一種含HIhh的逆轉錄病毒載體和病毒顆粒及其應用的製作方法

2023-09-11 19:06:05

專利名稱：：一種含HIhh的逆轉錄病毒載體和病毒顆粒及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於治療骨缺陷的逆轉錄病毒載體和病毒顆粒及其應用，具體地說，是一種含HIhh的逆轉錄病毒載體和病毒顆粒及其應用。
背景技術：
：目前，骨缺損的治療是困擾骨科臨床的難點，而傳統的治療方法極為困難。骨組織工程作為醫學組織工程的重要組成部分，為骨組織的再生與修復提供了突破點，在治療骨缺陷方面具有很大的發展潛力。種子細胞、細胞載體支架及組織構建的理論和技術路線是骨組織工程程研究的三大要素。近年來的研究證實，骨生成和形態發生的影響因子對組織工程骨的構建起著關鍵作用，其中，影響骨再生成功與否的決定因素之一是移植物的再血管化。研究中發現，hdianHedgehogGhh)信號通路不僅參與調節骨的生長發育及骨量平衡，還參與血管形成。Ihh基因對軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞均起調節作用，並且對骨組織血管的生成及維持有重要意義。在骨發育方面，Ihh信號通路主要參與促進骨髓間充質幹細胞(MSCs細胞)向成骨細胞和軟骨細胞分化，阻止其向脂肪細胞分化，例如，Ihh基因參與抑制軟骨細胞向肥大的軟骨細胞轉化。Vortkamp等通過敲除大鼠骺生長板甲狀旁腺激素相關肽(ParathyroidHormoneRelatedρ印tide，PTHrP)合成基因來研究Ihh基因與PTHrP基因在調節軟骨細胞分化方面的關係，發現這兩者組成了負反饋調節環。但是Mak等通過進一步研究發現單獨的Ihh可以促進軟骨肥大而並不依賴於PTHrP，而骨形成蛋白(Bonemorphogeneticprotein，BMP)和Wnt/β-catenin可能具有參與上調Ihh信號的功能。另外也有研究表明在關節周圍Ihh可不依賴PTHrP而刺激軟骨細胞早期分化。這就表明Ihh既可以單獨作用於軟骨分化，又可以協同PTHrP形成負反饋軸機制，從而維持骨的穩定生長。Ihh促進血管形成的整個過程，包括血管生長、血管成熟。目前，研究的比較透徹的是Shh信號，其在動物缺血模型中可上調血管生長因子如VEGF、BMP4、血管形成素等的表達。同時，Ihh信號在血管系統發生過程也有影響，研究證明Ihh缺失會導致血島無法形成，原始的毛細血管網形成障礙，若Ihh突變也會影響血島與原始的毛細血管網的正常生長發育。這就表明Ihh在調控血管形成中發揮重要的作用。鑑於體外培養的骨組織能否適應體內複雜的微環境很大程度上依賴於骨發育中的信號因子的調控，同時影響骨再生成功與否的決定因素之一是移植物的再血管化，因而，誘導種子細胞表達Ihh信號蛋白，並且正確調控Ihh信號就成為了組織工程骨成功構建的重要前提。目前，逆轉錄病毒載體因具有運用範圍廣泛，高效穩定表達外源基因，轉染效率高及可攜帶較大的目的基因等優點，成為基因轉導的重要工具。因此，可以構建含有HIhh(Humanindianhedgehog)基因的逆轉錄病毒載體，通過該載體介導HIhh基因轉移進人骨細胞，調控Ihh信號通路，為骨組織工程解決早期血管化問題提供了一種新方法，為治療骨缺陷疾病提供了一種新途徑。專利文獻CN1656223A，公開日2005年8月17日，公開了一種通過基因治療的骨生成方法，該發明揭示了一種在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，包括將編碼具有骨再生功能蛋白質的基因插入結締組織細胞，操作性連接於啟動子，並將哺乳動物細胞移植入骨缺陷部位，從而使骨缺陷部位形成骨。但是，哺乳動物細胞的移植必將面臨移植物的再血管化，如果移植物不能很好地再血管化，則不能和原有骨形成統一的整體，導致骨缺陷治療的失敗。因此，有必要從Ihh信號通路的調控入手，克服影響骨再生成功的關鍵難點。目前，關於通過逆轉錄病毒載體調控Ihh的表達來治療骨缺陷疾病還未見報導。
發明內容本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種含HIhh的重組載體。本發明的第二個目的是，提供一種含HIhh的逆轉錄病毒載體。本發明的第三個目的是，提供一種含HIhh的逆轉錄病毒顆粒。本發明的第四個目的是，提供一種含HIhh的逆轉錄病毒載體的用途。本發明的第五個目的是，提供一種含HIhh的逆轉錄病毒顆粒的用途。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是含HIhh的重組載體，它是由以下方法構建的=HindIII與EcoRV酶切質粒pIND-HIhh-flag-two回收Mhh-flag-two片段，所述Mhh-flag-two片段的粘性末端用Klenow酶補平並用鹼性磷酸酶脫磷酸化，EcoRV酶切質粒pCIG-IRES-EGFP回收大片段，並與Hlhh-flag-two片段連接，轉化，酶切鑑定，獲得正確連接的質粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP。所述的鹼性磷酸酶是CLAP酶。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是含HIhh的逆轉錄病毒載體，它是由以下方法構建的將BioI與NotI雙酶切重組載體pCIG-Mhh-IRES-EGFP獲得的含HIhh片段，與BioI與NotI雙酶切逆轉錄病毒載體psre獲得的大片段連接，經轉化，酶切鑑定，測序，獲得含HIhh的逆轉錄病毒載體pSFG-HIhh-IRES-EGFP。為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是含HIhh的逆轉錄病毒顆粒，它是由含HIhh的逆轉錄病毒載體轉染包裝細胞系得到的。所述的包裝細胞系是^3GPG。為實現上述第四個目的，本發明採取的技術方案是含HIhh的逆轉錄病毒載體在製備治療骨缺陷藥物中的應用。所述的骨缺陷為骨折、斷裂和/或骨的退變。為實現上述第五個目的，本發明採取的技術方案是含HIhh的逆轉錄病毒顆粒在製備治療骨缺陷藥物中的應用。所述的骨缺陷為骨折、斷裂和/或骨的退變。本發明優點在於1、本發明的含HIhh的逆轉錄病毒載體將有助於研究Ihh信號通路與骨發育的分子作用機制，為骨組織工程解決早期血管化問題提供了一種新方法，為治療骨缺陷疾病提供了一種新途徑。2、本發明所使用的逆轉錄病毒載體pSR；為自體去活載體，即該病毒基因組整合到細胞基因組後，不會產生新的子代病毒，也降低了對周圍基因的意外激活，因此在用於骨疾病治療方面，具有較強的安全性。3、本發明採用的標記基因為增強型綠色螢光蛋白基因(EGFP)。EGFP因其不用加任何底物，螢光性質穩定，分子量小，對細胞無毒性，使用方便，可進行活細胞實時定位觀察等優點在基因治療、基因轉導等方面已得到廣泛應用，是一種很有價值的報告基因。因此，藉助標記基因EGFP，可在體內和/或體外對已導入載體的靶細胞進行示蹤、富集，更便於對Ihh信號通路與骨發育的分子作用機制的研究。附圖1是載體pCIG-IRES-EGFP的物理圖譜。附圖2是逆轉錄病毒載體psre的物理圖譜。附圖3是質粒載體pIND-Mhh-flag-two的物理圖譜。附圖4是含HIhh的重組載體pCIG-HIhh-IRES-EGFP的構建示意圖。附圖5是陽性克隆pCIG-HIhh-IRES-EGFP的酶切驗證圖譜。附圖6是陽性克隆pCIG-HIhh-IRES-EGFP的測序圖。附圖7是含HIhh的逆轉錄病毒載體pSre-Mhh-IRES-EGFP的構建示意圖。附圖8是陽性克隆pSre-Mhh-IRES-EGFP的酶切驗證圖譜。附圖9是^3GPG細胞培養5天後的形態圖(400X)。附圖10是pSFG-HIhh-IRES-EGFP轉染^3GPG細胞圖(48h，100X)。附圖11是穩定轉染的293GPG細胞圖。附圖12是病毒感染C3H10T1/2細胞圖。附圖13是恥8{6111blot檢測Ihh蛋白的表達圖。附圖14是HIhh誘導C3H10T1/2細胞骨活性及血管形成的檢測圖。附圖15是鹼性磷酸酶(ALP)染色檢測圖(40X)。附圖16是茜素紅(Alizarinred)染色檢測圖(40X)。具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。以下實施例使用的實驗材料如下1菌株、細胞和質粒載體大腸桿菌DH5ci購於上海生工生物有限公司。病毒包裝細胞系293GPG按照參考文獻DanielS.Ory,BeverlyΑ.Neugeboren,andRichardC.Mulligan.Astablehuman-derivedpackagingcelllineforproductionofhightiterretrovirus/vesicularstomatitisvirusGpseudotypes[J],Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93:11400-11406製備。質粒載體pCIG購於ATCC公司，載體pCIG_IRES_EGFP(物理圖譜如圖1所示)按照參考文獻:SeanG.MegasonandAndrewP.McMahon.AmitogengradientofdorsalmidlineWntsorganizesgrowthintheCNS[J],Development,2002，129:2087—2098製備。逆轉錄病毒載體MFG購於ATCC公司，逆轉錄病毒載體pSTO(物理圖譜如圖2所不)按照參考文獻:DanielS.Ory,BeverlyA.Neugeboren,andRichardC.Mulligan.Astablehuman-derivedpackagingcelllineforproductionofhightiterretrovirus/vesicularstomatitisvirusGpseudotypes[J]·Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93:11400-11406製備。質粒載體pIND購於hvitrogen公司，質粒載體pIND-HIhh-flag-two(物理圖譜如圖3所示)由載體pIND構建得到，Mhh-flag-two片段的鹼基序列如SEQIDN0.1，該片段中包含Ι-flag片段(SEQIDN0.2)和2-flag片段(SEQIDN0.3)。C3H10T1/2細胞購於Promega公司。2、主要試劑和培養基LB培養基、氨苄青黴素(Ampicillin，Amp)購於上海生工生物有限公司；瓊脂糖凝膠/PCR產物回收試劑盒、質粒小量DNA抽提試劑盒購於Biomiga公司；質粒大量DNA抽提試劑盒、PCR擴增試劑盒購於天根生化科技有限公司；限制性內切酶購於TaKaRa公司；T4DNA連接酶購於英國NewEnglandBiolabs公司；瓊脂糖購於!Iomega公司；溴化乙錠購於Sigma公司；0.05%胰蛋白酶、磷酸鹽緩衝液(PBS)購於美國Hyclone公司；乙醇(分析純)購於上海凌峰化學試劑有限公司；二甲亞碸DMS0、聚凝胺試劑(Polybrene試劑)購於美國Sigma公司；FuGENEHDTransfectionReagent購於Roche公司；一抗flag的單克隆抗體購於Stratagen公司；二抗HRP標記的鼠抗羊IgG購於Sigma公司。293GPG細胞培養基權利要求1.一種含HIhh的重組載體，其特徵在於，它是由以下方法構建的=HindIII與EcoRV酶切質粒pIND-mhh-flag-two回收Mhh-flag-two片段，所述Hlhh-flag-two片段的粘性末端用Klenow酶補平並用鹼性磷酸酶脫磷酸化，EcoRV酶切質粒pCIG-IRES-EGFP回收大片段，並與mhh-flag-two片段連接，轉化，酶切鑑定，獲得正確連接的質粒pCIG-HIhh-IRES-EGFP。2.根據權利要求1所述的含HIhh的重組載體，其特徵在於，所述的鹼性磷酸酶是CLAP酶。3.—種含HIhh的逆轉錄病毒載體，其特徵在於，它是由以下方法構建的將BioI與NotI雙酶切權利要求1所述的重組載體pCIG-Mhh-IRES-EGFP獲得的含HIhh片段，與BioI與Noti雙酶切逆轉錄病毒載體psre獲得的大片段連接，經轉化，酶切鑑定，測序，獲得含HIhh的逆轉錄病毒載體pSFG-Mhh-IRES-EGFP。4.一種含HIhh的逆轉錄病毒顆粒，其特徵在於，它是由如權利要求3所述的逆轉錄病毒載體轉染包裝細胞系得到的。5.根據權利要求4所述的逆轉錄病毒顆粒，其特徵在於，所述的包裝細胞系是^3GPG。6.根據權利要求3所述的逆轉錄病毒載體在製備治療骨缺陷藥物中的應用。7.根據權利要求4所述的逆轉錄病毒顆粒在製備治療骨缺陷藥物中的應用。8.根據權利6或7所述的應用，其特徵在於，所述的骨缺陷為骨折、斷裂和/或骨的退變。全文摘要本發明公開了一種含HIhh的逆轉錄病毒載體和病毒顆粒及其應用。所述的含HIhh的逆轉錄病毒載體是將XhoI與NotI雙酶切重組載體pCIG-HIhh-IRES-EGFP獲得的含HIhh片段，與XhoI與NotI雙酶切逆轉錄病毒載體pSFG獲得的大片段連接，經轉化，酶切鑑定，測序製備得到的，所述的含HIhh的逆轉錄病毒顆粒是通過含HIhh的逆轉錄病毒載體轉染包裝細胞系293GPG製備的。本發明還涉及上述逆轉錄病毒載體和逆轉錄病毒顆粒在製備治療骨缺陷藥物中的應用。本發明的優點在於為骨組織工程解決早期血管化問題提供了一種新方法，為治療骨缺陷疾病提供了一種新途徑。文檔編號C12N15/867GK102337285SQ20111032693公開日2012年2月1日申請日期2011年10月25日優先權日2011年10月25日發明者張玲玲,李錚,胡洪亮,鄒沙沙,郭熙志,陳婷婷,馬鋼,黃翼然申請人:上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院