一種魚皮膠原自組裝成纖維的方法與流程
2023-09-11 13:02:10
本發明屬於生物材料技術領域，具體地，涉及一種魚皮膠原自組裝成纖維的方法。
背景技術：
膠原是動物組織中的一類結構蛋白，約佔總蛋白量的1/3，廣泛分布於動物的皮膚、骨骼、軟骨、結締組織、腱、角膜、內臟細胞間質、肌腔、韌帶、鞏膜等部位。因其具有獨特的三股螺旋結構、低抗原性、無毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點，已被廣泛應用於組織工程支架材料、止血海綿、藥物控緩釋系統、基因傳遞載體、美容外科等生物醫用領域。但是，目前使用的膠原蛋白主要來源於豬皮、牛皮和豬骨、牛骨，近年來由於狂牛症、口蹄疫等人畜交叉流行病的頻發，豬和牛中來源的膠原蛋白的應用受到了限制。此外，在某些宗教人群中，豬來源的膠原蛋白被禁止使用。在這種情況下，水產膠原蛋白由於原料豐富、易於提取、低抗原性、低致敏性、高度可溶性、沒有傳染病危險和宗教障礙而受到廣泛的關注。其中深海魚皮膠原蛋白，顧名思義就是以深海魚魚皮為原料提取的膠原蛋白。由於深海的低溫低壓，使這類膠原蛋白具有著普通的陸生動物膠原蛋白和淡水魚、淺海魚膠原蛋白所不具備的特殊性質。首先區別在於膠原蛋白活性激發的溫度。陸生動物內提取的膠原蛋白活性要在35度才能把活性全部激發。也就是說要在35度以上吸收的效果才會達到最佳。而魚提取的活性激發溫度就要低很多，十度以上就能發揮最好的效果。
自組裝性是膠原的重要特性。通常，溶解於溶液中的膠原是游離的多肽鏈，而不是三股螺旋鏈。膠原通過自組裝能夠形成三股螺旋結構，進而形成纖維等，這是其在生物材料領域應用的基礎。以往關於膠原自組裝性的研究多針對陸生哺乳動物膠原，對水產膠原的探討較少。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種魚皮膠原自組裝成纖維的方法，本發明將魚皮膠原蛋白粉作為原料採用檸檬酸對其溶解反應，最終通過自組裝形成纖維。
為解決現有技術問題，本發明的提供一種魚皮膠原自組裝成纖維的方法，所述魚皮膠原自組裝成纖維的方法包括如下步驟：
（1）提取魚皮膠原粉；
（2）將所述步驟（1）中的魚皮膠原粉溶解於檸檬酸溶液中；
（3）對所述步驟（2）中的混合液進行離心，取上清液；
（4）將所述步驟（3）中的上清液與醋酸緩衝液在冰浴中混合，攪拌均勻，調節溶液ph；
（5）將所述步驟（4）中的混合液在水浴鍋中水浴，即得自組裝體膠原纖維。
優選地，所述魚皮膠原粉的製備方法包括如下步驟：
（1）取新鮮魚皮清洗，除雜；
（2）取清洗後的魚皮原料用濃度為0.16-3.0mol/l的氫氧化鉀溶液在0-20℃條件下浸泡1-20h，所加入的氫氧化鉀溶液與魚皮原料的體積重量比為10-20∶1，在浸泡過程中，每隔2-4h，更換浸泡用氫氧化鉀溶液1-2次；浸泡完畢後，清洗，過濾；清洗後向魚皮原料中加入有機溶劑浸泡2-6h，加清水，使魚皮原料與有機溶劑的質量體積百分比為5-10％；
（3）取所述步驟（2）所得原料混合液，加入濃度為0.36-1.68mol/l的醋酸溶液在0-20℃的條件下進行溶脹處理12-36h，所加入的醋酸溶液溶液與原料混合液的體積重量比為10-15∶1；然後在0-30℃條件下凍結1-10h；凍結完畢後，加入適量的0.15-0.45mol/l的醋酸溶液進行打漿破碎，獲得粒徑2-4mm的顆粒料漿；
（4）向所述步驟（3）中的顆粒料漿中加入0.05-3.56mol/l的醋酸溶液進行提取，所加入的醋酸溶液與顆粒料漿的體積重量比為15-30∶1，提取溫度0-25℃，提取時間為24-48h；提取完畢後，以60-80目紗網過濾，得提取液；向濾渣中加醋酸溶液，按上述操作重複提取1-2次，得提取液和濾渣，向提取液中加入1.5-2.5mol/l氯化鈉溶液進行鹽析沉澱，沉澱乾燥後即得魚皮膠原粉。
優選地，所述檸檬酸溶液的製備方法包括如下步驟：
（1）質料過濾除雜：製備橘汁，用壓濾機壓濾，對橘汁過濾除雜，得橘汁酸水；
（2）中和：把橘汁酸水加熱至60-75℃，逐步向其摻加碳酸鈣乳漿，持續加熱2-3h，初溫控制在5-8℃左右，最終可升高到90-100℃，至溶液呈青綠色時，即表明已完結中和，然後靜置沉澱，所得沉澱即為檸檬酸鈣；
（3）除鹽：所得檸檬酸鈣富含鹽分，用清水洗刷，加熱至60-70℃，重複2-3次，直至鹽分除淨停止，乾燥得檸檬酸鈣漿液，備用；
（4）酸解脫色：將檸檬酸鈣漿液加熱至60-70℃，摻加質量分數為20-30%的鹽酸，加熱2-3小時，靜置沉積，上層清液即為檸檬酸溶液，用3-5%活性炭脫色20-30min，則得檸檬酸溶液。
優選地，所述步驟（2）中魚皮膠原粉溶解於0.2-0.6mol/l檸檬酸溶液中，溶解24-48h，製成2-6mg/ml的膠原溶液。
優選地，所述步驟（3）中離心條件為2000-2500r/min，離心時間為20-30min。
優選地，所述步驟（4）中的醋酸緩衝液為0.2-0.4mol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝液。
優選地，所述步驟（4）中的上清液與醋酸緩衝液體積比為2-3：1。
優選地，所述步驟（5）中的水浴溫度為20-30℃，水浴時間為12-36h。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
（1）本發明探討水產膠原自組裝形成纖維的方法，通過本發明方法所得膠原纖維為絲狀纖維，與深海魚皮中天然存在的膠原纖維形態極其相似，在醫用生物材料領域具有很高的應用前景；
（2）本發明採用檸檬酸溶液溶解魚皮膠原蛋白，由於檸檬酸具有3個羧基，可同時與多個蛋白質多肽鏈的羥基脫水縮合，進而使多肽鏈的螺旋結構更加緊密牢固，形成的纖維橫紋密而多，提高了纖維的性能。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例1
本實施例提供的魚皮膠原自組裝成纖維的方法，包括如下步驟：
（1）提取魚皮膠原粉；
（2）將所述步驟（1）中的魚皮膠原粉溶解於檸檬酸溶液中，所述魚皮膠原粉溶解於0.6mol/l檸檬酸溶液中，溶解24h，製成6mg/ml的膠原溶液；
（3）對所述步驟（2）中的混合液進行離心，取上清液，離心條件為2000r/min，離心時間為30min；
（4）將所述步驟（3）中的上清液與醋酸緩衝液在冰浴中混合，攪拌均勻，調節溶液ph，所述醋酸緩衝液為0.2mol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝液，所述上清液與醋酸緩衝液體積比為3：1；
（5）將所述步驟（4）中的混合液在水浴鍋中水浴，即得自組裝體膠原纖維，所述水浴溫度為20℃，水浴時間為36h。
其中，所述魚皮膠原粉的製備方法包括如下步驟：
（1）取新鮮魚皮清洗，除雜；
（2）取清洗後的魚皮原料用濃度為0.16mol/l的氫氧化鉀溶液在20℃條件下浸泡1h，所加入的氫氧化鉀溶液與魚皮原料的體積重量比為20∶1，在浸泡過程中，每隔2h，更換浸泡用氫氧化鉀溶液2次；浸泡完畢後，清洗，過濾；清洗後向魚皮原料中加入有機溶劑浸泡2h，加清水，使魚皮原料與有機溶劑的質量體積百分比為10％；
（3）取所述步驟（2）所得原料混合液，加入濃度為0.36mol/l的醋酸溶液在20℃的條件下進行溶脹處理12h，所加入的醋酸溶液溶液與原料混合液的體積重量比為15∶1；然後在0℃條件下凍結10h；凍結完畢後，加入適量的0.15mol/l的醋酸溶液進行打漿破碎，獲得粒徑4mm的顆粒料漿；
（4）向所述步驟（3）中的顆粒料漿中加入0.05mol/l的醋酸溶液進行提取，所加入的醋酸溶液與顆粒料漿的體積重量比為30∶1，提取溫度0℃，提取時間為48h；提取完畢後，以60目紗網過濾，得提取液；向濾渣中加醋酸溶液，按上述操作重複提取2次，得提取液和濾渣，向提取液中加入1.5mol/l氯化鈉溶液進行鹽析沉澱，沉澱乾燥後即得魚皮膠原粉。
其中，所述檸檬酸溶液的製備方法包括如下步驟：
（1）質料過濾除雜：製備橘汁，用壓濾機壓濾，對橘汁過濾除雜，得橘汁酸水；
（2）中和：把橘汁酸水加熱至75℃，逐步向其摻加碳酸鈣乳漿，持續加熱2h，初溫控制在8℃左右，最終可升高到90℃，至溶液呈青綠色時，即表明已完結中和，然後靜置沉澱，所得沉澱即為檸檬酸鈣；
（3）除鹽：所得檸檬酸鈣富含鹽分，用清水洗刷，加熱至70℃，重複2次，直至鹽分除淨停止，乾燥得檸檬酸鈣漿液，備用；
（4）酸解脫色：將檸檬酸鈣漿液加熱至70℃，摻加質量分數為20%的鹽酸，加熱3小時，靜置沉積，上層清液即為檸檬酸溶液，用3%活性炭脫色30min，則得檸檬酸溶液。
實施例2
本實施例提供的魚皮膠原自組裝成纖維的方法，包括如下步驟：
（1）提取魚皮膠原粉；
（2）將所述步驟（1）中的魚皮膠原粉溶解於檸檬酸溶液中，所述魚皮膠原粉溶解於0.2mol/l檸檬酸溶液中，溶解48h，製成2mg/ml的膠原溶液；
（3）對所述步驟（2）中的混合液進行離心，取上清液，離心條件為2500r/min，離心時間為20min；
（4）將所述步驟（3）中的上清液與醋酸緩衝液在冰浴中混合，攪拌均勻，調節溶液ph，所述醋酸緩衝液為0.4mol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝液，所述上清液與醋酸緩衝液體積比為2：1；
（5）將所述步驟（4）中的混合液在水浴鍋中水浴，即得自組裝體膠原纖維，所述水浴溫度為30℃，水浴時間為12h。
其中，所述魚皮膠原粉的製備方法包括如下步驟：
（1）取新鮮魚皮清洗，除雜；
（2）取清洗後的魚皮原料用濃度為3.0mol/l的氫氧化鉀溶液在0℃條件下浸泡20h，所加入的氫氧化鉀溶液與魚皮原料的體積重量比為10∶1，在浸泡過程中，每隔4h，更換浸泡用氫氧化鉀溶液1次；浸泡完畢後，清洗，過濾；清洗後向魚皮原料中加入有機溶劑浸泡6h，加清水，使魚皮原料與有機溶劑的質量體積百分比為5％；
（3）取所述步驟（2）所得原料混合液，加入濃度為1.68mol/l的醋酸溶液在0℃的條件下進行溶脹處理36h，所加入的醋酸溶液溶液與原料混合液的體積重量比為10∶1；然後在30℃條件下凍結1h；凍結完畢後，加入適量的0.45mol/l的醋酸溶液進行打漿破碎，獲得粒徑2mm的顆粒料漿；
（4）向所述步驟（3）中的顆粒料漿中加入3.56mol/l的醋酸溶液進行提取，所加入的醋酸溶液與顆粒料漿的體積重量比為15∶1，提取溫度25℃，提取時間為24h；提取完畢後，以80目紗網過濾，得提取液；向濾渣中加醋酸溶液，按上述操作重複提取1次，得提取液和濾渣，向提取液中加入2.5mol/l氯化鈉溶液進行鹽析沉澱，沉澱乾燥後即得魚皮膠原粉。
其中，所述檸檬酸溶液的製備方法包括如下步驟：
（1）質料過濾除雜：製備橘汁，用壓濾機壓濾，對橘汁過濾除雜，得橘汁酸水；
（2）中和：把橘汁酸水加熱至60℃，逐步向其摻加碳酸鈣乳漿，持續加熱3h，初溫控制在5℃左右，最終可升高到100℃，至溶液呈青綠色時，即表明已完結中和，然後靜置沉澱，所得沉澱即為檸檬酸鈣；
（3）除鹽：所得檸檬酸鈣富含鹽分，用清水洗刷，加熱至60℃，重複3次，直至鹽分除淨停止，乾燥得檸檬酸鈣漿液，備用；
（4）酸解脫色：將檸檬酸鈣漿液加熱至60℃，摻加質量分數為30%的鹽酸，加熱2小時，靜置沉積，上層清液即為檸檬酸溶液，用5%活性炭脫色20min，則得檸檬酸溶液。
實施例3
本實施例提供的魚皮膠原自組裝成纖維的方法，包括如下步驟：
（1）提取魚皮膠原粉；
（2）將所述步驟（1）中的魚皮膠原粉溶解於檸檬酸溶液中，所述魚皮膠原粉溶解於0.4mol/l檸檬酸溶液中，溶解40h，製成5mg/ml的膠原溶液；
（3）對所述步驟（2）中的混合液進行離心，取上清液，離心條件為2200r/min，離心時間為25min；
（4）將所述步驟（3）中的上清液與醋酸緩衝液在冰浴中混合，攪拌均勻，調節溶液ph，所述醋酸緩衝液為0.3mol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝液，所述上清液與醋酸緩衝液體積比為3：1；
（5）將所述步驟（4）中的混合液在水浴鍋中水浴，即得自組裝體膠原纖維，所述水浴溫度為25℃，水浴時間為30h。
其中，所述魚皮膠原粉的製備方法包括如下步驟：
（1）取新鮮魚皮清洗，除雜；
（2）取清洗後的魚皮原料用濃度為1.5mol/l的氫氧化鉀溶液在15℃條件下浸泡15h，所加入的氫氧化鉀溶液與魚皮原料的體積重量比為15∶1，在浸泡過程中，每隔3h，更換浸泡用氫氧化鉀溶液1次；浸泡完畢後，清洗，過濾；清洗後向魚皮原料中加入有機溶劑浸泡4h，加清水，使魚皮原料與有機溶劑的質量體積百分比為7％；
（3）取所述步驟（2）所得原料混合液，加入濃度為1.4mol/l的醋酸溶液在10℃的條件下進行溶脹處理30h，所加入的醋酸溶液溶液與原料混合液的體積重量比為13∶1；然後在20℃條件下凍結6h；凍結完畢後，加入適量的0.35mol/l的醋酸溶液進行打漿破碎，獲得粒徑3mm的顆粒料漿；
（4）向所述步驟（3）中的顆粒料漿中加入0.25mol/l的醋酸溶液進行提取，所加入的醋酸溶液與顆粒料漿的體積重量比為20∶1，提取溫度20℃，提取時間為40h；提取完畢後，以70目紗網過濾，得提取液；向濾渣中加醋酸溶液，按上述操作重複提取1次，得提取液和濾渣，向提取液中加入2.0mol/l氯化鈉溶液進行鹽析沉澱，沉澱乾燥後即得魚皮膠原粉。
其中，所述檸檬酸溶液的製備方法包括如下步驟：
（1）質料過濾除雜：製備橘汁，用壓濾機壓濾，對橘汁過濾除雜，得橘汁酸水；
（2）中和：把橘汁酸水加熱至65℃，逐步向其摻加碳酸鈣乳漿，持續加熱3h，初溫控制在7℃左右，最終可升高到95℃，至溶液呈青綠色時，即表明已完結中和，然後靜置沉澱，所得沉澱即為檸檬酸鈣；
（3）除鹽：所得檸檬酸鈣富含鹽分，用清水洗刷，加熱至66℃，重複3次，直至鹽分除淨停止，乾燥得檸檬酸鈣漿液，備用；
（4）酸解脫色：將檸檬酸鈣漿液加熱至68℃，摻加質量分數為24%的鹽酸，加熱2小時，靜置沉積，上層清液即為檸檬酸溶液，用4%活性炭脫色28min，則得檸檬酸溶液。
實施例4
本實施例提供的魚皮膠原自組裝成纖維的方法，包括如下步驟：
（1）提取魚皮膠原粉；
（2）將所述步驟（1）中的魚皮膠原粉溶解於檸檬酸溶液中，所述魚皮膠原粉溶解於0.3mol/l檸檬酸溶液中，溶解42h，製成5mg/ml的膠原溶液；
（3）對所述步驟（2）中的混合液進行離心，取上清液，離心條件為2100r/min，離心時間為22min；
（4）將所述步驟（3）中的上清液與醋酸緩衝液在冰浴中混合，攪拌均勻，調節溶液ph，所述醋酸緩衝液為0.3mol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝液，所述上清液與醋酸緩衝液體積比為2：1；
（5）將所述步驟（4）中的混合液在水浴鍋中水浴，即得自組裝體膠原纖維，所述水浴溫度為21℃，水浴時間為17h。
其中，所述魚皮膠原粉的製備方法包括如下步驟：
（1）取新鮮魚皮清洗，除雜；
（2）取清洗後的魚皮原料用濃度為1.65mol/l的氫氧化鉀溶液在15℃條件下浸泡18h，所加入的氫氧化鉀溶液與魚皮原料的體積重量比為14∶1，在浸泡過程中，每隔2h，更換浸泡用氫氧化鉀溶液2次；浸泡完畢後，清洗，過濾；清洗後向魚皮原料中加入有機溶劑浸泡3h，加清水，使魚皮原料與有機溶劑的質量體積百分比為6％；
（3）取所述步驟（2）所得原料混合液，加入濃度為0.78mol/l的醋酸溶液在14℃的條件下進行溶脹處理23h，所加入的醋酸溶液溶液與原料混合液的體積重量比為12∶1；然後在12℃條件下凍結3h；凍結完畢後，加入適量的0.35mol/l的醋酸溶液進行打漿破碎，獲得粒徑3mm的顆粒料漿；
（4）向所述步驟（3）中的顆粒料漿中加入2.56mol/l的醋酸溶液進行提取，所加入的醋酸溶液與顆粒料漿的體積重量比為19∶1，提取溫度12℃，提取時間為33h；提取完畢後，以64目紗網過濾，得提取液；向濾渣中加醋酸溶液，按上述操作重複提取1次，得提取液和濾渣，向提取液中加入2.5mol/l氯化鈉溶液進行鹽析沉澱，沉澱乾燥後即得魚皮膠原粉。
其中，所述檸檬酸溶液的製備方法包括如下步驟：
（1）質料過濾除雜：製備橘汁，用壓濾機壓濾，對橘汁過濾除雜，得橘汁酸水；
（2）中和：把橘汁酸水加熱至73℃，逐步向其摻加碳酸鈣乳漿，持續加熱3h，初溫控制在6℃左右，最終可升高到99℃，至溶液呈青綠色時，即表明已完結中和，然後靜置沉澱，所得沉澱即為檸檬酸鈣；
（3）除鹽：所得檸檬酸鈣富含鹽分，用清水洗刷，加熱至61℃，重複3次，直至鹽分除淨停止，乾燥得檸檬酸鈣漿液，備用；
（4）酸解脫色：將檸檬酸鈣漿液加熱至63℃，摻加質量分數為23%的鹽酸，加熱3小時，靜置沉積，上層清液即為檸檬酸溶液，用4%活性炭脫色26min，則得檸檬酸溶液。
實施例5
本實施例提供的魚皮膠原自組裝成纖維的方法，包括如下步驟：
（1）提取魚皮膠原粉；
（2）將所述步驟（1）中的魚皮膠原粉溶解於檸檬酸溶液中，所述魚皮膠原粉溶解於0.4mol/l檸檬酸溶液中，溶解46h，製成5mg/ml的膠原溶液；
（3）對所述步驟（2）中的混合液進行離心，取上清液，離心條件為2400r/min，離心時間為23min；
（4）將所述步驟（3）中的上清液與醋酸緩衝液在冰浴中混合，攪拌均勻，調節溶液ph，所述醋酸緩衝液為0.3mol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝液，所述上清液與醋酸緩衝液體積比為2：1；
（5）將所述步驟（4）中的混合液在水浴鍋中水浴，即得自組裝體膠原纖維，所述水浴溫度為27℃，水浴時間為23h。
其中，所述魚皮膠原粉的製備方法包括如下步驟：
（1）取新鮮魚皮清洗，除雜；
（2）取清洗後的魚皮原料用濃度為0.22mol/l的氫氧化鉀溶液在13℃條件下浸泡5h，所加入的氫氧化鉀溶液與魚皮原料的體積重量比為17∶1，在浸泡過程中，每隔3h，更換浸泡用氫氧化鉀溶液2次；浸泡完畢後，清洗，過濾；清洗後向魚皮原料中加入有機溶劑浸泡3h，加清水，使魚皮原料與有機溶劑的質量體積百分比為8％；
（3）取所述步驟（2）所得原料混合液，加入濃度為1.48mol/l的醋酸溶液在13℃的條件下進行溶脹處理19h，所加入的醋酸溶液溶液與原料混合液的體積重量比為12∶1；然後在25℃條件下凍結9h；凍結完畢後，加入適量的0.25mol/l的醋酸溶液進行打漿破碎，獲得粒徑3mm的顆粒料漿；
（4）向所述步驟（3）中的顆粒料漿中加入2.56mol/l的醋酸溶液進行提取，所加入的醋酸溶液與顆粒料漿的體積重量比為17∶1，提取溫度13℃，提取時間為37h；提取完畢後，以63目紗網過濾，得提取液；向濾渣中加醋酸溶液，按上述操作重複提取1次，得提取液和濾渣，向提取液中加入1.9mol/l氯化鈉溶液進行鹽析沉澱，沉澱乾燥後即得魚皮膠原粉。
其中，所述檸檬酸溶液的製備方法包括如下步驟：
（1）質料過濾除雜：製備橘汁，用壓濾機壓濾，對橘汁過濾除雜，得橘汁酸水；
（2）中和：把橘汁酸水加熱至65℃，逐步向其摻加碳酸鈣乳漿，持續加熱3h，初溫控制在6℃左右，最終可升高到98℃，至溶液呈青綠色時，即表明已完結中和，然後靜置沉澱，所得沉澱即為檸檬酸鈣；
（3）除鹽：所得檸檬酸鈣富含鹽分，用清水洗刷，加熱至63℃，重複3次，直至鹽分除淨停止，乾燥得檸檬酸鈣漿液，備用；
（4）酸解脫色：將檸檬酸鈣漿液加熱至67℃，摻加質量分數為22%的鹽酸，加熱2小時，靜置沉積，上層清液即為檸檬酸溶液，用4%活性炭脫色24min，則得檸檬酸溶液。
以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。