一種動態實時測量細胞膜電位的裝置製造方法
2023-06-10 07:54:41 1
一種動態實時測量細胞膜電位的裝置製造方法
【專利摘要】本發明涉及一種動態實時測量細胞膜電位的裝置，包括：用於作為生物傳感器的氮化鎵（GaN）高電子遷移率電晶體（HEMT）器件、微流室、微注射泵和儲液瓶。微流室、微注射泵和儲液瓶依次連接，構成一個封閉的循環系統。微流室作為液體流動和細胞注入之用，微流室內的液體通過微注射泵傳輸給儲液瓶。作為生物傳感器的HEMT器件與微流室耦合，用於檢測所述微流室內細胞在動態條件下的實時細胞膜電位。
【專利說明】—種動態實時測量細胞膜電位的裝置
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種動態實時測量細胞膜電位的裝置。
【背景技術】
[0002]人體體液流動會對細胞會產生剪應力，進而引起細胞電位的變化。剪切力能影響人體內皮細胞生物學特性的許多方面，與多種心血管疾病相關。因此，檢測細胞膜電位是否變化具有重要的生理學和病理學研究意義。
[0003]目前，測量剪切力下的細胞膜電位的方法主要包括螢光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法。
[0004]螢光染料法是利用螢光強度在剪切力作用下會發生改變，並且與膜片鉗得到的細胞膜電位變化趨勢相同的性質，來測量細胞膜電位的一種方法。但這種方法反應時間和精度都有較大差距，且目前無法證明螢光強度能夠代替細胞膜電位表徵細胞的電生理現象。
[0005]微電極陣列法採用集成電路矽工藝，通過微電極陣列能夠表徵大體積的單個肌細胞或神經細胞的動作電位。但這種方法存在測量準備時間長、測量準確度和靈敏度低的缺點。
[0006]膜片鉗方法是目前最常用的方法，它是通過玻璃微電極測量單細胞的膜內外的電壓或電流差，並通過一定的放大和轉換，得到細胞膜電位。但是這種技術具有以下先天性不足:生物組織是由大量細胞緊密排列形成的，而膜片鉗只能測量單細胞，並不能表徵實際的多細胞膜電位對剪切力的響應情況；測量時會破壞細胞膜，改變細胞的特性，短時間內細胞將死亡，這樣就限制了對細胞膜動作電位以及離子通道早期發生現象的研究；在流體環境下測試時，由於剪切力的存在，細胞容易從膜片鉗脫落；膜片鉗技術每次只能記錄一個細胞(或一對細胞)，每天只能獲得的數據量僅為幾到幾十個，耗時耗力。
[0007]綜上所述，螢光染料法、微電極陣列法和膜片鉗方法均無法解決活體多細胞膜電位的測量問題，來準確表徵剪切力對細胞膜電位的影響。
[0008]因此，需要一種具有檢測快速、靈敏度高、實時測量、結果準確、生物兼容性高、多細胞活體測量等多重優點的裝置及方法，來進行細胞膜電位的測量。
【發明內容】
[0009]因此，為解決現有技術中存在的上述問題而完成了本發明，本發明的目的在於提供一種實時的準確測量剪切力影響的活體多細胞膜電位的裝置，該裝置使用了氮化鎵(GaN)高電子遷移率電晶體(HEMT )器件技術，並與一定的高彈性、表面張力小且高透光率的高分子材料製成的剪切力微流室、微注射泵和儲液瓶相連接，能夠動態模擬多細胞環境並實時監測流體環境下的活體多細胞膜電位。
[0010]本發明的特點在於用微注射泵來提供動態流體環境，以實現實時監測流體環境下的活體多細胞膜電位。
[0011]本發明裝置的基本結構為:將作為生物傳感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、儲液瓶相連，在微注射泵提供動態流體環境的前提下，通過HEMT器件實時監測流體環境下的活體多細胞膜電位。
[0012]本發明中裝置的使用方法為:採用微注射泵與細胞膜電位檢測裝置連接形成血液動力系統，該系統架設在37°C恆溫箱中維持溫度穩定，實驗中使用PBS作為流體，並且實驗全程通入含5%C02的空氣以保持流體環境的酸鹼度。
[0013]本發明中應用於生物傳感器的HEMT器件的結構為:底層為藍寶石材料，底層向上依次為1.6 μ m左右的GaN緩衝層，1.2nm AlN插入層，8?15nm左右的AlGaN勢壘層和
1.5nm GaN帽層，勢壘層鋁組分在25%?40%之間。帽層以上為Si3N4鈍化層，鈍化層中間被蝕刻出一塊長方形槽狀的裸柵區域，裸柵區域無電極弓I出，尺寸在10 μ m?IOmm範圍內。
[0014]本發明中HEMT器件的製造工藝為:
[0015](I)臺面刻蝕，採用ICP方法刻蝕異質結材料形成器件的臺面隔離；
[0016](2)澱積源漏極歐姆金屬，採用電子束蒸發的方法獲得歐姆金屬層，歐姆金屬採用Ti/Al/Ni/Au四層結構，並在830°C下退火形成合金，獲得良好的源漏極歐姆接觸；
[0017](3)採用PECVD方法澱積Si3N4材料作為鈍化層；
[0018](4)光刻並採用ICP方法刻蝕Si3N4，露出裸柵區域。
[0019]本發明中微流室的結構為:在HEMT器件上方覆蓋了用高分子聚合材料製造的與裸柵相同的槽狀圖形，槽內安裝微流室。微流室材料選用聚二甲基矽氧烷(polydimethyl si loxane, PDMS)材料，除此以外,還可採用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),聚醯亞胺(polyimide)等材料。微流室反應室尺寸設計與器件柵極圖形保持一致。微流室兩側有封接口，作為液體流動和細胞注入之用。微流室用於培養細胞，培養完成後連接微注射泵，以提供精確的流量控制。微流室兩端有兩個直徑在0.1mm?0.5mm左右的小孔，能夠與外部相連。微流室部件與HEMT器件封接，得到一個密閉的通道，溶液能夠在通道中流動，形成流體動力學下的細胞膜電位檢測裝置。
[0020]本發明中微流室的製作工藝為:先採用光刻的方法或反應離子刻蝕(RIE)的方法製造出微流室凸突的陽模，然後在陽模上澆鑄PDMS，在約50 V溫度下固化後使PDMS從陽模上剝離，即可製得微流室部件。微流室兩端的小孔採用鑽孔法或其他方法得到。微流室部件與HEMT晶片封接工藝採用熱壓法或粘合法等方法。
[0021]本發明中活體細胞的分離方法為:在無菌條件下，向以獲取的新鮮的人體臍帶靜脈血中加入lg/L膠原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1) (V/V)的混合液15mL，置於37°C水浴箱中孵育8min，將消化液收集入離心管，用磷酸鹽緩衝液(PBS)衝洗臍靜脈2次，將衝洗液一同收集入離心管，1000r/min離心lOmin，取上清液，加入完全培養液重懸細胞，取0.1mL細胞懸液用4g/L臺盼藍染色後作活細胞計數。將2X 104/L細胞接種到24孔板中，每孔加入完全培養液lmL，置於37°C、950mL/L 02、50mL/L CO2培養箱內靜置培養，並採用臺盼藍排斥法，將0.1mL混勻的內皮細胞懸液與4g/L臺盼藍0.9mL混勻後，取I滴在顯微鏡下計數100個細胞。當細胞懸液中細胞存活率大於95%時，可用於進行原代細胞培養。
[0022]本發明中活體細胞的培養方法為:用酒精對HEMT器件消毒後，使用纖連蛋白溶液(fibronectin)進行處理30min,以增強細胞的附著度。並使用PBS衝洗,並接種細胞,使細胞密度達到5000?12000cells/mm2，並保證細胞全程置於含5%C02的37°C恆溫箱中。
[0023]本發明中器件裸柵上培養的細胞受到的剪切力由以下公式推導:
【權利要求】
1.一種動態實時測量細胞膜電位的裝置，包括:用於作為生物傳感器的氮化鎵(GaN)高電子遷移率電晶體(HEMT)器件、微流室、微注射泵和儲液瓶，其特徵在於，將所述微流室、微注射泵和儲液瓶依次連接，構成一個封閉的循環系統；所述微流室作為液體流動和細胞注入之用，所述微流室內的液體通過所述微注射泵傳輸給所述儲液瓶，所述作為生物傳感器的HEMT器件與所述微流室耦合，用於檢測所述微流室內細胞在動態條件下的實時細胞膜電位。
2.根據權利要求1所述的裝置，其中所述的HEMT器件由底層到上層的累積層依次為藍寶石襯底層、GaN緩衝層、AlN插入層、AlGaN勢壘層、GaN帽層和Si3N4鈍化層；其中所述GaN緩衝層厚度為1.6 μ m左右；所述的AlN插入層厚度為1.2nm ;所述的AlGaN勢壘層厚度為.8~15nm左右；所述的GaN帽層厚度為1.5nm ;所述的HEMT器件的勢壘層鋁組分在25%~.40%之間；所述的HEMT器件的鈍化層中間有一塊長方形槽狀的裸柵區域；所述的HEMT器件的裸柵區域無電極引出，尺寸在10 μ m~IOmm範圍內；所述的HEMT器件的上方的覆蓋物的材質為高分子聚合材料，形狀為與裸柵相同的槽狀圖形。
3.根據權利要求2所述的裝置，其中所述的微流室安裝在HEMT器件與高分子聚合材料形成的槽形空間內，微流室反應室尺寸設計與器件柵極圖形保持一致。
4.根據權利要求3所述的裝置，其中所述的微流室的製造材料選用聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS),除此以外，還可採用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),聚醯亞胺(polyimide)等材料。；微流室包括其兩側的封接口，微流室與微注射泵連接。
5.一種用於如權利要求1所述的裝置的HEMT器件，其製造方法包括步驟: .1)臺面刻蝕，即採用ICP方法刻蝕異質結材料形成器件的臺面隔離；. 2)澱積源漏極歐姆金屬，採用電子束蒸發的方法獲得歐姆金屬層，歐姆金屬採用Ti/Al/Ni/Au四層結構，並在830°C下退火形成合金，獲得良好的源漏極歐姆接觸； . 3)採用PECVD方法澱積Si3N4材料作為鈍化層； . 4)光刻並採用ICP方法刻蝕Si3N4,露出裸柵區域。
6.一種用於如權利要求1所述的裝置的微流室，其製造方法包括步驟: 1)採用光刻的方法或反應離子刻蝕(RIE)的方法製造出微流室凸突的陽模，然後在陽模.上澆鑄PDMS，在約50°C溫度下固化後使PDMS從陽模上剝離，即製得微流室部件； . 2)微流室兩端的小孔採用鑽孔法得到； .3)微流室部件與HEMT晶片封接工藝採用熱壓法或粘合法。
7.根據權利要求1所述的裝置測量細胞膜電位的方法，所述方法包括步驟: . 1)在無菌條件下，將獲取的新鮮的人體臍帶靜脈血加入lg/L膠原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1) (V/V)的混合液15mL，置於37°C水浴箱中孵育8min ； .2)將步驟I)得到的液體收集入離心管，用磷酸鹽緩衝液(PBS)衝洗臍靜脈2次，將衝洗後的液體一同收集入離心管，1000r/min離心10min，取上清液，加入完全培養液重懸細胞； .3)取0.1mL細胞懸液用4g/L臺盼藍染色後作活細胞計數； .4)將2X104/L細胞接種到24孔板中，每孔加入完全培養液lmL，置於37°C、950mL/L.02、50mL/L CO2培養箱內靜置培養，並採用臺盼藍排斥法，將0.1mL混勻的內皮細胞懸液與.4g/L臺盼藍0.9mL混勻後，取I滴在顯微鏡下計數100個細胞； .5)用酒精對HEMT器件消毒後，使用纖連蛋白溶液(fibronectin)進行處理30min，並使用PBS衝洗，然後接種細胞，使細胞密度達到5000~12000cells/mm2，並保證細胞全程置於含5%C02的37 °C恆溫箱中； 6)採用微注射泵與細胞膜電位檢測裝置連接形成血液動力系統，該系統架設在37°C恆溫箱中維持溫度穩定，實驗中使用PBS作為流體，並且實驗全程通入含5%C02的空氣以保持流體環境的酸鹼度； 7)器件裸柵上培養的細胞受到的剪切力由以下公式推導:
8.根據權利要求7所述的測量細胞膜電位的方法，所述預先測量為:對在同一晶圓上、且採用相同版圖的常規三端HEMT器件，加相同漏源電壓VDS，測試其轉移曲線(Ve-1D)，得到柵電壓在_70mV~OV處對應的器件跨導值。
【文檔編號】G01N27/26GK103954658SQ201410133539
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】張鵬, 黃辰, 張毅奕, 馬曉華, 郝躍 申請人:西安電子科技大學