可用於生產人重組白細胞介素－15的原核表達工程菌及純化方法
2023-09-11 13:07:30
專利名稱：可用於生產人重組白細胞介素－15的原核表達工程菌及純化方法
技術領域：
本發明涉及兩種用於人重組白細胞介素-15(recombinant humaninterleukin-15，rhIL-15)的原核表達工程菌及其重組蛋白純化技術。更具體地，本發明的工程菌中含有一種全新的重組表達載體，其中有一全新合成的DNA片斷。本發明還涉及所述重組蛋白質的誘導表達和純化技術。
背景技術：
白細胞介素(IL)-15是Grabstein等人於1994年發現的一種約為12-14kD的細胞因子，隨著對其研究的不斷深入，人們對IL-15的結構、功能等有了更新的認識。與大多數細胞因子相似，IL-15可在機體正常的免疫應答中發揮作用，如促進T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞的發育等。IL-15還可對免疫系統外的多種組織和細胞發揮廣泛而多效的作用。由於IL-15作用的多樣性，可在天然免疫和獲得性免疫反應中產生交叉的調節作用，因而可將其看作天然免疫和獲得性免疫系統間的橋梁。
在IL-15的功能研究中，其抗腫瘤效應受到重視。已有實驗證實，低劑量的外源性IL-15能在不產生明顯毒性作用的前提下，誘導NK細胞、NK-T細胞及CD8+記憶T細胞的發育、增殖及活化。比較IL-15與IL-2對肺腺癌轉移模型的療效時，發現雖然IL-15體內誘導的特異性殺傷效應只有IL-2的1/3，但是它誘導的NK殺傷活性比IL-2誘導的高3-4倍。此外，6倍劑量的IL-15才能引起肺血管滲漏等毒副作用的出現。在大鼠的結腸癌模型中也發現，IL-15能顯著降低化療引起的胃腸道毒性，增強藥物的最大耐受劑量，因而推測IL-15可能是治療實體瘤，尤其是抑制對IL-2有抗性的廣譜實體瘤生長的有效候選因子。
發明內容
為了克服現有技術的不足之處，本發明的目的在於提供經本發明得到的新的工程菌。具體而言，本發明所述的工程菌為兩株大腸桿菌。所述的大腸桿菌已於2003年11月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號(CGMCC)為1049或者保藏號(CGMCC)為1050。
本發明還提供純化重組人白細胞介素-15的方法。
為了完成本發明的目的，本發明的技術方案如下本發明涉及一種編碼人白細胞介素-15的DNA序列，其序列號為2或者序列號為4。
本發明還涉及一種含有所述序列號為2或者序列號為4的DNA序列的重組載體，優選的是，該載體為質粒。
本發明還涉及含有序列號為2或者序列號為4的DNA序列載體的大腸桿菌。
另外，本發明涉及一種反相層析分離純化重組人白細胞介素-15的方法，包括如下步驟(A)在反相柱中，使用緩衝液A平衡層析柱至少2個柱體積，其中所述的緩衝液A是含有0.005％～0.01％三氟乙酸∶0.5～2％乙腈的水溶液；(B)重組人白細胞介素-15粗品進樣；(C)用緩衝液A和緩衝液B以線性流速2.5cm/min梯度洗脫，按目的蛋白吸收峰收集得一目的蛋白收集物，其中緩衝液B是含有三氟乙酸0.005％～0.01％∶乙腈85～95％的水溶液；(D)將目的蛋白收集物凍幹得一凍乾物；(E)凍乾物於4-10℃溶於生理鹽水，離心分離，得純化重組人白細胞介素-15溶液。
本發明還涉及另一種層析分離、復性重組人白細胞介素-15的方法，包括如下步驟(I)用緩衝液A平衡凝膠過濾層析柱至少2個柱體積；其中所述的緩衝液A含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，50～100mMβ-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.64～6mM，0～1M尿素，pH8.0；(J)用緩衝液B逐漸增加尿素濃度，在層析柱上端0.6個柱體內形成8M至0～1M尿素的向下遞減梯度，線性流速為0.5-1cm/min，此時，層析柱下端0.4倍柱床為0～1M的尿素緩衝液，上端0.6倍柱床為8M-0～1M的尿素緩衝液，其中所述的緩衝液B含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，30～80mMβ-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.64～6mM，8M尿素，pH8.0；(K)重組人白細胞介素-15粗品上樣，體積不超過柱床的5％，濃度不超過10mg/ml；(L)緩衝液B液洗脫0.5個柱體積，然後換成緩衝液A液洗脫，線性流速均為0.05～0.1cm/min，收集目的蛋白；(M)在DEAE陰離子交換柱中，用緩衝液C平衡層析柱至少2個柱體積；其中所述的緩衝液C含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mMβ-巰基乙醇，pH6～8.0；(N)上樣步驟D得到的目的蛋白後，用緩衝液C洗滌層析柱至少2個柱體積；(O)緩衝液D梯度洗脫，按吸收峰收集得重組人白細胞介素-15收集物，其中所述的緩衝液D含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mMβ-巰基乙醇，1～2M NaCl，pH6.0～8.0，；(P)將步驟G的收集物經脫鹽柱脫鹽，得純化的重組人白細胞介素-15。
由此可見，根據本發明的一個方面，本發明提供了兩種新的工程菌，該工程菌含有編碼人白細胞介素-15的DNA序列(序列15)或其衍生物(序列28)，也含有與該重組DNA分子有效連接的並能夠在大腸桿菌中穩定高效表達的重組載體。
本發明的另一個方面也提供了兩種誘導該工程菌表達人白細胞介素-15的工藝方法，以及兩種純化人白細胞介素-15的工藝方法。
附序列說明序列1-14表示PCR法拼接全長人白細胞介素-15成熟基因DNA序列I時用到的4對引物，同時還列出了3對在拼接中可能用到的短小引物。引物L1s、L2s、L3s、L4s的3』端分別與引物L1a、L2a、L3a、L4a的3』端互補配對，引物L2s、L3s、L4s的5』端分別與引物L1a、L2a、L3a的5』端互補配對。小引物用於第二輪和第三輪PCR擴增，起輔助引物作用。在第一輪PCR反應中，L1s與L1a配對、L2s與L2a配對、L3s與L3a配對、L4s與L4a配對。第二輪PCR反應中，第一輪的PCR產物L1與L2配對、L3與L4配對。第三輪PCR反應中，第二輪的PCR產物L1-2與L3-4配對，即合成全長的人白細胞介素-15的成熟基因序列。
序列15表示序列1-14的引物通過PCR法拼接得到的全合成的人白細胞介素-15DNA序列I。
序列16-27表示序列1-14的引物的衍生物(部分鹼基不同於圖2)，此引物通過搭橋PCR可以得到序列28所示的人白細胞介素-15成熟基因DNA序列II。
序列28表示序列16-27的引物通過PCR法拼接得到的全合成的人白細胞介素-15DNA序列II。
序列29表示由全合成的人白細胞介素-15DNA序列I或DNA序列II得到的人白細胞介素-15的胺基酸順序。
序列30表示重組表達載體pBV220-hIL-15插入目的基因部分的DNA序列測定結果，表明全合成人白細胞介素-15成熟基因序列正確、插入載體位置正確。方框內即為全合成的人白細胞介素-15DNA序列I，其兩端為酶切位點和載體pBV220序列。
圖1表示PCR法全合成人白細胞介素-15成熟基因的原理。這4對引物可兩兩部分互補配對，彼此以對方為模板，在Taq酶作用下合成DNA片斷。同樣，合成的DNA片斷間也可以彼此部分互補配對合成更長一點的DNA片斷。因此，通過逐步搭橋拼接可以合成出短片斷、次全長和全長人白細胞介素-15成熟基因DNA。根據hIL-15胺基酸序列和大腸桿菌對密碼子的偏好，設計合成4對寡核苷酸片斷，相鄰兩個片斷之間重疊約18bp。
圖2表示原核表達人白細胞介素-15的表達載體pBV220-hIL-15的構建過程。
圖3表示原核表達人白細胞介素-15的表達載體pET42-hIL-15的構建過程。
圖4表示PCR法拼接全長人白細胞介素-15成熟基因的新DNA序列1-14或新DNA序列15的不同階段得到的DNA片斷2％瓊脂糖電泳結果，1和2是第一輪PCR拼接結果，3和4是第二輪PCR拼接結果，5和6是第三輪PCR拼接結果，M為大連寶生物公司的DNA分子量標準(DL2000)。
圖5表示構建好的重組表達載體pBV220-hIL-15雙酶切鑑定陽性，表示人白細胞介素-15成熟基因插入正確。1為pBV220-hIL-15載體，3和4是沒有插入目的基因的pBV220空載體，M為大連寶生物公司的DNA分子量標準(DL2000)。
圖6表示重組表達載體pBV220-hIL-15插入目的基因部分的測序圖譜。
圖7表示工程菌BL21StarTM(DE3)PlysS/pBV220-hIL-15誘導表達前後菌體蛋白質SDS-PAGE凝膠電泳結果。M為低分子量蛋白質標準，1和3為工程菌誘導後的菌體總蛋白，2為工程菌誘導前的菌體總蛋白。箭頭所指為表達的目的蛋白。
圖8表示目的蛋白佔菌體總蛋白的百分含量。16為目的蛋白吸收峰，箭頭所指數值為目的蛋白表達量，即15.2％。
圖9表示用人白細胞介素-15單克隆抗體的Western Blot法檢測目的蛋白質在菌體中的存在形式。1和3為包涵體沉澱，2為上清。箭頭所指為表達的目的蛋白。
圖10表示初步純化的重組蛋白質的胺基酸序列測定，初步純化的蛋白質N末端6個胺基酸依次為M-N-W-V-N-V，結果表明為人白細胞介素-15。
圖11表示包涵體經不同洗滌過程後雜質去除情況，1，2為包涵體經洗滌液A洗滌後上清；3為2％ TritonX-100洗滌後上清；4，5為2M尿素洗滌後上清；6，7為洗滌後包涵體沉澱；M為低分子量蛋白質標準；8為誘導後的菌體蛋白；9為誘導前的菌體蛋白。
圖12表示重組人白細胞介素-15粗品反相層析分離的洗脫梯度和吸收曲線，箭頭所指的吸收峰即是重組人白細胞介素-15的吸收峰。
圖13表示重組人白細胞介素-15粗品反相層析分離各收集峰的SDS-PAGE凝膠電泳結果，5、6、7分別是目的蛋白質吸收峰的前、中、後部分，1、2、3和4是目的蛋白質吸收峰以外的其他吸收峰，M是低分子量蛋白質標準，8和9為重組人白細胞介素-15粗品。箭頭所指即為重組人白細胞介素-15。
圖14表示重組人白細胞介素-15粗品反相層析分離後收集的目的蛋白質凍幹後溶解得到的純化蛋白質的SDS-PAGE凝膠電泳結果。1為凍乾物溶於水後上清，2為凍乾物溶於生理鹽水後的上清，4為凍乾物溶於水後沉澱，5為凍乾物，9和11為重組人白細胞介素-15粗品，10為低分子量蛋白質標準。
圖15表示用光密度法測定純化的重組人白細胞介素-15的純度，1為雜質吸收峰，2為重組人白細胞介素-15吸收峰，其他為噪音。其中吸收峰#峰面積峰高百分數％1 36.38 4.82 7.92 421.927 78.98892.1圖16表示重組人白細胞介素-15粗品經Amersham Sephacryl S100凝膠過慮層析分離、復性後收集的各部分的SDS-PAGE結果。M為低分子量蛋白質標準，1至10分別是目的蛋白質吸收峰的前、中、後各部分。箭頭所指位置是重組人白細胞介素-15。
圖17表示經Amersham Sephacryl S100凝膠過慮層析分離、復性後收集的目的蛋白質用HiTrap DEAE FF陰離子交換層析純化的人白細胞介素-15的SDS-PAGE凝膠電泳結果。1為粗品，3和5是HiTrapDEAE FF陰離子交換層析純化蛋白，M為低分子量蛋白質標準。
具體實施方案本發明的工程菌、誘導表達方法和純化工藝可以用於生產重組人白細胞介素-15。
本發明中，所使用的術語定義如下術語「原核表達」是指轉染了重組表達載體pBV220-hIL-15質粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS在高溫誘導下或者轉染了重組表達載體pET42-hIL-15質粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS在1.0mmol/l的IPTG誘導下，表達人白細胞介素-15的過程。
術語「工程菌」指轉染了重組表達載體pBV220-hIL-15質粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS和轉染了重組表達載體pET42-hIL-15質粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS。
術語「重組人白細胞介素-15(rhIL-15)」指通過基因工程，產自於大腸桿菌的人白細胞介素-15，它可能比人體中產生的白細胞介素-15多一個胺基酸(即N端第一個胺基酸——蛋氨酸)，除此之外，胺基酸順序同人體內的白細胞介素-15。
術語「全長人白細胞介素-15成熟基因的新DNA序列I/II」和「全合成人白細胞介素-15DNA序列I/II」均指編碼人白細胞介素-15成熟肽的全長DNA序列的衍生物，其表達的多肽，除N端第一個胺基酸為蛋氨酸外，胺基酸序列同人白細胞介素-15。
術語「表達和純化工藝」指誘導工程菌表達並純化重組人白細胞介素-15的方法、流程。
通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進一步說明，並不意味著限定本發明的範圍。
實施例1全長人白細胞介素-15成熟基因的全合成根據圖1所示PCR法全合成人白細胞介素-15成熟基因的原理。4對引物兩兩部分互補配對，彼此以對方為模板，在Taq酶作用下合成DNA片斷。同樣，合成的DNA片斷間也可以彼此部分互補配對合成更長一點的DNA片斷。因此，通過逐步搭橋拼接可以合成出短片斷、次全長和全長人白細胞介素-15成熟基因DNA序列。引物L1s、L2s、L3s、L4s的3』端分別與引物L1a、L2a、L3a、L4a的3』端互補配對，引物L2s、L3s、L4s的5』端分別與引物L1a、L2a、L3a的5』端互補配對。小引物用於第二輪和第三輪PCR擴增，起輔助引物作用。在第一輪PCR反應中，L1s與L1a配對、L2s與L2a配對、L3s與L3a配對、L4s與L4a配對。第二輪PCR反應中，第一輪的PCR產物L1與L2配對、L3與L4配對。第三輪PCR反應中，第二輪的PCR產物L1-2與L3-4配對，即合成全長的人白細胞介素-15的成熟基因序列。
實施例2重組表達載體的構建重組表達載體的構建技術路線如圖7和圖8所示。首先通過聚合酶鏈反應(PCR)搭橋拼接出全長的人白細胞介素-15成熟基因，並在其3』和5』端加上酶切位點，引物如圖2和圖4所示。使用pBV220構建重組表達載體的，在rhIL-15的3』和5』端分別加上PstI和EcoRI的酶切位點，即CTGCAG和GAATTC。使用pET42a構建重組表達載體的，在rhIL-15的3』和5』端分別加上XhoI和NdeI的酶切位點，即CTCGAG和CATATG。將此帶有酶切位點的全長人白細胞介素-15成熟基因裝入pGEM-T質粒後測序，將帶有全長人白細胞介素-15成熟基因的pGEM-T質粒以PstI和EcoRI雙酶切，或者以XhoI和NdeI雙酶切。回收含全長人白細胞介素-15成熟基因的DNA片段，同時，將pBV220質粒以PstI和EcoRI雙酶切，或者pET42a質粒以XhoI和NdeI雙酶切，回收大片段。將酶切後的pBV220載體片段或pET42a載體片段與含全長人白細胞介素-15成熟基因的DNA片段連接成pBV220-hIL-15質粒和pET42-hIL-15質粒。然後，進行連接產物的轉化、小量提取純化質粒DNA。
實施例3工程菌BL21StarTM(DE3)plysS/pBV220-hIL-15和BL21StarTM(DE3)plysS/pET42-hIL-15的獲得、篩選及其鑑定步驟1.篩選穩定高效表達的工程菌(1)將上述實施例2獲得的pBV220-hIL-15質粒和pET42-hIL-15質粒轉化入宿主菌BL21StarTM(DE3)plysS，即本發明的工程菌；(2)在固體LB瓊脂培養基平板中挑取單克隆菌落BL21StarTM(DE3)plysS/pBV220-hIL-15於4ml LB液體培養基中28℃，250轉/分，搖菌過夜；(3)以1∶100的比例接種於4mlLB培養基，28℃，250轉/分，搖菌至OD600值為0.4-0.6時，迅速升溫至42℃誘導表達，繼續搖菌4-5小時，回收菌體。
(4)至於工程菌BL21StarTM(DE3)plysS/pET42-hIL-15也一樣，只是培養條件換成常規的37℃，誘導條件改為OD600值為0.4-0.6時往培養基中加入終濃度為1mmol/l的IPTG。
(5)離心收集菌體，用緩衝液A(Buffer A50mM Tris，5Mm EDTA，150Mm NaCl，pH8.0)洗滌一次，然後重懸於1×上樣緩衝液，95℃煮5分鐘，即可上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯蘭染色，對照誘導前、後菌體蛋白質的變化，篩選出目的蛋白表達量最高的菌株保存作種子菌。
步驟2.目的蛋白的Western-Blot鑑定誘導前後的菌體蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至硝酸纖維素膜，用抗人白細胞介素-15的單克隆抗體Western Blot法鑑定目的蛋白就是重組人白細胞介素-15。
實施例4目的蛋白的大量製備和初步純化(1)保存的種子菌BL21StarTM(DE3)plysS/pBV220-hIL-15按1∶1000的比例接種於100ml LB培養基，28℃，250轉/分，搖菌8小時；(2)菌液再按1∶100的比例接種於大瓶LB培養基，28℃，200轉/分，搖菌至OD600值為0.4-0.6(需2.5-3小時)，迅速升溫至42℃誘導表達，繼續搖菌4-5小時，回收菌體。
(3)工程菌BL21StarTM(DE3)plysS/pET42-hIL-15誘導方法一樣，只是培養條件換成常規的37℃，誘導條件改為OD600值為0.4-0.6時往培養基中加入終濃度為1mmol/l的IPTG。
(4)離心收集菌體；Buffer A(50mM Tris，5mM EDTA，150mM NaCl，pH8.0)洗滌2遍；冰浴下超聲破碎菌體(360瓦，工作10秒，停30秒，80個循環)；離心分離沉澱；沉澱依次經含2％TritonX-100的Buffer B和含2M尿素的Buffer C洗滌。洗滌後，沉澱溶於6M鹽酸胍，即得重組人白細胞介素-15粗品。
實施例5反相層析分離純化重組人白細胞介素-15反相柱RPC Resource15純化重組人白細胞介素-15。
(1)Buffer A(三氟乙酸∶乙腈∶水＝0.065％∶2％∶97.35％)平衡層析柱5個柱體積(column volume，CV)；(2)重組人白細胞介素-15粗品進樣；(3)用Buffer A和Buffer B(三氟乙酸∶乙腈∶水＝0.1％∶90％∶9.9％)以線性流速2.5cm/min分段梯度洗脫，洗脫梯度為0％B 2CV40％ B 5CV 40-50％B 8CV 50-65％B 1CV 65％B5CV 100％B 5CV，按目的蛋白吸收峰收集。
(4)收集物凍幹；(5)凍乾物於4-10℃溶於生理鹽水，12000轉/分離心10分鐘即得純化重組人白細胞介素-15溶液。
溶解的目的蛋白經細胞活性實驗證明為具有生物活性的重組人白細胞介素-15。
實施例6反相層析分離純化重組人白細胞介素-15反相柱RPC Resource15純化重組人白細胞介素-15。
(A)用Buffer A(0.005％三氟乙酸∶0.5％乙腈)的水溶液平衡層析柱5個柱體積(column volume，CV)；(B)重組人白細胞介素-15粗品進樣；(C)用Buffer A和Buffer B(0.005％三氟乙酸∶85％乙腈的水溶液)以線性流速2.5cm/min分段梯度洗脫，洗脫梯度為0％B 2CV40％ B 5CV 40-50％B 8CV 50-65％B 1CV 65％B5CV 100％B 5CV，按目的蛋白吸收峰收集；(D)收集物凍幹；(E)凍乾物於4-10℃溶於生理鹽水，12000轉/分離心10分鐘即得純化重組人白細胞介素-15溶液。
溶解的目的蛋白經細胞活性實驗證明為具有生物活性的重組人白細胞介素-15。
實施例7重複實施例6的方法步驟，不同的是緩衝液A為含有0.01％三氟乙酸∶2％乙腈的水溶液，而緩衝液B為是含有0.01％三氟乙酸∶95％乙腈的水溶液。
實施例8用Amersham Sephacryl S100(16×100)分子篩凝膠過慮層析分離、復性重組人白細胞介素-15(1)復性緩衝液A(Buffer A50mM Tris，1 mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，50mM Glycine，GSSG-GSH 0.55mM，0.4M尿素，pH8.0)平衡凝膠過濾層析柱2個柱體積；(2)用B液(50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，50mMGlycine，GSSG-GSH 0.55mM，8M尿素，pH8.0)逐漸增加尿素的濃度，在層析柱上端0.6個柱體內形成8M至0.4M尿素的向下遞減梯度，線性流速為0.5-1cm/min，此時，層析柱下端0.4倍柱床為0.4M的尿素緩衝液，上端0.6倍柱床為8M-0.4M的尿素緩衝液；(3)上樣(體積不超過柱床的5％，濃度不超過10mg/ml)；(4)B液洗脫0.5個柱體積，然後換成A液洗脫，得一目的蛋白收集物。
由於尿素梯度較重組蛋白向下移動的慢，所以隨著洗脫進行，重組蛋白逐漸流經尿素梯度遞減的洗脫液而逐漸復性，此過程中線性流速為0.05～0.1cm/min，不宜過快，否則蛋白易析出。按吸收峰收集重組人白細胞介素-15，進行離子交換層析分離。
實施例9用DEAE陰離子交換柱層析分離分子篩分離得到的重組蛋白
(2)用緩衝液C液(Buffer A50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，pH8.0)平衡層析柱2個柱體積；(3)採用實施例8得到的目的蛋白收集物上樣後用A液洗滌層析柱2個柱體積；(4)緩衝液D液(50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，1MNaCl，pH8.0)梯度洗脫，按吸收峰收集重組人白細胞介素-15；(5)收集物經脫鹽柱脫鹽即得純化的重組人白細胞介素-15。
實施例10重複實施例8的步驟，不同的是採用的緩衝液A為含有20mMTris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，30mM Glycine，GSSG-GSH 0.44mM，pH8.0。而緩衝液B為其中所述的緩衝液B含有20mM Tris，1mM EDTA，30mMβ-巰基乙醇，30mM Glycine，GSSG-GSH 0.44mM，8M尿素，pH8.0。
實施例11重複實施例8的步驟，不同的是採用的緩衝液A含有100mM Tris，5mM EDTA，100mMβ-巰基乙醇，80mM Glycine，GSSG-GSH 0.66mM，1M尿素，pH8.0；而緩衝液B含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巰基乙醇，80mM Glycine，GSSG-GSH 0.66mM，8M尿素，pH8.0。
實施例12重複實施例9的步驟，不同的是採用的緩衝液C含有20mM Tris，1mM EDTA，20mMβ-巰基乙醇，pH6.0；而緩衝液D含有20mM Tris，1mM EDTA，20mMβ-巰基乙醇，1M NaCl，pH6.0。
實施例13重複實施例9的步驟，不同的是採用的緩衝液C含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巰基乙醇，pH8.0；緩衝液D含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巰基乙醇，2M NaCl，pH8.0。
序列表110中國醫學科學院基礎醫學研究所120可用於生產人重組白細胞介素-15的原核表達工程菌及純化方法130
16030170PatentIn version 3.1210121166212DNA213EcoRI4001gaattcatga actgggttaa cgtaatctct gacttgaaaa aaatcgaaga cctgatccag 60tctatg66210221159212DNA213EcoRI4002cgggtgaacg tcgctttcgg tgtacagagt agcgtcgatg tgcatagact gatcaggtc 59210321160212DNA213EcoRI4003gaaagcgacg ttcacccgtc ttgcaaagta accgctatga agtgcttcct cctggagctc 60210421159212DNA
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權利要求
1.一種編碼人白細胞介素-15的，其序列號為2或者序列號為4的DNA序列。
2.一種含有如權利要求1所述DNA序列的重組載體。
3.根據權利要求2所述的載體，其特徵在於載體是質粒。
4.含有如權利要求1所述的DNA序列的大腸桿菌。
5.根據權利要求4所述的大腸桿菌，其特徵在於所述的大腸桿菌已於2003年11月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號(CGMCC)為1049或者保藏號為1050。
6.一種反相層析分離純化重組人白細胞介素-15的方法，包括如下步驟a)在反相柱中，使用緩衝液A平衡層析至少2個柱體積，其中所述的緩衝液A是含有三氟乙酸0.005％～0.01％乙腈0.5～2％的水溶液，b)重組人白細胞介素-15粗品進樣；c)用緩衝液A和緩衝液B以線性流速2.5cm/min梯度洗脫，按目的蛋白吸收峰收集得一目的蛋白收集物，其中緩衝液B是含有三氟乙酸0.005％～0.01％乙腈85～95％的水溶液；d)將目的蛋白收集物凍幹得一凍乾物；e)將凍乾物於4-10℃溶於生理鹽水，離心分離，得純化重組人白細胞介素-15溶液。
7.一種層析分離、復性重組人白細胞介素-15的方法，包括如下步驟(A)用緩衝液A平衡凝膠過濾層析柱至少2個柱體積；其中所述的緩衝液A含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，50～100mM β-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.6∶4～6mM，0～1M尿素，pH8.0；(B)用緩衝液B逐漸增加尿素的濃度，在層析柱上端0.6個柱體內形成8M至0～1M尿素的向下遞減梯度，線性流速為0.5-1cm/min，此時，層析柱下端0.4倍柱床為0～1M的尿素緩衝液，上端0.6倍柱床為8M-0～1M的尿素緩衝液，其中所述的緩衝液B含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，30～80mMβ-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.6∶4～6mM，8M尿素，pH8.0；(C)重組人白細胞介素-15粗品上樣，體積不超過柱床的5％，濃度不超過10mg/ml；(D)緩衝液B液洗脫0.5個柱體積，然後換成緩衝液A液洗脫，洗脫的線性流速均為0.05～0.1cm/min，收集目的蛋白；(E)在DEAE陰離子交換柱中，用緩衝液C平衡層析柱至少2個柱體積；其中所述的緩衝液C含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mM β-巰基乙醇，pH6～8.0；(F)上樣步驟D得到的目的蛋白後，用緩衝液C洗滌層析柱至少2個柱體積；(G)緩衝液D梯度洗脫，按吸收峰收集得重組人白細胞介素-15收集物，其中所述的緩衝液D含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mM β-巰基乙醇，1～2M NaCl，pH6.0～8.0，；(H)將步驟G的收集物經脫鹽柱脫鹽，得純化的重組人白細胞介素-15。
全文摘要
本發明涉及一種可用於大規模生產人重組白細胞介素－15(recombinant human interleukin－15，rhIL－15)的原核系統表達及純化技術。更具體地，本發明的技術包含一種工程菌和一項全新的表達、純化工藝。該工程菌中含有一種全新的重組表達載體，其中有一全新合成的DNA片斷。
文檔編號C07K1/20GK1621524SQ20031011519
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月26日 優先權日2003年11月26日
發明者唐峰, 何維 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所