禽胚層細胞系的製作方法

2023-09-11 14:18:55 2

專利名稱：禽胚層細胞系的製作方法
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關於聯邦政府贊助的研究或開發的聲明本發明的完成使用了聯邦政府的資金USDA 96-CRHR-0-6055。因此聯邦政府享有本發明的某些權利。
背景技術：
本發明涉及能無限增殖的禽胚層細胞系和製造該細胞系的方法以及用於該方法的材料。這些細胞系對產生轉基因禽類和保持種系基因組而言是理想的。
轉基因技術是一種改善植物的商業價值的強效工具(如增加它們對疾病和除草劑的抗性)。然而，改善動物遺傳性狀的嘗試落後於植物的，大部分早期研究者重於採用動物作為生產合成性人用藥物的生物反應器。至今用轉基因方法對家畜遺傳質量的改善取得的進展極小。
這種努力的具體進展在於通常高密度飼育的家畜(如雞、鴨、鵝、火雞等)產業，而高密度飼養導致受疾病(如馬立克病和雞白血病)感染的危險性增加。因此商業飼養者設法選擇(用天然飼養方法)疾病抵抗能力增加的家畜。
曾經作過某些設想將外源基因引入到家畜飼養的品種中，來增加對疾病的抵抗力。例如，採用對雞白血病病毒某一亞型的抗性增加的突變型ALV病毒感染一胚系。參見M.Federspiel等人，65 J.Virol.313-19(1991)。本文將該出版物和所引用的其它所有出版物全部納入作為參考。
還嘗試過引入選定的外源基因，通過將它們克隆入逆轉錄病毒載體(如網狀內皮病毒或雞白血病病毒)，將此重組病毒注射入受精卵中，讓病毒感染髮育的胚胎(如原生殖細胞)，從而產生一種嵌合的性腺或卵細胞，並用如此得到的重組體設法將外源基因引入後代。然而，家畜業不願將這種技術用作商業方法，因為病毒(天然狀態時)是病原，即使變異複製的感受態病毒載體有時也會誘發腫瘤，而且複製非感受態變體需要很高的劑量或多次量。而且，甚至複製缺陷型病毒構建物可能具有與內源病毒包膜重組而變成重組感受態的某些危險。另外，最近這些病毒限於尺寸相對小的DNA插入物(如2千個或以下的鹼基對)。
還企圖將外源DNA注射入未發育的受精卵細胞，然後通過手術從母雞中取出。參見M.Perry，331 Nature(1998)。然而，這種方法需要將發育的胚胎在一系列的替代容器中培養。另外，還需要特定的產蛋禽群和廣泛實踐來得到所需的手術和專業技術。
技術上需要較低的現有方法包括將外源DNA引入已產下的卵的胚胎中。通常參見J.Petitte等人，76 Poult.Sci.，1084-92(1997)；R.Etches等人，62MethodsMol.Biol.，433-50(1997)；M.Naito等人，113 J.Reprod.Fertil，137-43(1998)；M.Nakamura等人，67 Okajimas Folia Anat Jpn.，473-7(1991)；J.Petitte等人，108Development，185-9(1990)；和美國專利5,340,740和5,656,479，J.Petitte等人。
還包括在產蛋後48小時或立即(當原生殖細胞開始遷移到性腺肛原(analagen)時)將基因修飾的胚胎細胞或原生殖細胞注射入胚層。在該方法中，當摻入發育的胚胎時，產生的胚層細胞培養物保留了它們分化成能產生細胞的功能性卵細胞或精子的能力。
可將這種類型的胚層細胞培養物進行基因修飾然後注射入接收胚胎。接收胚胎通常已用γ射線預先進行修飾而削弱了內源性原生殖細胞，並給予注射的細胞在進入性腺肛原時有利的選擇。然後被修飾的細胞成熟，產生能將轉基因傳遞給至少下一代(和較佳地以後幾代)的精子或卵細胞。
該方法成功的關鍵在於抑制分化時使培養物中的胚胎胚層細胞擴增的能力。因此一些試驗小組開發了基於添加各種克隆化因子和飼養細胞的培養方法，在維持胚層細胞的原生殖細胞表型的同時進行胚層細胞的短期(幾天到2周左右)擴增。這些培養的細胞成功地產生了嵌合種系細胞，但大部分用該系統來表達轉染的DNA作為轉基因的嘗試都是不成功的。
另一方法依賴使用含有毒素的培養基。
因此，可以看出禽胚層細胞培養需要一種改進的培養條件。
發明概述本發明的一方面提供了一種表達EMA-1表位的未分化禽(較佳地家禽如火雞、鴨、鵝和雞)胚層細胞的培養物，其中該培養物當存在禽臍分離物時(如胚胎禽臍的分離物)能維持其未分化的特性和其在擴增期間(較佳地為6個月以上)表達EMA-1表位的能力。
本發明另一方面提供了一種產生能表達EMA-1表位的未分化胚層細胞的持續培養物。在形成原條前，從禽胚盤收集禽細胞。然後在存在禽臍分離物(如火雞臍提取物)時培養這些禽細胞。
本發明的另一形式是提供了用於培養禽(如家禽)胚層細胞的培養基，含有禽臍分離物。較佳地，該培養基宜還含有標準胚層培養物中存在的其它成分。
本發明的另一形式是提供了一種保存禽種系基因組的方法。這可以通過冷凍上述培養物之一完成。
本發明的另一形式是提供了由這種培養物衍生的重組禽類。
通過用含有禽臍分離物的培養基培養胚層細胞，可以獲得含有未分化原生殖細胞的持續培養物。這就提供了能用於產生重組細胞的有效培養物。
得到的重組胚細胞可用於產生重組禽類和保存種系基因組。另外，似乎這種重組禽類有可能將這些外來性狀遺傳給它們的後代。
因此本發明的目的包括提供(a)能在較長時間保持不分化而無需飼養層或毒素的持續的禽原生殖細胞培養物；(b)由這種細胞培養物衍生的重組禽類；(c)產生這種培養物的方法(d)通過冷凍這種培養物來保存基因組的方法；和(e)用於進行這些方法的培養基。
本發明的這些及其它目的和優點通過以下優選實施例的敘述將會顯而易見。但應將權利要求書作為判斷本發明整個範圍的依據。
發明詳述概述我們提供了一種穩定的禽胚層細胞(「BDC」)培養系統，其無需飼養層或毒素，能維持活的BDC 6個月以上。該培養的BDC能表達EMA-1表位(原生殖細胞的一種標記)。參見，A.Hahnel等人，15 Gamete Research 25-34(1986)和L.Urven等人，103Develop.299-304(1988)。用這種方法產生的培養細胞能提供造血細胞和各種其它細胞類型(當它們被轉染，然後被插入到接收的雞胚胎時)。
材料供體胚層細胞和受體受精卵來源於Avian Disease and Oncology Laboratory(ADOL)。我們使用它們的細胞系0(MHC＝B21B21)、C(MHC＝B12B12)、71(MHC＝B2B2)、15I5x71(MHC＝B2B15)、N(MHC＝B21B21)、P(MHC＝B19B19)，部分是因為這些細胞系是已知的維持無常見病原病毒的細胞系。
我們的培養基如下。用無血清和無蛋白質的雜交瘤培養基(SFPF，#S2897)來培養細胞系0 BDC。
用L-15 Leibovitz培養基/McCoy 5A改良培養基(L/M為1∶1，#L4386，#M4892)來培養細胞系0、細胞系7和15I5x71。
Dulbecco改良的eagle培養基/ham營養混合物(DMEM/F-12，#D0547)用於細胞系C。
極限必需培養基eagle(MEM，#M0644)用於細胞系P。
總的來說，這些培養基通常含有水、無機鹽、維生素、胺基酸、緩衝液、葡萄糖、核苷酸前體/核苷酸、脂類、TCA循環中間體和各種微量添加劑。
在所有培養基中使用終濃度為1,000U/ml的青黴素和鏈黴素(Pen/Strep)來抑制細菌細胞的生長。
還添加毛喉素(#6886或#F3917)來促進細胞系C中BDC的生長(20μg/100ml終濃度)。
所有上述培養基試劑都從Sigma Chemical Co.，St Louis，MO購得，在所有培養基中加入終濃度為20％的胎牛(小牛)血清(FBS，Gibco BRL Life Technonogies，Grand Island，NY)。
從管狀(piping)胚胎得到火雞臍。從環繞臍帶附著處的腹部區域切下各臍(0.7-1cm直徑)。除去殘留的臍帶。將臍合併置於冰冷的無血清培養基中(一個臍2ml培養基)，在冰浴中用組織粉碎器勻漿化，冷凍-解凍3次，並在4℃ 25，000×g離心30分鐘。用於此目的的冰凍培養基為無血清無蛋白質的雜交瘤培養基(SFPF，#S2897)。關鍵特徵是作為相關分離物的含水提取液是水溶性的。
保留上清液，用0.22μm膜除菌過濾(除去大於該尺寸的顆粒)，分成每個小瓶1ml等份，-20℃儲存。將此無菌過濾的火雞臍提取物(「TNE」)新鮮加到細胞培養物中，為400μl TNE/10ml培養基(相當於每100ml培養基2個臍)。
當要孵化禽胚胎時，卵黃囊開始通過腹部區域(通常稱為臍區)中的一個小開口縮回入胚胎的體腔內。在卵黃囊縮回後幾分鐘內該開口將癒合。參見A.Romanoff等人，「禽胚胎結構和功能的發育」，1051-1079，The MacmillanCompany，New York(1960)。
我們相信禽臍組織的細胞分泌加速臍閉合的生長/癒合因子。如果臍不完全癒合，孵化出的小雞在孵化後的早期易受感染。我們發現這些因子可用於我們的培養基。
對任選的添加劑而言，我們採用小雞胚胎提取物。將7日齡的小雞胚胎置於無血清無蛋白質的雜交瘤培養基(SFPF，#S2897)，在冰浴中勻漿化，冰凍-凍融3次，4℃25,000×g離心30分鐘。用0.22μm膜除菌過濾。將無菌小雞胚胎提取物以每個小瓶約一個胚胎的當量等份分裝(取決於所得提取物的量)，-20℃儲存。以相當於每100ml培養基一個胚胎的量任選地加入此提取物。據信這種添加劑能提高細胞的增殖。
EMA-1單克隆抗體是A.Hahnel等人，15Gamete Research 25-34(1986)描述的。它能與原生殖細胞反應。EMA-1表位被視為禽原生殖細胞的一種標記。由U.of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank.(Iowa City，IA)得到EMA-1抗體。
我們將含有2.5％FBS和1％Pen/Strep、Hepe緩衝鹽水2x(HBS2x)溶液(140mM NaCl、1.5mM Na2H2PO4、50mM Hepe(#H9136，Sigma)，pH7.05)和2MCaCl2的去離子水溶液(dH2O)的培養基199(M199，#M7667)用作轉染液。
作為載體的例子，我們使用含有標記蛋白質「綠螢光蛋白」(pEGFP，CLONETECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的質粒。我們還使用含有其它感興趣外源基因的載體。參見J.Fulton等人，25Eur，J.Immunol.2069-2076(1995)所述的ppZeoBFIVprom/FLAG/B21。
為了促進不同培養階段細胞的分離，以無血清的L/M培養基將膠原酶(#17103，GibcoBRL Life Technologies)稀釋至0.2mg/ml。用細胞刮擦橡皮(#14-105B，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)從培養插件中取出細胞。
為了得到胚胎重組體，我們需要接近剛產下的(18小時)雞蛋殼內的卵。由於這要打開蛋殼，我們需要得到蛋殼膜的修補片。為此目的，將蛋敲開，棄去內含物。從蛋殼剝下殼膜，並置於含有1％Pen/Strep磷酸鹽緩衝鹽水的150×20mm無菌培養板上。將殼膜切成約2cm2大小的片。
方法A.產生原生殖細胞系我們製備了本發明的胚層細胞培養物。用顯微解剖剪(#11-1020，BiomedicalResearch Instruments，Inc.，Rockville，MD)從IX-XIV期(H.Eyal-Giladi等人，49Develop.Bio.321-337(1976))未孵化的受精卵中切下胚盤的中央部分，用顯微解剖鑷子(#10-1605，BRI)取出，並置於5ml培養基中。將約30個胚盤合併，用裝在3ml針筒上的22G號針頭輕輕地抽吸幾次來分散細胞。
然後將這些細胞分布在細胞培養插件上(F.Villars等人，12 CellBiol.Toxicol.(1996))。為此目的，我們使用Transwell多孔細胞培養插件，75mm直徑，0.4μm孔徑，聚碳酸酯膜，#3419，Coming Incorporated，Corning，NY。
將15ml含有新鮮火雞臍提取物(任選含有小雞胚胎提取物)的培養基加到37℃培養的培養物中。BDC在2天內附著到插件膜上，且在一周內鋪滿。
另一合適培養基的例子含有82％雜交瘤培養基、15％胎牛血清、1％Pen/Strep、2個火雞臍的提取物和1個小雞胚胎的提取物。
鋪滿後，每5到7天用細胞刮棒從培養插件上刮下BDC，用新鮮培養基以1∶2到1∶3的比例稀釋。各代BOC對胰蛋白酶或膠原酶處理都敏感，因此至少在原代和早期代次培養物時應避免用酶分離。
然後我們測試了培養不同時間這些細胞的EMA-1表位的表達。這些測試可以用各種標準方法完成。例如，可以從培養物中除去培養基(留下接種的培養物)。用PBS洗滌培養物3次。然後可將EMA-1抗體溶液加到培養板中。在室溫培養該系統15分鐘(或4℃培養半小時)。
然後從板中除去EMA-1溶液，用PBS洗滌3次。再加入FITC偶聯的羊抗小鼠IgM抗體，室溫培育15分鐘。用PBS洗滌3次後，在配有UV濾色鏡的顯微鏡下觀察培養板。結合的抗體是可見的並表示EMA-1表達。
B.冷凍在早期培養階段，得到的胚層細胞系不能成功地冷凍，因為細胞中有高含量的脂質顆粒。然而，在培養2個月後，我們能夠成功地冷凍、儲存然後再培養。
就冷凍而言用膠原酶分離從培養插件上取出胚層細胞，並重懸於冷凍小管中的冰凍培養基中。-70℃在泡沫聚苯乙烯盒中凍結這些小管過夜，然後短期保藏於-70℃。對長期保存而言，我們認為細胞應保存在液氮中。
我們用雜交瘤培養基50％(無小雞胚胎提取物或火雞臍提取物)和10％二甲基亞碸(DMSO，#D2650，Sigma Chemical)和40％胎牛血清作為細胞凍存培養基。經冰凍和解凍實驗，我們確定BDC培養2個月後能成功地凍存。
C.轉染然後我們用載體使我們的培養細胞重組。我們用改良的磷酸鈣沉澱方法開始轉染。用於轉染的胚層細胞已培養了2-6個月。將在20μl dH2O、120μl 2MCaCl2、860μl dH2O和1ml HBS 2x中的20μg測試質粒/載體加到Falcon12×75mm無菌聚乙烯圓底試管中(#2058，Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)。
用1ml移液管將空氣通入試管中1分鐘。室溫培育該試管30分鐘。然後將質粒溶液(2ml)加到培養板中，板中用含有2.5％FBS的M199置換培養基，並在37℃持續培養8小時。然後，棄去M199培養基，用M199培養基洗滌該板，再將初始培養基加到培養板中。此方法的一個重要方面是使胚層細胞培養物反覆轉染(無化學選擇)。這大大提高了這些脆弱細胞的存活，同時將轉染的效率提高至30％。
D.注射外源宿主的胚胎用70％乙醇消毒新生受精卵的蛋殼，用照蛋器確定此氣胞並標記。孵化18小時後，從孵卵器(Jamsway，強制通風型)取出雞蛋置於室溫中。用皮帶砂光機(3型，#7451，3」×24」皮帶，amps 5.2，皮帶FT./分鐘1200，Black Decker In.，Towson，MD 21210)在氣胞區域的蛋殼上磨出1cm直徑的孔。用平頭鑷子取出殼膜。
用約40μm孔徑的微細管針式移液管，將20μl含有10,000DiI飽和的或被轉染的BDC的培養基注射到雞胚胎的月牙區域。將DiI[DII1，1』-雙十八烷基-3，3，3』，3』-四-甲基吲哚-羰花青-高氯酸酯；diI-C18-(3)](MolecularProbes，Eugene，OR)溶解於100％DMSO中。製備2.5mg/ml原液，在培養液中稀釋至終濃度為2.5μg/ml，來染色培養板中的胚層細胞8小時(在37℃培養過程中)。除去含有DiI的培養液後，用PBS洗滌培養板5次。
需注意這種方法是用來檢測組織中被DiI染色的細胞。例如，可以從胚胎中取出7日齡的胚胎性腺，固定在4℃的4％多聚甲醛中8小時，然後在4℃ 5％蔗糖PBS中過夜，然後在30％蔗糖PBS中8小時(4℃)，再在-70℃冰凍。在5μm冷凍切片上進行螢光鏡檢。可用羅丹明濾光器或窄帶濾光器觀察DiI(R.Penza等人，13Biotechniques 580-587(1992))。
注射後，將蛋殼膜補丁(如上所述)置於氣胞的上端。待蛋殼膜乾燥後，將OpSite帶(高MVP透明敷料，#4008，Smith+Nephew，由地方藥店購得)來包紮蛋殼膜的頂部，然後將雞蛋放還到Jamesway孵卵器中繼續孵化。第19天將胚胎轉移到孵化籃中，將孵化出的小雞套上標記環、編號(dubbed)並注射SB-1/HVTMarek病疫苗(按照製造商說明)。
結果流式細胞術(FC)分析顯示在培養2周後約35-45％胚層細胞表達EMA-1表位。EMA-1陽性細胞的大小範圍為15-30μm。
培養2個月後約30％胚層細胞保持EMA-1陽性。細胞能形成胚胎幹細胞樣集落，仍表現EMA-1表位。這些集落緊密且形態一致。它們看起來是穩定的(在以下所述的培養條件下)原生殖細胞。
在培養液中不添加禽臍提取物，胚層細胞能複製1次但存活時間不超過2個星期。在培養液中補充火雞臍提取物，細胞能複製2到3次(取決於雞蛋來源的品種)。然後生長速率降低，細胞將維持休眠狀態約4星期。如果每天在培養物中加入火雞臍提取物則可以將休眠期縮短至2星期。
4星期休眠後，細胞重新複製，將它們傳代培養。在休眠復甦後，用膠原酶溶液來促進分離。培養2到6個月後，用供體細胞作細胞注射/移植。
當將大量培養的BDC從培養插件轉移到常規組織培養板上(低細胞密度103個細胞/em2)時，BDC開始分化成成纖維樣細胞、類黑色素細胞、類神經細胞和類肌肉細胞分化的細胞(可以通過形態鑑定)(沒有顯示資料)。這是多能性的表現。在本文所述培養液條件下的細胞培養插件使得BDC能從上部和下部多孔膜吸收營養，這看起來防止了自發分化過程。
當BDC從休眠回復並重新生長後，將它們傳代3次以上，與DiI-C18紅色染料一起培養，注射入18小時的胚胎中。在一實施例中，在注射後6天，取出胚胎組織並冷凍切片成5μm厚度。用螢光顯微鏡，在性腺和其它組織中檢測到有紅色染料的細胞。這表明培養的BDC能成熟或分化成性腺和各種其它胚胎組織。
在另一試驗中，通過磷酸鈣沉澱方法(無藥物篩選)，用3種質粒/載體(pGFP、pHCl或BFIV-I類)轉染培養的BDC(2個月或更長)3次(每次10天)。最後一次轉染後3天，從培養插件中取出轉染的BDC，用膠原酶溶液處理得到單細胞懸浮液。將BDC懸液重懸於含有1％小雞血清的PBS中，注射入18小時胚胎的胚月牙區域。
注射流程後孵化率為9.2％(供體細胞為0系MHC＝B21B21，受體蛋為15I5x71MHC＝B2B15)。從四周齡的子代小雞得到血液，並用流式細胞術分析。在受體B12B15血液中檢測到供體嵌合性B21B21細胞。在一些小雞中，供體細胞的百分比高達25％到33％。
另外，49隻推定的嵌合小雞血液中有7隻具有供體細胞類型的MHC抗原。在小雞的外周血液中未檢測到轉染接收者I類抗原的表達。5隻轉染小雞中有一隻血液細胞表達pHcl，約4％。一隻轉染小雞中表達12％綠螢光蛋白。所以，外來性狀可由重組細胞培養物傳遞給活的後代禽類。
可以理解本發明適用於任何類型的禽類，但看來最有商業價值的商品禽類為雞、火雞、野雞、鴨和鵝。
較佳地提取物是從胚胎禽類(尤其是胚胎火雞)臍提取出的水解成分。但也可使用從其它禽類提取的類似提取物。提取物中物質的類型很可能負責所賦予的特性，本文為蛋白質(如很可能是生長因子如細胞因子)。
據信此細胞培養物含有原生殖細胞。但它們的最佳特徵為EMA-1抗體的表達。
雖然已描述了上述優選實施例，但本領域技術人員將理解在本發明範圍內可有其它改進。所以應參照權利要求書來判斷本發明的範圍。
工業應用本發明提供了能長期培養的禽類原生殖細胞系，和維持和凍存這些細胞系的方法，這些方法所使用的材料和用這些方法產生的禽類。
權利要求
1.一種表達EMA-1表位的未分化禽胚層細胞培養物，其特徵在於，當存在禽臍分離物培養時，所述的培養物能維持其未分化的特性和其表達EMA-1表位的能力2個月以上。
2.如權利要求1所述的培養物，其特徵在於，所述的禽臍是胚胎禽臍。
3.如權利要求1所述的培養物，其特徵在於，所述的禽胚層細胞選自火雞細胞、鴨細胞、野雞細胞、鵝細胞和雞細胞。
4.如權利要求2所述的培養物，其特徵在於，當存在胚胎禽臍分離物培養時，所述的培養物能維持其未分化的特性和其表達EMA-1表位的能力6個月以上。
5.如權利要求2所述的培養物，其特徵在於，當存在火雞臍分離物培養時，所述的培養物能維持其未分化的特性和其表達EMA-1表位的能力2個月以上。
6.一種產生能表達EMA-1表位的未分化胚層細胞的持續培養物的方法，其特徵在於，所述的方法包括在形成原條前，從禽胚盤收集禽細胞；和在存在禽臍分離物時培養這些禽細胞。
7.產生如權利要求6所述的持續培養物的方法，其特徵在於，所述的禽臍是胚胎禽臍。
8.產生如權利要求6所述的持續培養物的方法，其特徵在於，所述的分離物是火雞臍提取物。
9.一種用於培養禽胚層細胞的培養基，其特徵在於，所述的培養基包含禽臍分離物、無機鹽、維生素、胺基酸和水。
10.如權利要求9所述的培養基，其特徵在於，所述的禽臍是火雞臍。
11.一種保存禽種系基因組的方法，其特徵在於，所述的方法包括凍存權利要求1所述的培養物。
12.一種從表達EMA-1表位的未分化禽胚層細胞培養物衍生的重組禽類，其特徵在於，所述的培養物含有禽臍分離物。
13.如權利要求12所述的重組禽類，其特徵在於，所述的培養物能維持其未分化的特性和表達EMA-1表位的能力2個月以上。
14.如權利要求12所述的重組禽類，其特徵在於，所述的禽臍是胚胎禽臍，重組禽類是從權利要求12所述的培養物衍生的。
15.如權利要求12所述的重組禽類，其特徵在於，所述的禽胚層細胞選自火雞細胞、鴨細胞、野雞細胞、鵝細胞和雞細胞。
16.如權利要求12所述的重組禽類，其特徵在於，所述的禽臍是火雞臍。
全文摘要
本發明公開了未分化禽原生殖細胞/胚層細胞的培養物。當存在禽臍(如火雞臍提取物)分離物下培養時,這種培養物能長時間維持它們的未分化特性和它們表達EMA－1表位的能力。還公開了用禽臍提取物培養這種培養物的方法以及含有禽臍提取物的培養基。還公開了從這些培養物衍生的重組禽類。這些培養物可以長期冰凍來保存種系基因組。
文檔編號A01K67/027GK1369006SQ00811492
公開日2002年9月11日 申請日期2000年6月15日 優先權日1999年8月11日
發明者H·察, H·D·亨特, L·D·培根, B·C·溫特沃斯, A·L·溫特沃斯 申請人:威斯康星校友研究基金會, 美國農業部