轉基因蛋白cp4epsps的定量檢測方法
2023-09-19 08:48:55 1
轉基因蛋白cp4epsps的定量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種定量檢測植物中轉基因蛋白CP4EPSPS的方法，其包括：從待檢植物中提取蛋白，得蛋白提取液；用抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體包被酶標板，封閉液封閉後，加入植物蛋白提取液，孵育，洗滌；加入HRP標記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體，孵育，洗滌；加入底物TMB溶液進行顯色反應；顯色結束後，用硫酸終止反應並在450nm處檢測吸光度值；通過用CP4EPSPS蛋白標準品製作的濃度-吸光度標準曲線，計算待檢樣品中的CP4EPSPS蛋白濃度。本發明的轉基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法準確、可靠，與已有技術相比操作時間短，成本低。
【專利說明】轉基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及轉基因植物檢測【技術領域】，尤其涉及一種轉基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]自1996年孟山都(Monsato)公司上市第一例抗草甘膦大豆一來，轉基因作物的推廣應用經歷了 18年，抗除草劑性狀仍然是轉基因植物的首要性狀。CP4EPSPS被應用於多種作物的轉基因研究中，包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜和苜蓿等。
[0003]隨著各種各樣的轉基因食品通過貿易大量進入國際市場，轉基因食品的安全性受到人們的日益關注，世界各國對轉基因食品的安全性存在著較大的爭議，歐盟、日本等地區已經制定了相關法規對轉基因食品進行了嚴格的管理。因此，檢測轉基因作物/植物中轉基因蛋白的定量技術逐漸成為研究熱點之一。
[0004]實時定量PCR最初是由Applied Biosystems公司於1996年開發的，自此,該方法被廣泛應用於轉基因DNA的測定。由於DNA相對而言較為脆弱，在加熱、存在核酸酶以及低PH值下均可能發生降解，而PCR方法學的可靠性又取決於DNA的完整性，因此，該方法存在一定的局限性。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提出一種準確、可靠的轉基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法，以及基於該檢測方法的試劑盒。
[0006]為達此目的，本發明採用以下技術方案:
[0007]第一方面，本發明提供了一種定量檢測植物中轉基因蛋白CP4EPSPS的方法，該方法包括:
[0008](I)從待檢植物中提取蛋白，得蛋白提取液；
[0009](2)用抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體包被酶標板，封閉液封閉後，加入步驟(I)所得植物蛋白提取液，孵育，洗滌；
[0010](3)加入HRP標記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體，孵育，洗滌；
[0011 ] (4)加入底物TMB溶液進行顯色反應；
[0012](5)顯色結束後,用硫酸終止反應並在450nm處檢測吸光度值；
[0013](6)通過用CP4EPSPS蛋白標準品製作的濃度-吸光度標準曲線，計算待檢樣品中的CP4EPSPS蛋白濃度。
[0014]作為優選，步驟(2)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體為鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體；
[0015]優選地，所述包被在包被緩衝液中進行，所述包被緩衝液為碳酸鹽緩衝液；進一步優選地，所述碳酸鹽緩衝液為Na2CO3-NaHCO3緩衝液，其濃度為0.1M，pH值為9.6 ；
[0016]優選地，所述鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體的包被濃度為1.8?2.2 μ g/ml、優選1.9 ?2.I μ g/ml、更優選 2 μ g/ml ；
[0017]優選地，所述封閉液為含BSA的碳酸鹽緩衝液；
[0018]優選地，加入植物蛋白提取液後的孵育溫度為22?26°C、優選25°C，孵育時間為40?50分鐘、優選45分鐘。
[0019]作為優選，步驟(3)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體為兔抗CP4EPSPS多克隆抗體；
[0020]優選地，所述抗CP4EPSPS的多克隆抗體的濃度為8?12 μ g/ml、優選9?11 μ g/ml、更優選 10 μ g/ml ；
[0021]優選地，加入HRP標記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體後的孵育溫度為22?26°C、優選25 °C，孵育時間為40?50分鐘、優選45分鐘。
[0022]作為優選，步驟(5)中，所述硫酸為1.8?2.2M、優選1.9?2.1M、更優選2M的硫酸。
[0023]第二方面，本發明提供了一種定量檢測植物中轉基因蛋白CP4EPSPS的試劑盒，其包括如下組分:
[0024](I)包被緩衝液，其為碳酸鹽緩衝液；
[0025](2)樣品稀釋液，其為磷酸鹽緩衝液；
[0026](3)洗滌液，其為含Tween-20的磷酸鹽緩衝液；
[0027](4)封閉液，其為含BSA的碳酸鹽緩衝液；
[0028](5)反應終止液，其為H2SO4溶液；
[0029](6)鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體；
[0030](7)辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗CP4EPSPS多克隆抗體；
[0031 ] (8) CP4EPSPS 標準品。
[0032]上述試劑盒中，作為優選，所述碳酸鹽緩衝液為Na2CO3-NaHCO3緩衝液；
[0033]進一步優選地，Na2CO3-NaHCO3緩衝液的濃度為0.1M，pH值為9.6。
[0034]作為優選，所述磷酸鹽緩衝液為PBS緩衝液。
[0035]作為優選，所述洗滌液為含有體積百分含量為0.15?0.25 %、優選0.18?
0.22%、更優選0.2% Tween-20的磷酸鹽緩衝液。
[0036]作為優選，所述反應終止液為1.8?2.2M、優選1.9?2.1M、更優選2M的H2SO4溶液。
[0037]作為優選，所述CP4EPSPS標準品為N端帶6個His標籤的CP4EPSPS。
[0038]本發明提供的轉基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法準確、可靠，與已有技術相比操作時間短，成本低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039]圖1是使用本發明方法檢測CP4EPSPS的標準曲線。
【具體實施方式】
[0040]下文以示例性地方式對本發明進行更詳細地描述。
[0041]實施例1、本發明試劑盒的組裝:[0042]1、緩衝液的配製
[0043](I)包被緩衝液，0.1M碳酸鹽緩衝液CB，pH值為9.6 ;
[0044](2)稀釋液，0.01mM磷酸鹽緩衝液PBS，pH值為7.4 ；
[0045](3)洗滌液，含0.2 %吐溫-20的PBS ；
[0046](4)封閉液，含 I % BSA 的 CB ；
[0047](5)終止液，2M H2SO4 ;
[0048]2、酶標板的製備
[0049](I)包被
[0050]移取一定量CP4EPSPS抗體於所需體積的包被液中，使其濃度約為2 μ g/mL,配置成包被工作液。將包被工作液按每孔100 μ L加入酶標板微孔，4°C靜置過夜(注意要防止水分蒸發)。
[0051](2)封閉
[0052]在CB緩衝液(pH9.6)中加入一定量的小牛血清，水楊酸鈉，蔗糖，使小牛血清，水楊酸鈉，蔗糖的濃度分別為10^,0.05^,5%,配置成封閉工作液。酶標板以洗板機吸乾-洗滌二次，將板條在潔淨的吸水紙上拍幹。將封閉工作液按每孔150 μ L加入微孔，37°C烘焙3小時。
[0053](3)抽乾密封
[0054]棄去封閉液，將板條在潔淨的吸水紙上拍幹，放入冷凍真空乾燥機抽乾3小時，真空熱封。
[0055]3、CP4EPSPS標準品凍乾粉的製備
[0056]大腸桿菌E.coli中原核表達並通過親和純化的His-EPSPS，N端帶有6個His標籤，其母液濃度為3mg/ml，稀釋到900ng/ml，3mL棕色玻璃瓶加入100 μ L900ng/ml標準品，冷凍乾燥機過夜抽乾得到標準品凍乾粉。
[0057]4、酶標記抗體工作液的配置
[0058]酶標抗體的製備:取純化的特異性兔多抗，與HRP進行偶聯，得到酶標記抗體。
[0059]取一定量的酶標記抗體加入到稀釋液中，充分混勻，使其終濃度為2μ g/mL，2_8°C避光保存。
[0060]5、試劑盒的組裝
[0061]
【權利要求】
1.一種定量檢測植物中轉基因蛋白CP4EPSPS的方法，其特徵在於，包括: (1)從待檢植物中提取蛋白，得蛋白提取液； (2)用抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體包被酶標板，封閉液封閉後，加入步驟(1)所得植物蛋白提取液，孵育，洗滌； (3)加入HRP標記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體，孵育，洗滌； (4)加入底物TMB溶液進行顯色反應； (5)顯色結束後,用硫酸終止反應並在450nm處檢測吸光度值； (6)通過用CP4EPSPS蛋白標準品製作的濃度-吸光度標準曲線，計算待檢樣品中的CP4EPSPS蛋白濃度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體為鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體； 優選地，所述包被在包被緩衝液中進行，所述包被緩衝液為碳酸鹽緩衝液；進一步優選地，所述碳酸鹽緩衝液為Na2CO3-NaHCO3緩衝液，其濃度為0.1M，pH值為9.6 ； 優選地，所述鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體的包被濃度為1.8~2.2μ g/ml、優選1.9~2.1 μ g/ml、更優選 2 μ g/ml ； 優選地，所述封閉液為含BSA的碳酸鹽緩衝液； 優選地，加入植物蛋白提取液後的孵育溫度為22~26°C、優選25°C，孵育時間為40~50分鐘、優選45分鐘。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體為兔抗CP4EPSPS多克隆抗體； 優選地，所述抗CP4EPSPS的多克隆抗體的濃度為8~12 μ g/ml、優選9~11 μ g/ml、更優選10 μ g/ml ； 優選地，加入HRP標記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體後的孵育溫度為22~26°C、優選25°C,孵育時間為40~50分鐘、優選45分鐘。
4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特徵在於，步驟(5)中，所述硫酸為1.8~2.2M、優選1.9~2.1M、更優選2M的硫酸。
5.一種定量檢測植物中轉基因蛋白CP4EPSPS的試劑盒，其特徵在於，包括如下組分: (1)包被緩衝液，其為碳酸鹽緩衝液； (2)樣品稀釋液，其為磷酸鹽緩衝液； (3)洗滌液，其為含Tween-20的磷酸鹽緩衝液； (4)封閉液，其為含BSA的碳酸鹽緩衝液； (5)反應終止液，其為H2SO4溶液； (6)鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體； (7)辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗CP4EPSPS多克隆抗體； (8)CP4EPSPS標準品。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述碳酸鹽緩衝液為Na2CO3-NaHCO3緩衝液； 優選地，Na2CO3-NaHCO3緩衝液的濃度為0.1M，pH值為9.6。
7.根據權利要求5或6所述的試劑盒，其特徵在於，所述磷酸鹽緩衝液為PBS緩衝液。
8.根據權利要求5-7任一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述洗滌液為含有體積百分含量為0.15~0.25%、優選0.18~0.22%、更優選0.2% Tween-20的磷酸鹽緩衝液。
9.根據權利要求5-8任一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述反應終止液為1.8~2.2M、優選1.9~2.1M、更優選2M的H2SO4溶液。
10.根據權利要求5-9任一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述CP4EPSPS標準品為N端帶6個His標籤的CP4EPSPS。
【文檔編號】G01N33/68GK104020296SQ201410253821
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】武愛波, 徐偉, 楊文杰, 宋麗敏, 王學武 申請人:無錫福陽生物科技有限公司