一種鼻咽癌早期篩查、診斷試劑及應用的製作方法
2023-09-19 09:09:50
專利名稱：一種鼻咽癌早期篩查、診斷試劑及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及癌症診斷試劑，具體地，本發明涉及含有EB病毒裂解複製期 早期基因BALF1序列表達產物的診斷試劑及其應用。
背景技術：
EB (Epstein-Barr)病毒是一種Y皰疹病毒，全球接近95%的成人感染 有該病毒。EB病毒感染可分為潛伏感染期和裂解複製期兩種狀態，在初次 感染後，該病毒可在宿主體內建立起終身潛伏感染，持續性的EB病毒裂解 複製狀態感染可導致一系列的人類惡性腫瘤(Rickinson et al., 1996)。 EB病毒終生在口咽部產生並通過口腔傳染，初始感染可引起傳染性單核細 胞增多症，多發於兒童和年輕成人。經多年研究發現EB病毒與鼻咽癌、胃 癌、肺癌以及一系列常見淋巴瘤均有相關。其中鼻咽癌與EB病毒關係最為 密切，近年來通過對腫瘤上皮細胞中的病毒基因組與抗原的檢測證實了二者 的密切相關性(ZurHausenetal.,1970;Yeungeta1. 1993)。鼻咽癌是東南亞地區 常見腫瘤，與食道癌、肝癌並稱中國三大腫瘤，且高發於我國南方數省，在 南方各種惡性腫瘤中佔第一位。對於EB病毒相關腫瘤控制的主要策略為1、 早期檢測診斷後進行治療，2、將疾病的發生理想的推遲至平均壽命之外，3、 預防。由於EB病毒無法單獨在體外培養，而大量細胞培養以及純化帶來的 困難和不安全因素使直接從形態學檢測EB病毒很難在臨床上實現，更無法 應用於大規模篩査工作。因此早期診斷多應用病毒特異性的抗原、抗體或遺 傳物質對EB病毒相關腫瘤進行早期診斷是目前控制EB病毒相關腫瘤行之 有效的方法，現在診斷EB病毒相關疾病的主要指標為EB病毒殼抗原 (VCA)、早期抗原(EA)、核抗原(EBNA)、及其抗體。其中EBNA1在 EB病毒潛伏期和裂解期均有表達，目前研究表明，雖然大多數人感染EB病 毒，但多屬於潛伏期感染，而裂解期感染指病毒大量活躍複製，此類型感染與EB病毒所致惡性腫瘤密切相關，因此該抗原的特異性不理想；而VCA與
EA雖然在NPC病人中檢出率高，但其特異性也不好，在健康人群中仍有較 高的檢出率。因此選擇靈敏度與特異性好的檢測指標是現在本研究領域急需 解決的問題之一。
基於持續性的EB病毒裂解複製狀態感染與一系列的人類惡性腫瘤密切 相關的認識，選擇EB病毒列解期表達產物作為檢測指標可能是好的選擇。 現有的EB病毒的裂解期表達產物主要包括BALF1、 BLLF1、 BXLF2、 BALF4、 B0RF2、 BARF1、 BALF5及BZLF1等基因的表達產物。但是，製備疾病檢測試 劑盒，除了需要表達的蛋白在免疫沉澱反應中抗體滴度效價很高外，蛋白還 要足夠的穩定，目前並未有研究表明它們可以作為鼻咽癌及相關疾病的良好 的檢測試劑。
BALF1基因位於EB病毒基因組164397 165059位置，是EB病毒進入裂解 複製狀態早期表達的早期基因，長度為663bp， 1999年由Marshall發現該基因 與人類Bcl2家族具有同源性。BALF1基因編碼蛋白具有凋亡抑制作用，能夠 抑制感染的上皮細胞進入凋亡(Dawsonetal., 1995)。有研究表明BALF1基因 能夠在B淋巴細胞以及上皮細胞中表達相應蛋白，在EB病毒潛伏期僅少量表 達，但一旦病毒進入裂解期，蛋白表達量明顯增高。
目前尚未見使用BALF1基因表達產物作為抗原，作為鼻咽癌早期篩査 和診斷試劑的研究和報導。
發明內容
本發明針對上述本領域急需解決的問題，利用EB病毒裂解複製期早期基 因BALF1的生物學特性，提供了具有高靈敏度和特異性的，可應用於診斷EB 病毒相關疾病以及大規模人群篩査的新型檢測指標及方法。
本發明提供一種試劑盒，它至少包含一種胺基酸序列如SEQ NO. 2所示 的蛋白或其與GST蛋白的融合蛋白。
進一步的，所述試劑盒含有胺基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白或其與 GST蛋白的融合蛋白。
所述試劑盒用於鼻咽癌及相關疾病的早期診斷、篩查和檢測；優選的，所述試劑盒採用ELISA技術。
本發明還提供一種製備胺基酸序列如SEQNO. 2所示的蛋白或其與GST 蛋白的融合蛋白的方法，包括
a、構建含有SEQ N0.3核苷酸序列的重組質粒；b、將重組質粒轉入宿 主細胞；c、收集得到含有SEQN0.2所示胺基酸序列的表達產物粗提物；d、 純化表達產物粗提物，得到胺基酸序列如SEQ NO. 2所示蛋白或其與GST 蛋白的融合蛋白；e、將d步驟得到的純化蛋白進行二次純化。
上述的胺基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白，即BALF1蛋白；或其與 GST蛋白的融合蛋白，即GST-BALF1融合蛋白，這兩種蛋白質分子的靈敏度 與特異性均較好，作為檢測試劑沒有顯著差異，為鼻咽癌以及其它EB病毒相 關疾病的診斷提供新的高靈敏度與特異性的檢測指標。
所述的方法中，步驟a所述的質粒載體為PGEX系列或PET系列的蛋白 表達載體；
步驟b所述的宿主細胞為E.coli.BL21、 DH5a或JM109;
步驟d所述的純化方法為將收集的表達產物粗提物，用Glutahione Sepharose 4B或親和層析柱純化，Xa因子儲存液，Xa因子剪切緩衝液洗脫 離心，或者用穀胱甘肽洗脫液，離心，得到純化的胺基酸序列如SEQ NO. 2 所示蛋白；
步驟e所述的純化方法為透析法、離子交換層析法以及HPLC-分子篩層 析法。
優選的，步驟e所述的純化方法為HPLC-分子篩層析法，所使用的層析 柱為Sepharose-lOO。
我們在使用步驟6或7後保存一段時間後(5h)電泳分析發現蛋白質有 降解現象。因此我們認為可能有其他物質影響了所獲得蛋白的穩定性。我們 採用了不同的方法(透析法，離子交換層析法以及HPLC-分子篩方法)，對蛋 白進行了再次純化並通過電泳分析比較保存一段時間後的降解情況。最終認 為使用HPLC-分子篩的方法進行再次純化獲得的蛋白穩定性最好，因此我們 使用HPLC-分子篩獲得更為穩定的目的蛋白的方法並非顯而易見的方法。
經過本發明的方法製備得到的高度純化的BALF1蛋白GST-BALF1融合蛋白在室溫下保存12小時沒有發生降解，為製備試劑盒提供了可能。而以這兩 種蛋白製備的試劑盒，對鼻咽癌以及其它EB病毒相關疾病的診斷和篩査，其 靈敏度與特異性均很好。
圖1 PGEX-BALF1質粒構建示意圖。
圖2 GST-BALF1融合蛋白在HPLC-分子篩純化前後不同保存時間電泳圖 (室溫下保存，20°C)。
白色箭頭所示為目的蛋白。泳道1為HPLC-分子篩純化前蛋白質保存O 小時電泳圖，2為HPLO分子篩純化前蛋白質保存5小時電泳圖，3為HPLO 分子篩純化後0小時電泳圖，4為HPLC-分子篩純化後保存12小時電泳圖。M 為marker。
圖3 BALF1蛋白在HPLC-分子篩純化前後不同保存時間電泳圖(室溫下 保存，20°C)。
白色箭頭所示為目的蛋白。泳道l為HPLC-分子篩純化前蛋白質保存O 小時電泳圖，2為HPLC-分子篩純化前蛋白質保存5小時電泳圖，3為HPLC-分子篩純化後0小時電泳圖，4為HPLC-分子篩純化後保存12小時電泳圖。M 為marksro
圖4正常組與NPC病人組檢測結果進行R0C分析的結果。
圖5 65例被測樣本的VCA抗體濃度小於8 U/ml為陰性結果，8 U/ml
12 U/ml為可疑結果，大於12 U/ml為陽性結果。
圖6 65例被測樣本的EA抗體濃度小於8 U/ml為陰性結果，8 U/ml
12 U/ml為可疑結果，大於12 U/ml為陽性結果。
具體實施例方式
以下對本發明的詳細描述意在更清楚地說明本發明，但並不限制本發明。 在我們的前期工作中，我們對一系列EB病毒裂解期表達基因利用體外 表達系統進行表達，並對已確診為NPC的患者血清樣本進行免疫沉澱反應， 發現BAFL1蛋白的免疫沉澱反應明顯，其抗體具有作為診斷指標的潛能。經過前期篩選，認為BALF1表達產物作為檢測試劑可能較好，篩選過程為
RT拉出不同的產物cDNA，然後體外真核表達(加入核素標記亮氨酸)，免 疫沉澱，比較不同cDNA的表達產物沉澱量。
實施例1、 PGEX-BALF1的獲得(重組質粒示意圖見圖1)
(1) 引物的設計與合成根據已知BALF1序列設計的PCR引物序列為 F: 5， -GGGGATCCAATGAACCTGGCCATTGCTCTG-3，；
R: 5， -CGGAATTCTTACAAAGATTTCAGGAAGTC-3，
(2) RT-PCR擴增
使用TPA和n-丁酸鹽誘導B95-8或P3服l細胞中的EBV進入裂解期，採 用RT-PCR方法獲得BALF1基因的cDNA，將獲得的產物按照常規方法進行測 序鑑定，證明所得到的cDNA序列如SEQ N0.3所示，與Genbank所公開的一 致。
(3) 使用BamHl， EcoRl內切酶酶切上述PCR產物與質粒PGEX-5X-3 (購 自amersham pharmacia biotech公司)，將酶切產物進行連接，獲得含有 BALF1基因的PGEX質粒，即PGEX-BALF1。經過常規測序鑑定，證明已經將所 得到的cDNA插入到PGEX質粒得到重組質粒PGEX-BALF1 (見圖1)。
實施例2、 GST-BALF1表達蛋白的製備與純化
(1) 用CaCl2法製備大腸桿菌JM109與BL21的感受態細菌，50ul分裝後 液氮保存備用。
(2) 用已經獲得的重組質粒PGEX-BALF1轉化兩種感受態細胞，使用抗生 素進行篩選獲得含有插入片段的陽性克隆。
(3) 將含有陽性重組質粒的JM109陽性克隆的單克隆在含有氨卞青黴素 的LB培養基中擴大培養。提取質粒保存備用，並且製備甘油菌保存備用。
(4) 將含有陽性重組質粒的BL21陽性克隆的單克隆接種在含有氨卞青黴 素(100ug/ul)的2ml LB培養基中，37攝氏度培養過夜。將400ul過夜培養 物分別接種到40ml含氨卞青黴素(100ug/ul)的LB培養基中，於37攝氏度培養7h。加入IPTG至終濃度為lmmol/L， 37攝氏度培養2. 5小時，轉移至50ml 離心管中。室溫4000rpm離心10min，去上清，重懸於預冷的lml含1% Triton-100的PBS中。使用超聲波破菌(200W, 15s X 10次)，12000rpm離心 10min，收集上清。
(5) 重懸GST S印harase4B，取lml裝柱，使用4ml PBS (pH 7. 0)緩衝液平 衡。濾去PBS，打開柱底蓋，取出瓊脂珠，置於一乾淨的3ml離心管中，加 入已經獲得的細菌裂解液上清lml輕輕混勻，置於室溫5 10分鐘，其間混 勻3 5次，500rpm離心10分鐘，去上清。加入2ml PBS重懸，置於室溫5 IO分鐘，其間混勻3 5次，500rpm離心IO分鐘，去上清。重複1次。
(6) 離心管內加入200ul穀胱甘肽洗脫液，輕輕混勻，置於室溫5 10 分鐘，其間混勻3 5次，500rpm離心10分鐘，取上清收集，-80攝氏度保 存備用。將上清液的蛋白按照常規方法進行鑑定，證明上清為純化的 GST-BALF1融合蛋白，其胺基酸序列由GST和SEQ NO. 2所示的序列組成。
(7) 接步驟5，根據細菌蛋白表達多少，在200ulXa因子剪切緩衝液中， 按照試劑說明書，根據不同的蛋白量，加入不同單位的Xa因子後加入離心管 中，輕輕混勻，置於室溫3小時，其間混勻3 5次，500rpm離心IO分鐘， 取上清收集，-80攝氏度保存備用。將上清液的蛋白按照常規方法進行鑑定， 證明上清為純化的BALF1蛋白，其胺基酸序列如SEQ NO. 2所示。
(8) 對驟6獲得的GST-BALF1融合蛋白或步驟7所得到的BALF1蛋白， 使用HPLC-分子篩進一步純化。選用層析柱為S印harose-lOO已裝柱，用2 倍柱床體積已濾菌PBS平衡層析柱，將經過親和層析純化獲得的GST-BALF1 融合蛋白或BALF1蛋白3 ml上樣加入柱中，A260 nm波長觀察柱內流出液體 的蛋白含量，收集峰尖部分蛋白，即為高度純化的GST-BALF1融合蛋白或 BALF1蛋白，-80攝氏度保存備用。
得到的GST-BALF1融合蛋白或BALF1蛋白室溫保存12小時後仍然沒有發 生降解，而未經步驟8 二次純化的GST-BALF1融合蛋白或BALF1蛋白室溫保 存5小時明顯發生降解，前者穩定性顯著好於後者(見附圖2、 3)。
用上述方法製備得到的高度純化的GST-BALF1蛋白或BALF1蛋白按照常 規方法製備成檢測試劑盒。實施例3應用ELISA法檢測血清中BALF1基因表達抗原的抗體。
檢測原理:利用本發明製備的重組抗原包板，加入待檢測血清，待血清中 抗體與包板抗原結合後，應用酶標抗人二抗與抗體結合，顯色測定結果。
(1) 由GST-BALF1蛋白，BALF1蛋白作為不同的診斷抗原組合分別進行 ELISA檢測。
(2) 抗原包被:用包被稀釋液(碳酸鈉緩衝液)分別將上述不同診斷抗原組 合稀釋至100ug/ral。 ELISA酶標板上每孔加入lOOul， 37攝氏度3h。 PBST 洗板五次。
(3) 封閉加入5X牛血清白蛋白封閉液100ul/孔，37攝氏度lh， PBST 洗板五次。
(4) 待測血清血清1:80稀釋後加入反應孔中，100ul/孔，37攝氏度lh， 洗板五次。
(5) 酶標物辣根過氧化物酶(HRP)標記的酶標羊抗人工作液100ul/孔， 37攝氏度lh，洗板5次。
(6) 顯色:加入TMB顯色工作液，100ul/孔，顯色10min。
(7) 中止反應加入l滴中止液中止顯色。
(8) 結果判斷使用450nm波長檢測各孔吸光度(OD)值。
結果使用GST-BALF1融合蛋白，BALF1蛋白作為診斷抗原組合包板對 NPC患者及正常人血清樣本(91例NPC患者血清樣本vsl46例正常人血清樣 本)進行ELISA檢測後，得到數據進行受試者工作曲線分析，以不同Cutoff 值進行敏感性及特異性判定得到表1表1: 採用不同分界值時的診斷效能評價參數表
分界值靈敏度特異度Y0UDEN分界值靈敏度特異度Y0UDEN
0.2460.9890.5180.5070.2820,8780.7870.665
0.2490.9670.5320.4990.2850.8780.7940.672
0.2510.9670.5530.5200.2880.8780，0.686
0.2520.9670.5600.5270.2890.8780.8160.693
0.2530.9670.5740.5410.2920.8780.8230.700
0.2540.%70.5820.5480.2940.8780.8300.708
0.2560.9670.5890.5550.2960.8780.8510.729
0.2570,9670.5960,5620.2970.8560.8510.707
0.2580.9670.6030.5700,3000.8560.8650.721
0.2600.9440.6100.5540.3040,8560.8720.728
0.2610.9440.6170.5610.3070.8560.8790.735
0.2630.9440.6310.5760.3090.8440.8790.724
0.2660.9440.6380.5830.3100,8440.8870,731
0,2680.9440.6520,5970.3110.8440.8940.738
0.2690.9440.6600.6040.3140.8440.9010.745
0,2700.9440.6670,6110.3190.8440.9150.759
0.2710.9440.6740.6180.3230.8220.9150.737
0.2720細0.6880.5880.3250細0.9150.715
0.2740.8780.6950.5730.3270扁0.9290.729
0.2750.8780.7160.5940.3300.8000.9430.743
0.2760.8780.7380.6150,3340.7890.9500.739
0.2770,8780.7520.6300.3430.7890.9570.746
0.2780.8780.7730.6510.3500,7890.9720.761
0.2800.8780.7800.6580.3520.7890.9790,768
我們在實際工作中可以根據實際需要(篩查或確診)確定Cutoff值，我 們以上述數據做出受試者工作曲線(ROC)如附圖4。可見該曲線擬合後其靈敏度和特異性倶佳。隨機抽取NPC樣本中的50例，正常樣本中隨機抽取的6
例，其他非NPC疾病9例共65例血清。進行VCA及EA抗體的檢測，與BALF1 抗體檢測比較，比較結果見表2。
表2不同抗體檢測方法對NPC血清樣本及非NPC血清樣本的檢測結果比較
陽性判定值範圍NPC患者血清 陽性率非NPC患者血清陽 性率
VCA抗體檢測>12 U/ml(+) 8 12 U/ml (±) <8 U/ml(-)0%0%
EA抗體檢測>12 U/ml(+) 8 12 U/ml (±) <8 U/ml(-)機14%
BALF1抗體檢測OD值〉0. 388%7%
VCA檢測結果如圖5，其判定值範圍小於8U/ml為陰性結果，8U/ml 12 U/ml為可疑結果，大於12 U/ml為陽性結果。根據該標準對被測樣本進 行分析。發現所有被測樣本中的VCA濃度均小於8 U/ml，分布於1 7.778 之間，無陽性結果發現。
EA檢測結果如圖6，其判定值範圍小於8U/ml為陰性結果，8U/ml 12 U/ml為可疑結果，大於12 U/ml為陽性結果。根據該標準對被測樣本進 行分析。共有22個樣本為陽性，其中22個樣本大於12 U/ml，為陽性結果， 其中有一例為食管癌樣本， 一例為正常人樣本，其餘20例均為NPC樣本，佔 所有NPC樣本的40X。有7例樣本介於8 U/ml 12 U/ml間，其中有2例為 NPC樣本，佔所有NPC樣本的4%。剩餘36例樣本均小於8 U/ml 。
上述結果說明，在對我們現有的NPC患者血清樣本的檢測中，VCA和EA 兩種現有的抗原檢測方法在NPC疾病檢測能力上均顯著低於本發明。
本發明的診斷試劑盒為鼻咽癌以及其它EB病毒相關疾病的診斷提供新 的高靈敏度與特異性的檢測指標,為早期篩查和診斷鼻咽癌及其它EB病毒相 關疾病提供了一個新途徑。序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110〉四川大學華西醫院
〈120〉 一種鼻咽癌早期篩査、診斷試劑及應用
〈130〉 CD314-07P103187
3
〈170> Patentln version 3.2
1
<211〉 663
DNA
<213〉 Epstein-Barr BALF1
〈220〉
CDS
<222〉 (1)..(663)
1
atg Met 1犯c Asnctg Leugcc att Ala lie 5get ctg gac Ala Leu Asptct Sercct Pro 10C3C Hiscca ggc Pro Glyetc Leugcg Ala 15tct Ser48
tat Tyract Thr3tt liectg cca Leu Pro 20cgc cca ttt Arg Pro Phetat 丁yr 25cat Hisata lieSerctg Leu朋g Lys 30ccc Progtg Val96
age Sertgg Trpcct Pro 35g￡ic gag Asp 6luacc atg agg Thr Met Arg 40Progcc Alaaag 匕ystct SerThr 45Asptct Sergtg Val144
Ut Phegtg Val 50agg Argacc ccg Thr Progtc gag gcg Val Glu Ala 55tgg Trpgtc Valgcg Alaccc Pro 60teg Serccg Proccg Progac Asp192
gac Asp 65aag Lysgtg Valget g鄧 Ala Glutec age tac Ser Ser Tyr 70etc Leuatg MetUc Phe 75agg gcc Arg Alaatg MetTyrgcg Ala 80240
gtg ValUc Pheacc Thregg gat Arg Asp 85gag aaa gac Glu Lys Aspctg Leucct Pro 90ttg LeuProgcc Alactg Leugtc Val 95etc Leu288
tgc Cysegg Argetc Leuate aag lie Lys 100gcc tec ctg Ala Ser Leuagg Arg 105犯g Lysgat Aspagg aa_g Arg lysctg Leu 110tac Tyrgcg Ala336
gag Gluctg Leugcc Ala 115tgc agg Cys Argaca gcc gac Thr Ala Asp 120ate lieggg Glyggc GlyLysgac Asp 125acg Thrcac HisVal384
egg Argetc Leu 130ate lieate age lie Sergtc ctg cgc Val Leu Arg 135gC3 Alagtg Valtac Tyr犯c gac Asn Asp 140Histeic Tyrgac Asp432
tac Tyr 145tgg Trp"tcg Seregg etc Arg Leuagg gtg gtg Arg Val Val 150ctg Leutgc Cystac Tyr 155Thrgtg Valgtg Valttt Phegcg Ala 160480
gtg Valcga ArgAsntac ctg Tyr Leu 165gat gac cac Asp Asp Hisaagage Ser 170gcc Alagcc Alanc Phegtg Valctg Leu 175ggg Gly528
gca Alaliegcc AlaC3C t￡LC His Tyr 180ctg gcc etc Leu Ala Leutat Tyr 185cgc Arg， Argetc tgg Leu Trpm Phe 190gcg Alaagg Arg576
ctg Leuggc Glyggc Gly 195atg cca Met Proaga teg ctg Arg Ser Leu 200聊 Argcgt Argcag Ginttc Pheccc Pro 205gtg Valscg Thrtgg Trp624gcc ctg gcc age ctg act gac ttc ctg Ala Leu Ala Ser Leu Thr人sp Phe Leu 210 215
Lys
序列表.txt tct ttg taa Ser Leu 220
663
〈210〉 2 〈211〉 220 〈212〉 PRT
<213〉 Epstein-Barr BALF1 〈400〉 2
Met Asn Leu Ala lie Ala Leu Asp Ser Pro His Pro Gly Leu Ala Ser 15 10 15
Tyr Thr lie Leu Pro Arg Pro Phe Tyr His lie Ser Leu Lys Pro Val 20 2^ 30
Ser Trp Pro Asp Glu Thr Met Arg Pro Ala Lys Ser Thr Asp Ser Val 35 40 45
Phe Val Arg Thr Pro Val Glu Ala Trp Val Ala Pro Ser Pro Pro Asp 50 55 60
Asp Lys Val Ala Glu Ser Ser Tyr Leu Met Phe Arg Ala Met; Tyr Ala 65 70 75 80
Val Phe Thr Arg Asp Glu Lys Asp Leu Pro Leu Pro Ala Leu Val Leu 85 90 95
Cys Arg Leu lie Lys Ala Ser Leu Arg Lys Asp Arg Lys Leu Tyr Ala 100 105 110
Glu Leu Ala Cys Arg Thr Ala Asp lie Gly Gly Lys Asp Thr His Val 115 120 125
Arg Leu lie lie Ser Val Leu Arg Ala Val Tyr Asn Asp His Tyr Asp 130 135 140
Tyr Trp Ser Arg Leu Arg Val Val Leu Cys Tyr Thr Val Val Phe Ala 145 150 155 160
Val Arg Asn Tyr Leu Asp Asp His Lys Ser Ala Ala Phe Val Leu Gly 165 170 175
Ala lie Ala His Tyr Leu Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Trp Phe Ala Arg 180 185 190
Leu Gly Gly Met Pro Arg Ser Leu Arg Arg Gin Phe Pro Val Thr Trp 195 200 205
Ala Leu Ala Ser Leu Thr Asp Phe Leu Lys Ser Leu 210 215 220
〈210〉 3
〈211〉 663
〈212〉 DNA
<213〉 Epstein-Barr BALF1
〈400〉 3
atgaacctgg ccattgctct ggactxtcct cacccaggcc tcgcgtctta tactattctg
60序列表.txt
ccacgcccat tttatcatat aagcctgaag cccgtgagct ggcctgacga gaccatgagg 120
ccagccaagt ctacagattc tgtgtttgtg aggaccccgg "tcgaggcgtg ggtcgcgccc 180
tcgccgccgg acgacaaggt ggctgagtcc agctacctca tgttcagggc catgtacgcg 240
gtgttcaccc gggatgagaa agacctgcct ttgccagccc "tggtcctctg ccggctcatc 300
aaggcctccc tgaggaagga taggaagctg tacgcggagc tggcctgcag gacagccgac 360
atcgggggca aagacacgca cgtacggctc atcatcagcg tcctgcgcgc agtgtacaac 420
gaccactacg actactggtc gcggctcagg gtggtgctgt gctacacagt ggtgtttgcg 480
gtgcgaaact acctggatga ccacaagagc gccgccttcg tgctgggggc aatcgcccac 540
tacctggccc tctatcgcsg actctggttt gcgaggctgg gcggcatgcc aagatcgctg 600
agacgtcagt tccccgtgac gtgggccctg gccagcctga ctgacttcct gaaatctttg 660
taa 66權利要求
1. 一種試劑盒，它至少包含一種胺基酸序列如SEQ NO.2所示的蛋白或其與GST蛋白的融合蛋白。
2、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於含有胺基酸序列如SEQ NO. 2所示的蛋白或其與GST蛋白的融合蛋白。
3、 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於用於鼻咽癌及相關 疾病的早期診斷、篩查和檢測。
4、根據權利要求1 3任一一項所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒 採用ELISA技術。
5、 一種製備胺基酸序列如SEQNO. 2所示的蛋白或其與GST蛋白的融 合蛋白的方法，包括a、構建含有SEQ NOJ核苷酸序列的重組質粒；b、將重組質粒轉入宿 主細胞；c、收集得到含有SEQN0.2所示胺基酸序列的表達產物粗提物；d、 純化表達產物粗提物，得到胺基酸序列如SEQ NO. 2所示蛋白或其與GST 蛋白的融合蛋白；e、將d歩驟得到的純化蛋白進行二次純化。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特徵是，步驟a所述的質粒載體為 PGEX系列或PET系列的蛋白表達載體。
7、 根據權利要求5所述的方法，其特徵是，步驟b所述的宿主細胞為 E.coli.BL21、 DH5a或JM109。
8、 根據權利要求5所述的方法，其特徵是，步驟d所述的純化方法為 將收集的表達產物粗提物，用Glutahione Sepharose 4B或親和層析柱純化，Xa 因子儲存液，Xa因子剪切緩衝液洗脫離心，或者用穀胱甘肽洗脫液，離心， 得到純化的胺基酸序列如SEQ NO. 2所示蛋白。
9、 根據權利要求5所述的方法，其特徵是，步驟e所述的純化方法為透 析法、離子交換層析法以及HPLC-分子篩層析法。
10、 根據權利要求9所述的方法，其特徵是，所述的HPLC-分子篩層析 法，所使用的層析柱為S印harose-100。
全文摘要
本發明涉及一種鼻咽癌早期診斷試劑，它至少包含一種胺基酸序列如SEQ NO.2所示的蛋白或其與GST蛋白的融合蛋白。本發明還提供了一種製備胺基酸序列如SEQ NO.2所示的蛋白或其與GST蛋白的融合蛋白的方法。本發明的診斷試劑盒為鼻咽癌以及其它EB病毒相關疾病的診斷提供新的高靈敏度與特異性的檢測指標，為早期篩查和診斷鼻咽癌及其它EB病毒相關疾病提供了一個新途徑。
文檔編號G01N33/569GK101303353SQ200810097299
公開日2008年11月12日 申請日期2008年5月9日 優先權日2007年5月10日
發明者應斌武, 波 李, 王蘭蘭, 紅 範, 魏永剛 申請人:四川大學華西醫院