前蛋白轉化酶枯草溶菌素kexin9型的結合蛋白及其應用的製作方法

2023-09-11 14:28:55 1

本發明屬於免疫學領域，更具體地，本發明涉及前蛋白轉化酶枯草溶菌素kexin9型(proproteinconvertasesubtilisinkexintype9，pcsk9)的結合蛋白及其應用。
背景技術：
：心血管疾病是導致人類死亡的頭號殺手。低密度脂蛋白膽固醇(low-densitylipoproteincholesterol，ldl-c)已被證實是導致心血管疾病的主要因素之一。ldl-c的這種作用是相對獨立且可以有效控制的，在過去20年中，他汀(statins)類降脂藥的使用成功地減少了心血管疾病的發病率。但是他汀類藥物治療的方法卻不總是有效的，還存在著一種另外的降血脂療法的需求。一部分病人，尤其是家族性高膽固醇血症(familialhypercholesterolaemiafh)患者，往往對於他汀類的藥物很不敏感。即使使用了最高劑量的他汀類藥物，這些患者也很難達到一個較低的ldl-c水平。此外，他汀類藥物還存在著一些諸如引起肌痛及橫紋肌溶解等副作用，導致一些病人不能使用或者只能很小劑量使用他汀藥物來控制血脂水平。前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)抑制劑正是一種這樣的全新藥物類型，提供了一個全新的控制血液中ldl-c濃度的選擇。pcsk9是一種絲氨酸蛋白酶，參與調解低密度脂蛋白受體(low-densitylipoproteinreceptor，ldlr)的水平。體外實驗證實，在hepg2細胞中加入pcsk9之後，細胞表面的ldlr水平降低。小鼠實驗顯示，pcsk9蛋白水平的提高能降低肝臟中ldlr的蛋白水平，同時，相對於正常小鼠，在pcsk9敲除小鼠中ldlr水平有所提高。業已顯示pcsk9與ldlr直接結合，並與ldlr同時被吞噬，在整個內吞途徑中pcsk9與ldlr共發生免疫螢光。目前沒有pcsk9降解胞外ldlr的直接證據，其降低胞外ldlr蛋白水平的機制尚不明確。研究已證實pcsk9在調控ldl產生中起作用。pcsk9的表達或上調與增加的ldl膽固醇的血漿水平有關，pcsk9表達的抑制或缺乏與ldl膽固醇血漿水平低有關。因此，製備抑制或拮抗pcsk9活性和pcsk9在各種治療狀況下所發揮的相應作用的、基於治療的pcsk9拮抗劑尤其是特異性結合pcsk9的單克隆抗體非常重要。目前在研的pcsk9抑制劑大概包括小幹擾rna(smallinterferingrna，sirna)、反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，asos)、單克隆抗體以及一些應用新技術產生的特異性結合融合蛋白，如adnectin技術產生的融合蛋白。目前正在研究的pcsk9抑制劑主要是sirna類藥物rg7652(alnylampharmaceuticals/themedicinescompany)，adnectin技術融合蛋白bms-962476(bms)，aso類藥物aln-pcs02(iderapharmaceuticals)，抗體類藥物如bococizumab(pfizer/rinat)、lgt-209(novartis)等。但是，動物試驗或臨床研究中發現，一些pcsk9單克隆抗體類抑制劑，還存在著特異性、親和力不夠理想或存在副作用的問題，因此，本領域需要進一步優化及製備新的抗pcsk9抗體。技術實現要素：本發明的目的在於提供前蛋白轉化酶枯草溶菌素kexin9型(pcsk9)的結合蛋白及其應用。在本發明的第一方面，提供特異性結合pcsk9的結合蛋白，該結合蛋白具有輕鏈可變區和重鏈可變區，且，其重鏈可變區的cdr1的胺基酸序列如seqidno:7或seqidno:13所示的胺基酸序列；其重鏈可變區的cdr2的胺基酸序列如seqidno:8所示；其重鏈可變區的cdr3的胺基酸序列如seqidno:9或seqidno:14所示的胺基酸序列；其輕鏈可變區的cdr1的胺基酸序列如seqidno:10所示；其輕鏈可變區的cdr2的胺基酸序列如seqidno:11所示；其輕鏈可變區的cdr3的胺基酸序列如seqidno:12所示。在本發明的一個優選例中，所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白選自：(a)，其重鏈可變區的cdr1、cdr2和cdr3的胺基酸序列分別如seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9所示；其輕鏈可變區的cdr1、cdr2和cdr3的胺基酸序列如seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12所示；或(b)，其重鏈可變區的cdr1、cdr2和cdr3的胺基酸序列分別如seqidno:13、seqidno:8、seqidno:14所示；其輕鏈可變區的cdr1、cdr2和cdr3的胺基酸序列如seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12所示。在另一優選例中，所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白，其特徵在於，其重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列如seqidno:2和seqidno:4所示；或其重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列如seqidno:6和seqidno:8所示。在另一優選例中，所述的結合蛋白是fab、f(ab』)、f(ab』)2、fv、dab、fd、互補決定區(cdr)片段、單鏈抗體(scfv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體。在另一優選例中，所述的結合蛋白是單克隆抗體。在另一優選例中，所述的結合蛋白的重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有seqidno:2和seqidno:4所示的胺基酸序列，或分別具有seqidno:6和seqidno:8所示的胺基酸序列，其重鏈恆定區選擇下組中重鏈類型之一的恆定區：iggl、igg2a、igg2b和igg3，和其輕鏈恆定區選擇下組輕鏈類型的恆定區之一：κ鏈和λ鏈；在本發明的另一方面，提供編碼所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白的核酸。在本發明的另一方面，提供一種表達載體，其包含所述的核酸。在本發明的另一方面，提供一種宿主細胞，其包含所述的表達載體或基因組中整合有所述的核酸。在本發明的另一方面，提供所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白在製備用於診斷、治療和/或預防pcsk9表達或活性失調相關疾病的藥物中的用途。在一個優選例中，所述的pcsk9表達或活性失調相關疾病包括但不限於：高血清膽固醇水平相關的病症；較佳地，包括：高膽固醇血症，冠心病，代謝症候群，急性冠狀動脈綜合症。在本發明的另一方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有：有效量的所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白；和藥學上可接受的載體。在本發明的另一方面，提供一種用於治療和/或預防pcsk9表達或活性失調相關疾病的藥盒，該藥盒中包括：所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白；或所述的藥物組合物。在本發明的另一方面，提供一種免疫輟合物，所述的免疫輟合物包括：所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白；以及可檢測標記物；較佳地，所述可檢測標記物包括：螢光標記物、顯色標記物。在本發明的另一方面，提供一種用於檢測pcsk9水平的檢測試劑盒，該檢測試劑盒中包括：所述的特異性結合pcsk9的結合蛋白；或所述的免疫輟合物。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1、單克隆抗體b9287、b9288分別對於人pcsk9抗原、小鼠pcsk9抗原、食蟹獼猴pcsk9抗原的動力學分析結果。圖2、本發明的抗原結合蛋白降低細胞吸收ldl的能力測定。圖3、抗pcsk9優選抗體對高脂血症恆河猴血清ldl水平的反應。每組各有4隻年齡>7歲的公及母恆河猴，於第0天經皮下注射以給予所示劑量的pcsk9優選抗體或相等體積的鹽水載體。在所示時間點採集血漿樣本及測量血漿ldl量與第0天的血清ldl量相比較。具體實施方式本發明人經過廣泛而深入的研究，獲得一種含有獨特的互補決定區(cdr區)的特異性結合前蛋白轉化酶枯草溶菌素kexin9型(proproteinconvertasesubtilisinkexintype9，pcsk9)的結合蛋白，其能與pcsk9特異性結合併有效抑制pcsk9的功能、降低血漿中ldl膽固醇水平，可以應用於治療與pcsk9功能相關或者是受到pcsk9功能影響的疾病。結合蛋白本發明提供了能特異性結合pcsk9的結合蛋白。本發明的結合蛋白可以是完整的免疫球蛋白分子，也可以是抗原結合片段，包括但不限於fab片段，fd片段，fv片段，f(ab』)2片段、互補決定區(cdr)片段、單鏈抗體(scfv)、結構域抗體，二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體等。cdr區是免疫學感興趣的蛋白質的序列。在本發明的實施方案中，結合蛋白可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六個cdr區。優選地，本發明的結合蛋白包含本文揭示的至少兩個cdr。本發明的另一方面包括本文所述結合蛋白的功能變體。如果變體能與親代結合蛋白競爭特異性結合pcsk9，則認為該變體分子是本發明結合蛋白的功能變體。換句話說，所述功能變體仍能結合pcsk9或其片段。功能變體包括但不限於一級結構序列基本相似、但是含有例如在親代結合蛋白中未發現的體外或體內化學和/或生物化學修飾的衍生物。這種修飾包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共價附著、脂質或者脂質衍生物的共價附著、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。換句話說，親代結合蛋白的胺基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述胺基酸序列的所述結合蛋白的結合特性，即所述結合蛋白仍能識別並結合其靶位。所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和胺基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領域己知的標準技術導入，例如定向誘變和隨機pcr介導的誘變，並且可包含天然以及非天然核苷酸和胺基酸。保守胺基酸取代包括其中胺基酸殘基由具有相似結構或者化學性質的另一胺基酸殘基置換的取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族己經在本領域中限定。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、無電荷極性側鏈胺基酸(例如天冬酞胺、穀氨酞胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈胺基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支側鏈胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側鏈胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領域技術人員明白也可以使用除了上述家族之外的其它胺基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的胺基酸取代，例如胺基酸由具有不同結構或者化學性質的另一胺基酸殘基置換。相似的小變異也可包括胺基酸缺失或者插入，或者這二者。使用本領域熟知的電腦程式可以發現確定哪些胺基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學活性的指導。功能變體可包含胺基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者這兩端的截短體。本發明的功能變體與親代結合蛋白相比可具有相同或不同的、更高或更低的結合親和性，但是仍能結合pcsk9或其片段。例如，本發明的功能變體與親代結合蛋白相比對於pcsk9或其片段可具有增加或降低(優選增加)的結合親和性。優選地，可變區包括但不限於構架區、高變區或cdr區的胺基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區包含三個高變區，包括三個cdr，以及更保守的區域，即所謂的構架區((fr)。高變區包含來自cdr的胺基酸殘基和來自高變環的胺基酸殘基。在本發明範圍內的功能變體與本文所述親代結合蛋白具有至少大約50％至大約99％、優選至少大約60％至大約99％、更優選至少大約70％至大約99％、甚至更優選至少大約80％至大約99％、最優選至少大約90％至大約99％、特別是至少大約95％至大約99％，以及特別是至少大約97％至大約99％的胺基酸序列同源性。本領域技術人員已知的計算機算法如gap或者bestfit可用於最佳地排列胺基酸序列以進行對比以及明確相似或相同的胺基酸殘基。功能變體可以通過使用本領域己知的普通分子生物學方法改變親代結合蛋白或其一部分而獲得，所述方法包括但不限於易錯pcr、寡核苷酸指導的誘變、定點誘變以及重鏈和/或輕鏈改組法。作為本發明的優選方式，所述的結合蛋白是單克隆抗體。抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為互補決定區(cdr)，所述的cdr區將可變區間隔成4個框架區域(fr)，4個fr的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些cdr形成環狀結構，通過其間的fr形成的β摺疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的cdr和相應輕鏈上的cdr構成了抗體的抗原結合位點。本發明的抗pcsk9單克隆抗體的cdr區是全新的，不同於現有的抗pcsk9抗體。本發明的單克隆抗體是全人源的，具有免疫原性低、安全性高的特點。本發明另一方面提供了編碼本發明的至少一種結合蛋白、其功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。這種核酸分子可以用作中間物以進行克隆，例如用於如上述的親和力成熟方法中。在一個優選的實施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。dna分子的序列可以用常規技術，或利用雜交瘤技術獲得。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明的結合蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然後可將該dna序列引入本領域中已知的各種現有的dna分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明的結合蛋白的序列中。本發明還涉及包含上述的適當dna序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。優選的，本發明的載體是例如含病毒啟動子的質粒表達載體，且在所述表達載體中分別插入了抗pcsk9單克隆抗體重鏈可變區(vh)與恆定區的igg2(來自人源igg2的恆定區)融合序列和輕鏈可變區vl與人體iglambda(來自人源iglambda的恆定區)融合序列。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：細菌細胞如大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅s2或sf9；動物細胞如cho、cos7、nso或bowes黑素瘤細胞等。特別適用於本發明的宿主細胞是真核宿主細胞，尤其是哺乳動物細胞，如cho細胞、293細胞。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的結合蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於：常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。藥物組合物本發明的結合分子可用於製備診斷、治療和/或預防pcsk9表達或活性失調相關疾病的藥物組合物。所述的「pcsk9表達或活性失調相關疾病」包括高血清膽固醇水平相關的病症。較佳地，所述的「pcsk9表達或活性失調相關疾病」包括但不限於高膽固醇血症、冠心病、代謝症候群、急性冠狀動脈綜合症以及相關病症。所述pcsk9功能指需要pcsk9參與或者被pcsk9加劇或增強的任何活性及功能。所述pcsk9單抗還可在檢測和定量pcsk9，以用於各種診斷目的。基於本發明的新發現，還提供了一種可診斷、治療和/或預防pcsk9表達或活性失調相關疾病的藥物組合物，其包含：有效量的本發明所述的結合分子；以及藥學上可接受的載體。本文所用的術語「藥學上可接受的」是指當分子本體和組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生不利的、過敏的或其它不良反應。本文所用的「藥學上可接受的載體」應當與本發明的結合分子相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低組合物的效果。可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和土豆澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如潤溼劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩衝液等。本發明的藥物組合物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以採用注射或其它治療方式。本發明的結合分子可以以未分離的或者分離的形式使用。此外，本發明的結合分子可以單獨應用或者於包含至少一種本發明的結合分子(或其變體或片段)的混合物中應用。換句話說，所述結合分子可以組合應用，例如作為包含兩或更多種本發明的結合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的結合分子可以組合在一個治療方案中以達到希望的預防、治療或診斷作用，但是或者也可以將具有相同活性的結合分子組合在一個治療方案中以達到希望的預防、治療或診斷作用。本發明的結合分子或藥物組合在用於人體之前可以在合適的動物模型系統中檢測。這種動物模型系統包括但不限於小鼠、猴。本發明的結合分子的合適的劑量範圍可例如是0.001-100mg/kg體重，優選0.01-15mg/kg體重。此外，例如可以給予一次推注、隨時間給予多次分開劑量或者根據治療情況的緊急性而可以按比例降低或增加劑量。本發明的分子和組合物優選是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法為本領域所熟知。用於診斷、預防和/或治療的其它分子可以以與本發明的結合分子相似的給藥方案給予。如果單獨給予其它分子，則可以在給予本發明的一或多種結合分子或藥物組合物之前、同時或者之後給予患者。對於人患者的精確給藥方案通常在臨床實驗期間挑選出。本發明所述的結合分子可被置於適當的包裝中，製成藥盒，以便於臨床醫師使用。較佳地，所述的藥盒中也可包含說明如何給藥的使用說明書。本發明還包括降低血清膽固醇水平、治療或預防患者中與高血清膽固醇水平相關的疾病的方法，所述方法包括給予患者有效量的本發明的至少一種單克隆抗體。較佳地，可以將本發明的單克隆抗體與提高ldlr蛋白的利用率的藥劑聯合給藥。所述的提高ldlr蛋白的利用率的藥劑包括：阿託伐他汀，西立伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，羅蘇伐他汀，辛伐他汀，也可以選用兩種以上所述的提高ldlr蛋白的利用率的藥劑。免疫綴合物另一方面，本發明包括免疫綴合物，即包含本文所述至少一個結合蛋白以及進一步包含至少一個功能性分子(如可檢測的部分/物質的分子)。所述抗體與所述功能性分子可以通過共價連接、偶聯、附著、交聯等方式構成輟合物。本發明的免疫綴合物可包含一個以上的標記。所述標記也可以通過共價鍵與本發明的結合蛋白直接結合/綴合。或者，所述標記可以通過一或多種連接化合物與所述結合蛋白結合/綴合。標記與結合蛋白的綴合技術為本領域技術人員所熟知。本發明的免疫綴合物的標記也可以是治療劑。所述免疫綴合物可包含：本發明的抗體以及可檢測標記物。所述的可檢測標記物包括但不限於：螢光標記物、顯色標記物；如：酶、輔基、螢光材料、發光材料，生物發光材料、放射性材料、正電子發射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。也可包含一個以上的標記物。為了檢測和/或分析和/或診斷目的用於標記抗體的標記依賴於使用的特定檢測/分析/診斷技術和/或方法例如免疫組織化學染色(組織)樣品、流式細胞計量術等。對於本領域已知的檢測/分析/診斷技術和/或方法合適的標記為本領域技術人員所熟知。此外，本發明的人結合蛋白或者免疫綴合物也可以附著於固體支持物上，其特別用於pcsk9蛋白或其片段的體外免疫測定或者純化。這種固體支持物可以是多孔或者無孔的、平面或非平面的。本發明的結合蛋白可以與標記序列融合以便於純化。所述標記序列的例子包括但不限於六組氨酸標記、血凝素(ha)標記、myc標記或者flag標記。或者，一種抗體可以與另一種抗體綴合形成抗體異源綴合物(heteroconjugate)。檢測試劑和試劑盒以本發明所述的結合分子為基礎，可製備方便、快速且準確地檢測待測樣品中pcsk9水平的試劑或試劑盒。如本文所用，術語「待測樣品」涵蓋了多種樣品類型，包括生物學來源的血液及其它體液樣品，實體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養物，或者衍生自其中的細胞或者其後代。該術語還包括在獲得後已經通過任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或者富集某些成分如蛋白質或者多核苷酸。因此，本發明提供了一種用於檢測待測樣品中pcsk9水平的檢測試劑盒，該試劑盒中含有本發明的pcsk9結合分子，或pcsk9結合分子與可檢測標記物構成的免疫綴合物。在獲得了本發明提供的pcsk9結合分子後，可以方便地製備出用於特異性檢測pcsk9水平的檢測試劑盒。為了在檢測時更方便，所述試劑盒中除了含有本發明的結合分子或含有pcsk9結合分子與可檢測標記物構成的免疫綴合物以外，還可以包含其它檢測試劑或輔助試劑，所述的輔助試劑例如是elisa試劑盒中常規使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配製方法均是本領域技術人員所熟知的，如顯色劑、標記物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領域人員應理解，各種變化形式的檢測試劑盒均是包含在本發明中的，只要在其中利用了本發明的結合分子作為識別pcsk9的試劑。此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用於說明其中裝載的試劑的使用方法。在獲得了本發明提供的結合分子和/或試劑盒後，可以利用多種免疫學相關方法來檢測樣品中pcsk9或其含量，從而得知待測樣品的供體是否存在pcsk9表達或活性失調相關疾病。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1、pcsk9單克隆抗體的優化與篩選為了找尋符合要求的pcsk9抗體，本發明人經過大量的研究和篩選，從全人源噬菌體庫中獲得了兩株性能優異的單克隆抗體。它們的可變結構域的核酸序列及胺基酸序列描述如下：1、單克隆抗體重鏈可變區核苷酸序列如seqidno:1。重鏈可變區胺基酸序列如seqidno:2。重鏈的各cdr區胺基酸序列：hcdr1：aftfdsfgmh(seqidno:7)；hcdr2：llwsdgsdeyyadsakg(seqidno:8)；hcdr3：avgaiyqfyamdv(seqidno:9)。重鏈各cdr區的核苷酸序列：hcdr1：gcctccgccttcaccttcgacagcttcggcatgcac(seqidno:15)；hcdr2：ctgctttggagcgacggctccgacgagtactacgccgactccgctaagggc(seqidno:16)；hcdr3：gcggtgggcgccatctaccagttctacgccatggacgtg(seqidno:17)。輕鏈核苷酸序列如seqidno:3。輕鏈胺基酸序列如seqidno:4。輕鏈的各cdr區胺基酸序列：lcdr1：tgtssnignqfvs(seqidno:10)；lcdr2：eynkrps(seqidno:11)；lcdr3：gswdsslsgyv(seqidno:12)。輕鏈的各cdr區核苷酸序列：lcdr1：accggcacctcctccaacatcggcaaccaattcgtgtcc(seqidno:18)；lcdr2：gagtacaacaagcggccctcc(seqidno:19)；lcdr3：ggctcctgggactcttccctgtccggctatgtg(seqidno:20)。2、單克隆抗體b9288重鏈核苷酸序列如seqidno:5。重鏈胺基酸序列如seqidno:6。重鏈的各cdr區胺基酸序列：hcdr1：asaftfdsfgmh(seqidno:13)；hcdr2：llwsdgsdeyyadsakg(seqidno:8)；hcdr3：avgsiyyyyamdv(seqidno:14)。重鏈的各cdr區核苷酸序列：hcdr1：gcctccgccttcaccttcgacagcttcggcatgcac(seqidno:21)；hcdr2：ctgctttggagcgacggctccgacgagtactacgccgactccgctaagggc(seqidno:22)；hcdr3：gcggtgggctccatctactactactacgccatggacgtg(seqidno:23)。單克隆抗體b9288輕鏈核苷酸和胺基酸序列同b9287的輕鏈核苷酸和胺基酸序列，其相應的各cdr區也同b9287。實施例2、由轉染的細胞製備pcsk9單克隆抗體將前述單克隆抗體b9287的重鏈核苷酸序列兩端加上hindiii/noti位點，插入到pcdna3.1+質粒的相應位點中；將前述單克隆抗體b9287的輕鏈核苷酸序列兩端加上hindiii/noti位點，插入到pcdna3.1+質粒的相應位點中。獲得表達所述單克隆抗體b9287的重組質粒。將前述單克隆抗體b9288的重鏈核苷酸序列兩端加上hindiii/noti位點，插入到pcdna3.1+質粒的相應位點中；將前述單克隆抗體b9288的輕鏈核苷酸序列兩端加上hindiii/noti位點，插入到pcdna3.1+質粒的相應位點中。獲得表達所述單克隆抗體b9288的重組質粒。將上述重組質粒用脂質體法瞬時轉染懸浮hek293細胞。在expi293expression培養基中，37℃，co28％，120rpm轉速條件下培養前述獲得的轉染細胞。經過大量培養的轉染細胞，通過二級離心處理(第一級離心條件10min，1000g；第二級離心條件30min，10000g)，去除細胞和細胞碎片，得到上清液。將澄清的上清液裝載入proteina親和層析柱，通過用三步淋洗(淋洗緩衝液依次為pb150mmnaclph6.5；20mmna-citrate1mnaclph5.5；20mmna-citrateph5.5)來去除雜質，然後通過ph線性洗脫方式(起始緩衝液a：20mmna-citrateph5.5；目標緩衝液b：20mmna-citrateph3.0)來分離捕獲目標抗體。最後通過超濾濃縮步驟將目標抗體置換至200mmhepe，100mmnacl，50mmnaoacph7.0緩衝液中。實施例3、pcsk9單克隆抗體的生物分析表徵1、毛細管電泳(ce-sds)通過labchipgxii系統進行毛細管電泳分析抗體。結果表明，在還原和非還原條件下，本發明的pcsk9單克隆抗體樣品的峰純度百分比和分子量如表1(非還原條件)和表2(還原條件)所示。表1表22、分子篩液相色譜(se-hplc)單克隆抗體通過0.2μm過濾器過濾(thomson，目錄號25535-100)，然後加載到mabpacsec-1柱(thermo，目錄編號07469620)。流動相緩衝為50mm磷酸鈉，300mm氯化鈉，ph6.2，流速為0.2ml/min。峰值計算使用chemstation軟體進行整合。本發明的pcsk9單克隆抗體的主峰和聚體峰的百分比如表3所示。表3id#主峰純度％聚體純度％b9287>99.9％99.9％<0.01％3、差示掃描量熱法評價蛋白質的穩定性差示掃描量熱法(dsc)是一種在需要增加樣本和參考溫度的熱量差異作為溫度的函數的測量技術。差示掃描量熱法可用於測量多個蛋白質的特性，包括50％蛋白質變性(tm)時的溫度/熔化溫度，這是評價蛋白質的穩定性的一種方法。被檢測抗體以1mg/ml的濃度被裝入nanodsc樣品室，從25℃到100℃以1℃/min的速度升溫進行。樣品檢測前預先掃描了15分鐘以確保實施之前有個準確的起始溫度。樣品數據中減去了只有緩衝液的樣品數值；使用nanodsc軟體來計算tm。結果見表4。表4id#tm(℃)b928763℃，74℃b928861℃，73℃實施例4、抗體與pcsk9結合的表徵pcsk9單抗與人、小鼠或食蟹獼猴pcsk9相結合的能力採用octetred96系統(fortebio)來進行表徵。抗人iggfc(ahc)的動力學級生物傳感器(fortebio，#18-5063)在ph1.7的甘氨酸預處理後浸泡在測定緩衝液中。被檢測pcsk9單克隆抗體以10μg/ml的濃度被固定到ahc生物傳感器120秒。加載了pcsk9單克隆抗體的ahc生物傳感器然後被浸入到不同濃度的人pcsk9抗原(genebankax127530.1)、小鼠pcsk9抗原(ncbinm_153565.2)或食蟹獼猴pcsk9抗原(ncbinm_001112660.1)和緩衝液中。分析物柱的最後稀釋點只包含檢測緩衝液，以測試緩衝液與負載生物傳感器之間的非特異性結合。從80到120秒檢測到了抗原與抗體結合，隨後120到180秒發生解離。用檢測緩衝液確定了60秒的基線。抗pcsk9的單克隆抗體的親和力曲線是以一個1:1結合的動力學傳感單價結合模型擬合的。動力學分析如圖1和表5所示。表5上樣id樣品idkd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullx^2fullr^2b9287hupcsk9<1.0e-123.09e+05<1.0e-070.04440.9989b9288hupcsk9<1.0e-122.52e+05<1.0e-070.0160.9995b9287cynopcsk92.9e-112.48e+057.21e-060.01020.9995b9288cynopcsk94.1e-102.51e+051.03e-040.01260.999b9287mspcsk99.80e-092.70e+052.70e-030.03080.9994b9288mspcsk96.60e-091.40e+059.20e-040.01230.9994實施例5、細胞ldl吸收測定將人hepg2細胞以每孔5×104個細胞的濃度鋪在黑色透明的96-孔板(costar)中的補充有10％fbs的dmem培養基(mediatech，inc)中，並於37℃(5％co2)過夜孵育。為了形成pcsk9和抗體複合體，讓20μg/ml的人pcsk9與用吸收緩衝液(含10％fbs的dmem)稀釋的各種濃度的抗體或單用緩衝液(對照)在室溫下孵育1小時。去除細胞上清後加入pcsk9/抗體混合物，接著加入以8μg/ml最終濃度稀釋在吸收緩衝液中的dil-ldl(invitrogen)。在37℃(5％co2)孵育16-18小時後，用pbs徹底洗滌細胞，通過tecanm1000554nm(激發)和571nm(發射)檢測細胞螢光信號。細胞吸收測定結果示於圖2中。概括地說，測定了pcsk9單克隆抗體的ic50值，具體來說數值為3.94nm(b9287)和1.46nm(b9288)pm(圖2)。上述結果說明，本發明的抗原結合蛋白具有優異的降低細胞吸收ldl的能力。實施例6、恆河猴體內pcsk9單抗對於血液中ldl水平的影響在高脂血症恆河猴中測試pcsk9單克隆抗體b9287降低非靈長類動物疾病模型體內血清ldl的效果。4隻7歲以上具有高脂血症的恆河猴於第0天經單次皮下注射方式注射載體(pbs+0.01％tween20)或以3mg/kg劑量的pcsk9單克隆抗體b9287。分別於第0、1、3、5、7、9、11、14天隔夜禁食後分析血清ldl含量。結果如圖3。單次注射3mg/kgpcsk9單克隆抗體b9287在所有4隻動物中產生血清ldl(50％及以上)的大幅降低。同樣地，本發明人也在高脂血症恆河猴中測試pcsk9單克隆抗體b9288降低體內血清ldl的效果。結果也證明pcsk9單克隆抗體b9288能夠顯著降低恆河猴中血清ldl水平。因此，pcsk9抗體降低非人靈長動物疾病模型的血清ldl水平。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。當前第1頁12