細胞兩天； 2，採用侵襲小室法構建體外侵襲模型進行實驗，見圖2，其中，圖a為粘上多孔濾膜的細胞上室，b為將上室插入下室，c為蓋上帽部的侵襲小室。3，在無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮(PVP)多孔濾膜(Sum孔徑)的上表面鋪以50ul的 Matrigel (lg/L)於37°C下作用1小時，使膠凝固，再以無血清培養液洗滌兩次後備用；
4，將濾膜粘附於侵襲小室的上室底部，並在濾膜下室面做標記；
5，下室加入10%胎牛血清的F12培養液；
6，將粘有濾膜的上室插入下室，並確保上、下室間無氣泡；
57，取生長至對數期的癌細胞，用2. 5g/L胰酶消化離心後以無血清的F12培養液重懸， 以IO5個細胞加到侵襲小室的上室中；
8，蓋上帽子，置37°C、5%的(X)2培養箱中培養約10小時； 9，取出濾膜，用棉籤拭去濾膜上表面細胞；
10，用0. 1%的結晶紫染色數分鐘，於200倍光鏡下計數膜背面侵襲的細胞數，計數中間和四周共5個視野，每組計數三份樣本，求出平均數，實驗重複1次。方法取對數生長期生長良好的前列腺癌細胞(PC-3M)，採用侵襲小室法構建體外侵襲模型進行檢測，無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮(PVP)多孔濾膜(Sum孔徑)粘附於侵襲小室的上、下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠(Matrigel) (lg/L)於37°C下作用1小時，使膠凝固。癌細胞離心後以無血清的F12培養液重懸，加到侵襲小室的上室中， 下室加入10%胎牛血清的F12培養液，置37°C、5%的(X)2培養箱中培養約10小時。計數。結果
如圖3為培養瓶中生長的PC-3M細胞電鏡照片和圖4為PC-3M細胞穿透多孔濾膜結晶紫染色，小孔中紫色顆粒為穿透的PC-3M細胞400X所示，體外侵襲實驗多孔濾膜上細胞計數PC-3M細胞濾膜穿透率為80個。利用自製侵襲小室模型，可以成功複製體外PC-3M細胞侵襲模型。多孔濾膜經結晶紫染色後，可以清楚看到癌細胞穿透濾膜，計數穿透細胞數為80個。
權利要求
1.一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，其特徵在於取對數生長期生長良好的腫瘤細胞，採用侵襲小室法構建體外侵襲模型，將無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮多孔濾膜粘附於侵襲小室的上、下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠於37°C下作用1小時，使膠凝固，腫瘤細胞離心後以無血清的F12培養液重懸，加到侵襲小室的上室中，下室加入10%胎牛血清的F12培養液，置37°C、5%的(X)2培養箱中培養約10小時，計數。
2.根據權利要求1所述的構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，其特徵在於取對數生長期生長良好，長至70%密度的前列腺癌細胞，用F12培養液預處理細胞兩天；在無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮8um孔徑多孔濾膜的上表面鋪以50ul的濃度為lg/L基質膠於37°C下作用 1小時，使膠凝固，再以無血清培養液洗滌兩次後備用；將處理過的多孔濾膜粘附於侵襲小室的上室底部，並在濾膜下室面做標記；下室加入10%胎牛血清的F12培養液；將粘有多孔濾膜的上室插入下室，並確保上、下室間無氣泡；取生長至對數期的上述癌細胞，用2. 5g/L 胰酶消化離心後以無血清的F12培養液重懸，以IO5個細胞加到侵襲小室的上室中；蓋上帽子，置37°C、5%的(X)2培養箱中培養約10小時；取出濾膜，用棉籤拭去濾膜上表面細胞；用 0. 1%的結晶紫染色數分鐘，於200倍光鏡下計數多孔濾膜下室面侵襲的細胞數，計數中間和四周共5個視野，每組計數三份樣本，求出平均數，重複上述過程1次。
3.針對權利要求1或2所述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型使用的侵襲小室，其特徵在於由有機玻璃材制的下室、上室和帽部組成，其中，所述的下室設有一圓底形小孔，圓底形小孔上方為一延至上表面的擴徑部，在擴徑部與圓底形小孔間形成一平臺；所述的上室外廓為T形，其內設一孔徑與圓底形小孔的孔徑相同的通孔，上室的下部插在擴徑部內，周向與擴徑部匹配，底部與平臺貼合，上室上部的底面與下室的上表面貼合。
4.根據權利要求3所述的侵襲小室，其特徵在於，至少上室的下部外廓與下室的擴徑部表面為磨砂玻璃。
5.根據權利要求3或4所述的侵襲小室，其特徵在於，下室與上室的外廓為圓柱形，上室的上部與下室的外徑相同，當上室的下部插至下室的擴徑部的平臺時，上、下室形成一密配合的圓柱體，帽部蓋在上室的上部平面處，帽部與上室的上部外廓周圍有環隙。
6.針對權利要求1或2所述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型的用途，用於構建前列腺癌細胞體外浸潤篩藥模型。
全文摘要
本發明涉及構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，用於構建篩藥模型，屬生物醫藥技術領域。一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，取對數生長期生長良好的腫瘤細胞，採用侵襲小室法構建體外侵襲模型，將無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮多孔濾膜粘附於侵襲小室的上、下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠於37℃下作用1小時，使膠凝固，腫瘤細胞離心後以無血清的F12培養液重懸，加到侵襲小室的上室中，下室加入10%胎牛血清的F12培養液，置37℃、5％的CO2培養箱中培養約10小時，計數。發明提供了一種腫瘤細胞體外浸潤模型，為藥物篩查提供了便利；自製的侵襲小室結構簡單，成本低廉，可重複使用，使實驗成本大大降低，因實驗時每個裝置為獨立的個體，徹底杜絕了交叉汙染，提高了實驗的準確率。
文檔編號C12Q1/02GK102409024SQ201010290458
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月25日 優先權日2010年9月25日
發明者劉向雲, 孫祖越 申請人:上海市計劃生育科學研究所