人臍帶間充質幹細胞及其製備方法
2023-09-11 12:59:00 2
專利名稱：人臍帶間充質幹細胞及其製備方法
技術領域：
本發明涉及原始間充質幹細胞的製備方法，尤其涉及以人臍帶沃頓膠為材料製備 人臍帶間充質幹細胞及其製備方法。
背景技術：
間充質幹細胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是一類具有多向分化潛能的組織 幹細胞，可從胎兒血液、肝臟、骨髓、脂肪等多種組織獲得。骨髓源性MSC存在高度病毒汙染 的可能，且隨著年齡增長其細胞數量和擴增、分化能力出現明顯下降趨勢。其他方法如從 臍血和外周血中培養MSC具有一定難度，且MSC在足月分娩的臍血或動員的外周血中數量 尚存在爭議。進來有學者從娩後的廢棄材料臍帶中分離培養MSC，並進行形態學、分化功能 和表面標誌物等生物學表型鑑定。臍帶是連於胚胎臍部與胎盤問的索狀結構，外被羊膜、 內含分化的粘液性結締組織，結締組織內除閉鎖的卵黃囊和尿囊外，還有臍動脈和臍靜脈。 臍帶中的MSC來源分為四種①來源於沃頓膠(Wharton』 s jelly, WJ)，它是包裹血管周 圍的粘蛋白樣組織，距血管外周大約3mm，富含透明質酸和葡萄糖胺聚糖，形成了成纖維細 胞周圍的水凝膠結構；②來源於臍血管周圍；③來源於臍血；④來源於臍靜脈血管內皮下。 McElreavey等從人臍帶的WJ組織中發現一種具有高分化潛能的成纖維樣細胞。Sarugaser 等發現WJ區域富含祖細胞，這個區域的細胞被稱為人臍帶血管外周細胞(human umbilical cord perivascular cell，HUCPV)。HUCPV細胞具有較高的成纖維樣細胞集落形成能力， 且骨誘導後可增殖分化形成骨結節。Romanov等採用培養骨髓MSCs的方法進行培養，從人 臍靜脈內皮和內皮下層分離到類似骨MSCs的細胞。上述研究顯示，臍帶組織含有豐富的 MSCs，能夠成為MSCs的良好來源。目前分離和培養人臍帶MSC的方法不盡相同，分離效果也大相逕庭。分離方法大 體上包括膠原酶消化法、植塊法或兩者的結合、臍靜脈內膜消化法，其中膠原酶消化法多以 膠原酶II為主。人臍帶MSC在適當的誘導條件下能向多種組織細胞分化，是理想的組織工程種子 細胞。MSC誘導植入有望成為較廣泛的細胞治療於段。研究表明MSC能夠植入肌肉退化組 織並向肌細胞分化，也能夠促進造血幹細胞的植入；MSC還可應用於軟骨組織重建等生物 工程；也可能成為未來抗癌治療中攜帶自殺基因或抗癌腺病毒藥物的載體細胞。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種材料來源易得，細胞倍增時間短的人臍帶 間充質幹細胞及其製備方法，按本發明方法製備的間充質幹細胞具有更強的自我更新及多 向分化潛能，而且易於冷凍保存。實現本發明目的的技術方案，採用胎兒臍帶為原材料製備間充質幹細胞。製備方 法為臍帶從保存液取出後，剪斷雙側結紮部分，去除臍帶血管內淤血，將臍帶浸入含抗生 素的Hanks，Balanced Salt Solution(HBSS) (IX)中，用D-PBS反覆衝洗臍帶和臍靜脈內腔3次，剔除血管，暴露沃頓膠，然後將臍帶剪成l_3mm3大小的組織塊後放入試劑瓶，加入 0. 的消化液，置於37°C恆溫震蕩儀內持續消化4-10h，100目篩網過濾，離心收集細胞。 加入HBSS液衝洗細胞3次，用DMEM/F12培養基溶液重懸細胞，調整細胞密度4. 8 X IO3 1 X 104/cm2，接種於6孔板內，37°C、體積分數為5% CO2孵箱內培養，24h後換液，以後每隔3 天換液一次，待細胞達到80%融合時，傳代培養，即時使用或冷凍保存備用。作為優化，製備的間充質幹細胞為臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍、臍血和臍靜脈血管 內皮下的任何一種來源或全部。用於清洗臍帶及其血管殘留血液的溶液是不含鈣鎂離子的D-PBS溶液；衝洗沃頓 膠組織塊所用液體優選無血清DMEM/F12培養基溶液。作為優化，臍帶是經過D PBS清洗血管後剪成l_3mm3的組織塊，進入下一分離程序。用於原始間充質幹細胞的製備方法，可用II型膠原酶消化法、IV型膠原酶消化 法、II型膠原酶和胰酶聯合消化法或II型膠原酶和透明質酸酶混合液消化臍帶組織，作為 優化，首選II型膠原酶和透明質酸酶混合液進行消化。作為優化，用於消化臍帶組織塊的消化液為II型膠原酶和透明質酸酶的混合溶 液，其質量體積百分比濃度為0. 1%。作為優化，接種細胞使用的培養液為含有體積分數為10-20%的FBS和25mmol/L 穀氨醯胺的DMEM/F12。對於按照本發明上述方法製備的間充質幹細胞，按照「國際細胞療法協會」(ISCT) 制定的標準進行生物學表型鑑定，表現出以下技術特徵1)在最佳培養體系條件下細胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態相對均一，呈平 行排列生長或旋渦狀生長的梭形細胞；2)表達粘附分子受體標記物⑶29、⑶44，間質細胞標記⑶73、⑶105，幹細胞標記 物⑶90 ；而不表達內皮細胞標記物⑶31和造血幹細胞標誌⑶34，也不表達HLA-DR ；3)體外可誘導分化為成骨細胞及心肌樣細胞。上述鑑定結果表明被發明製備的間充質幹細胞非造血幹細胞，並且具有上述技術 特徵，符合間充質幹細胞產品合格標準。按本發明方法製備的間充質幹細胞在5-6天的培養周期中，細胞量可增殖20倍， 可得到大量富有活性的間充質幹細胞，並能夠長時間保存而不失其活性，且操作簡單易行， 並且經過流式細胞儀檢測、細胞周期檢測以及體外分化實驗鑑定，獲得的間充質幹細胞純 度和細胞活性較高，具有良好增殖潛力，可快速建立細胞庫，成本低廉，可直接用於科學實 驗研究和臨床上的輔助治療，富有應用前景。
圖1是原代細胞貼壁後至80%融合的細胞形態圖，其中，A為第1天細胞形態；B 為第3天細胞形態；C為第7天細胞形態。圖2是第4代間充質幹細胞流式細胞儀檢測的免疫表型細胞含量圖。圖3A 是第4代間充質幹細胞體外誘導分化為成骨細胞和心肌樣細胞形態 圖一骨涎蛋白免疫組化染色。
圖3B是是第4代間充質幹細胞體外誘導分化為成骨細胞和心肌樣細胞形態 圖一RT-PCR檢測心肌特異性基因的表達電泳圖，泳道1，2-α-橫紋肌肌動蛋白；泳道3， 4-心肌肌漿網鈣ATP酶；5，6-人心肌轉錄因子GATA4 ；泳道7，8- α -肌球蛋白重鏈；泳道9， 10人心肌轉錄因子ΝΚΧ2. 5 ；泳道11，12-肌鈣蛋白I ；泳道13，14-內參GADPH0
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明並不受限於下述 實施例。實施例1 人臍帶胎盤間充質幹細胞的製備經產婦知情同意，採集足月劑宮產健康胎兒臍帶或胎盤。臍帶或胎盤採集之前產 婦需做愛滋病病毒抗體、B型肝炎病毒抗體、C型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、谷丙轉 氨酶、支原體等檢測，全部合格以確保安全性後方可採集。1、臍帶或胎盤自手術臺取下後，浸入含抗生素的0.9%生理鹽水中，4°C保存；2、在操淨臺內取出臍帶或胎盤，用D-PBS衝洗淨表面殘餘血液；3、將臍帶或胎盤剪成l_3mm3大小的組織塊後放入200mL藍蓋試劑瓶，加入質量體 積百分比濃度0. 的消化液，置於37°C恆溫振蕩儀內持續消化4 IOh ；4、100目篩網過濾收集細胞；5、加入D-Hank』 s液衝洗細胞3次，用含體積分數為10_20 %胎牛血清和穀氨醯 胺的DMEM/F12重懸細胞，調整細胞密度為(4. 8 X IO3 1 X IO4) /cm2,接種於6孔板內，於 37°C、體積分數為5%的CO2孵箱內培養，24-72h後換液，圖1。實施例2 人臍帶胎盤間充質幹細胞的細胞特徵1、免疫表型檢測 CD29，CD44,，CD73, CD90, CD105, CD31, CD34, HLA-DR(見表 1)。 將第4-7代人臍帶胎盤來源的間充質幹細胞接種於滾瓶中，待細胞達到80-90%融合時 使用IOml胰酶消化，將細胞懸液轉入50ml離心管中並以IOOOrpm離心3分鐘。離心之 後，棄掉上清，PBS洗滌2次，分成每管1 X IO6細胞，第一管為空白對照(只含間充質幹細 胞)，用於調節流式細胞儀的電壓，第二管加入同型對照抗體(PE-MOUSE IgGl/FITC-MOUSE IgGl/APC-Mouse IgGl κ ) 10 μ 1，其餘管中加入其它相應抗體10 μ 1，混勻，4°C避光孵育30 分鐘，PBS洗滌1次，離心後棄上清，加入500 μ 1 PBS重懸，混勻，即可上機(流式細胞儀 FACSAria, BD公司)檢測。細胞免疫表型為⑶29，⑶44，⑶73，⑶90，⑶105為陽性標記， ⑶31，⑶34，HLA-DR為陰性標記(見表1、2)。表1本發明優選檢測人臍帶胎盤間充質幹細胞的表面標誌物
權利要求
1.一種人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，它是採用以下工藝方法製備 從保存液取出臍帶後，剪斷雙側結紮部分，去除臍帶血管內淤血，將臍帶浸入含抗生素的 Hanks' Balanced Salt Solution中，用D-PBS反覆衝洗臍帶和臍靜脈內腔3次，剔除血 管，暴露沃頓膠，然後將臍帶剪成l_3mm3大小的組織塊後放入試劑瓶，加入質量體積百分 比濃度為0. 的消化液，置於37°C恆溫震蕩儀內持續消化4 10h，100目篩網過濾，離 心收集細胞；加入HBSS液衝洗細胞3次，用DMEM/F12培養基溶液重懸細胞，調整細胞密度 4. 8 X IO3 IX 104/cm2，接種於6孔板內，37 °C、體積分數為5% CO2孵箱內培養，24h後換 液，以後每隔3天換液一次，待細胞達到80%融合時，傳代培養，即時使用或冷凍保存備用。
2.根據權利要求1所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，製備的間充 質幹細胞為臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍、臍血和臍靜脈血管內皮下的任何一種來源或全部。
3.根據權利要求1所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，所述臍帶採 用足月劑宮產健康胎兒臍帶，並且採集之前產婦已做愛滋病病毒抗體、B型肝炎病毒抗體、 C型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、谷丙轉氨酶、支原體檢測，並全部。
4.根據權利要求4所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，採集後的臍 帶置於4°C保存，6h之內處理。
5.根據權利要求1所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，所述D-PBS溶 液不含鈣離子和鎂離子。
6.根據權利要求1所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，所述消化液 中加入II型膠原酶、IV型膠原酶、II型膠原酶和胰酶混合液、或II型膠原酶和透明質酸酶 混合液中的一種。
7.根據權利要求1所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，消化臍帶組 織塊的時間為他。
8.根據權利要求1所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，所述培養基 溶液為無血清DMEM/F12培養基溶液。
9.根據權利要求8所述的人臍帶間充質幹細胞的製備方法，其特徵在於，所述培養基 溶液為含有體積分數為10-20%的FBS和25mmol/L穀氨醯胺的DMEM/F12。
10.如權利要求1 9任一項所述方法製備的間充質幹細胞，其特徵在於，在免疫學表 型鑑定中，具有以下技術特徵①在標準培養條件下貼壁生長於塑料制培養器皿成纖維樣生長；②表達粘附分子受體標記物Q^9/CD44，間質細胞標記CD73(SH3)/CD105(Sffi)，及幹 細胞標記物⑶90，而低表達或不表達內皮細胞標記物⑶31、造血幹細胞標誌⑶34和組織相 容性II類抗原HLA-DR ；③體外誘導分化為成骨細胞和心肌樣細胞。
全文摘要
本發明公開了一種人臍帶間充質幹細胞及其製備方法，它是採用足月劑宮產健康胎兒臍帶經過無菌處理，機械剪切，暴露沃頓膠，經過膠原酶消化後分離培養而成，經冷凍復甦後細胞活力無明顯下降，是細胞治療的理想種子細胞。本發明還涉及經上述方法製備的原始間充質幹細胞，按照國際細胞治療協會(ISCT)制定的間充質幹細胞的標準進行形態學、免疫表型以及體外分化實驗鑑定確認為間充質幹細胞。其細胞數量、細胞活力、純度及其倍增時間、增殖能力均明顯高於骨髓來源的間充質幹細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102127522SQ20101060554
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者劉劍, 洪敬欣, 韓俊領 申請人:協和幹細胞基因工程有限公司