一株高產電的希瓦氏菌及其應用的製作方法

2023-08-13 17:06:51 2

一株高產電的希瓦氏菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株高產電的希瓦氏菌，其分類命名為希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)，已保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC No：M2014340，保藏日期為2014年7月16日。本發明還公開了上述高產電的希瓦氏菌在產電中的應用。本發明為提高希瓦氏菌在MFC中的產電能力提供了一種研究方向。本發明的希瓦氏菌在20mM乳酸鈉作為電子供體時，最大輸出電壓高達449mV，比初始菌株MR-1提高了18.2％，最大輸出功率密度為160mW/m2，比初始菌株MR-1提高了82.6％。CCTCC NO: M20143402014.07.16
【專利說明】-株高產電的希瓦氏菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於環境汙染生物處理與生物能源【技術領域】，具體涉及一種希瓦氏菌及其 在微生物燃料電池產電上的應用。

【背景技術】
[0002] 能源短缺是我國現今面臨的日益嚴峻的問題，因而能源開發成為了我國現代社會 進行可持續發展的一大挑戰。科學家們不斷尋找新的技術解決方案，其中微生物燃料電池 (Microbial Fuel Cell，MFC)就是其中之一用來產生可替代能源的新裝置，並且其重要性 現今日益顯現。
[0003] 同時，能源開發利用中引起的環境汙染也是人類現代社會可持續發展面臨的一大 挑戰。而汙水資源化儼然是一個再消除汙染的同時又達到資源化的典範之一。
[0004] MFC是利用產電微生物作為陽極催化劑將有機物中的化學能轉化為電能的裝置。 從能源和環境保護的角度來看，將微生物燃料電池應用到廢水處理領域，將MFC技術應用 廢水處理中，在處理有機廢水的同時獲得電能，是緩解當前能源危機和解決環境問題的有 效途徑。在此系統中，菌體是影響MFC產電性能的本質因素，並且近幾年來，關於利用MFC 系統產生電流的微生物報導日益增多。雖然能夠產電的菌株較多，然而它們大多數電化學 活性較低，其產生的電功率較為低下。尤其是革蘭氏陽性菌，不僅細胞外包裹的一層油脂性 膜是非導電性材料並且細胞膜中富含肽聚糖等一些絕緣性物質，從而嚴重阻礙了微生物與 電極之間的電子交換，減小了 MFC的效率。因此，篩選更為高效的產電微生物成為MFC技術 的核心。
[0005] 微生物產電能力相差很大，產電微生物決定著MFC的功能及應用，目前已發現 的產電微生物主要集中在希瓦氏菌屬（Shewanella)和地桿菌屬（Geobacter) (Energy Environ. Sci. ,2011，4, 4366 - 4379)等一些革蘭氏陰性菌。其中希瓦氏菌屬於兼性厭 氧異養型，並且能利用多種有機物作為代謝底物。隨著對產電微生物的深入研究，近來 關於希瓦氏菌在MFC中產電的報導也日益增多。Waston and Logan(Biotechnology and Bioengineering, 2〇10，1〇5(3) :489 -498)利用 Shewanella oneidensis MR-I， 18mM乳酸作為電子供體，僅產生電壓120mV，輸出功率40mW/m2 ;關於Shewanella oneidensis MR-I 產電原理解析，Bretschger 和 Obraztsova 等人（Appl. Environ. Microbiol, 2007, 73(21) :7003 - 7012)採用基因敲除法，分析了電子傳遞過程中的細胞色 素的作用。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一株經過ARTP等離子體誘變得到的具有高活 性產電能力的希瓦氏菌。
[0007] 本發明還要解決的技術問題是提供上述希瓦氏菌在產電方面的應用。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下：
[0009] 一株高產電的希瓦氏菌，其分類命名為希瓦氏菌（Shewanella oneidensis)，已保 藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC No :M2014340,保藏日期為2014年7月 16日。
[0010] 本發明的希瓦氏菌 Shewanella oneidensis CCTCC No :M2014340 的篩選方法，將 希瓦氏菌出發菌株Shewanella oneidensis MR-I經等離子體誘變後，利用W03顯色技術篩 選得到可能高產電的菌株，再經過雙室MFC進行篩選高產電能的菌株。
[0011] 其具體步驟如下：
[0012] (1)等離子體誘變：將希瓦氏菌原始菌株MR-I活化培養，培養溫度28?30°C， 50mL的離心管裝液量為5?10mL，培養時間12?16h，得到處於對數生長期的菌液，將培養 的細胞稀釋至OD 6tltl = 0. 1?1. 0,滴加在滅菌冷卻後的載片上,用無菌空氣吹乾；以氦氣為 放電氣體，以80?120W作為射頻功率，以10?30SLM作為氣體流量，以10?1800s作為 輻照時間對菌株進行等離子體誘變。
[0013] (2)三明治式培養技術初篩選：將誘變後的菌株分別塗布在固體培養基中，20min 之後，再塗布25mL無菌的WO3瓊脂懸浮液，30°C厭氧培養，培養時間24?36h，觀察顏色變 化，挑取藍色部分菌落，種子培養，保存。
[0014] (3)96孔平板顯色技術復篩選：將上述收集的菌株接種於種子培養基中，30°C溫 室搖床培養12?16h後，達到對數期菌液，在8000rpm下離心3min收集菌體，用無菌乳酸 鈉最小鹽溶液懸浮，調細胞〇D_ = 1. 0備用。取IOOul含有乳酸鈉最小鹽溶液的備用菌液 加入96孔平板中，再分別加入SOul無菌含WO3簇狀物（5g/L)的乳酸鈉最小鹽溶液，立即 加入80ul凡士林確保無氧狀態，放入30°C厭氧箱，10、15、30、60min觀察顏色變化。
[0015] (4)雙室MFC技術篩選：將步驟（3)篩選出來的菌株接入種子液，培養溫度28? 30°C，轉速150rpm，培養時間12?16h。然後進行雙室MFC技術，調至陽極室中菌體初始 0D_= 1.0,培養溫度28?30°C;考察步驟⑶篩選出的菌株的產電量，同時選出產電量最 高的菌株。
[0016] (5)在上述篩選方法中：步驟（1)中所述的等離子體誘變方法中，優選100W作為 射頻功率，10SLM作為氣體流量，90s作為輻照時間。
[0017] 在上述篩選方法中：步驟（2)所述的固體培養基：蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、瓊脂； 無菌的WO 3瓊脂懸浮液包含WO3簇狀物、鈉鹽、瓊脂。
[0018] 在上述篩選方法中：步驟（3)所述的種子液為TSB水溶液包含胰蛋白腖、大豆蛋白 腖、肉湯；乳酸鈉最小鹽溶液包含乳酸鈉、鈉鹽、鉀鹽、磷酸鹽、羥乙基哌嗪乙磺酸及微量無 機鹽化合物，分別為NTA、鎂鹽、錳鹽。鈉鹽、亞鐵鹽、鈣鹽、鈷鹽、鋅鹽、銅鹽、鋁鹽、鎳鹽、鎢化 物、硼酸的一種或多種，WO 3簇狀物的乳酸鈉最小鹽溶液，為乳酸鈉最小鹽溶液中添加 WO3簇 狀物。
[0019] 在上述篩選方法中：步驟（4)所述雙室MFC裝置中，陽極液為鉀鹽、磷酸鹽、銨鹽， 乳酸鈉作為電子供體。陰極液為鉀鹽、磷酸鹽、鐵氰化合物。
[0020] 其中，所述的雙室MFC技術產電方法包含如下步驟：
[0021] (1)菌株活化：將希瓦氏菌 Shewanella oneidensis CCTCC No :M2〇14340 接種到 TSB種子培養基中，培養溫度28?30°C，轉速150rpm，培養時間12?16h ;
[0022] (2)裝置搭建：安置陽極室的陽極，安置陰極室的陰極，安置介於陽極隔室和陰極 隔室之間用於分隔陽極室和陰極室的質子交換膜，進行滅菌處理；
[0023] (3)MFC技術：向陽極室中加入陽極液，接入希瓦氏菌Shewanella oneidensis CCTCC No :M2014340,陽極室初始0D_ = 1. 0,迅速密封陽極室，向陰極室加入陰極液，迅速 密封陰極室，至於30°C恆溫箱，進行電壓數據採集器採集數據。
[0024] 所述的陽極和陰極均為PAN基石墨軟氈（5X5cm)，以鈦絲作為外接電路，外接電 阻為1000 Ω，質子交換膜為杜邦NafionNl 17。
[0025] 所述的陽極液為鉀鹽、磷酸鹽、銨鹽，乳酸鈉作為電子供體。陰極液為鉀鹽、磷酸 鹽、鐵氰化合物。
[0026] 按照上述篩選方法獲得的突變株CCTCC No :M2014340與出發菌株MR-I在固體培 養基上的菌落形態、色澤幾乎相同可知，經誘變的突變株CCTCC No :M2014340仍舊屬於希 瓦氏菌。
[0027] 上述高產電的希瓦氏菌在產電中的應用也在本發明的保護範圍之內。
[0028] 上述高產電的希瓦氏菌作為微生物燃料電池在產電中的應用也在本發明的保護 範圍之內。
[0029] 上述希瓦氏菌作為微生物燃料電池進行產電的具體方法，包括如下步驟：
[0030] (1)構建微生物燃料電池：將含有燃料的陽極液加入到陽極室中，以高產電希瓦 氏菌CCTCC No :M2014340菌體作為陽極室接種物；將陰極液加入到陰極室中；
[0031] (2)利用微生物燃料電池產電：將微生物燃料電池放入28?30°C的溫室中靜置培 養，進行產電。
[0032] 步驟（1)中，所述的含有燃料的陽極液中，以乳酸鈉為電子供體，乳酸鈉的濃度為 20±0. 2mmol/L，優選 20mmol/L。
[0033] 步驟（1)中，含有燃料的陽極液優選配方如下：乳酸鈉20±0.2mmol/L，氯化銨 0· 31±0· 02g/L，二水合磷酸二氫鈉 2. 772±0· 05g/L，十二水合磷酸氫二鈉 IL 5±0· 3g/L， 氯化鉀0. 13±0. 01g/L，溶劑為水，pH = 7。
[0034] 步驟（1)中，所述的高產電希瓦氏菌CCTCC No :M2014340菌體預先經過如下方 式活化：由28?3〇V/V%甘油水溶液冷凍保藏的菌種接種於TSB種子培養基中，培養溫度 28?30°C，轉速150rpm，恆溫培養菌體12?16h，達到指數生長期，以接種量為5v/v%轉接 二級，在相同條件下培養12?16h。取得到的對數期菌液，離心，棄上清液，添加無菌生理鹽 水搖勻，再次離心，如此反覆清洗2次，得到菌泥，
[0035] 步驟（1)中，初始陽極室中菌體濃度0D600 = 1. 0±0· 1。
[0036] 步驟（1)中，所述的陰極液優選配方如下：二水合磷酸二氫鈉2.772±0.05g/L， 十二水合磷酸氫二鈉11. 5±0. 3g/L，氯化鉀0. 13±0. 01g/L，鐵氰化鉀40±2mmol/L，溶劑 為水，pH = 7。。
[0037] 有益效果：本發明方法與現有技術相比，本發明的具有如下優勢：
[0038] (1)本發明採用等離子體誘變希瓦氏菌，先利用"三明治式"固體培養基篩選出可 能具有高產電能力的菌落，再利用96孔平板WO 3顯色技術篩出能夠高產電的單菌落菌株， 最後利用雙室MFC技術篩選和驗證出高產電量的菌株。
[0039] (2)本發明為提高希瓦氏菌在MFC中的產電能力提供了一種研究方向。
[0040] (3)本發明的希瓦氏菌在20mM乳酸鈉作為電子供體時，最大輸出電壓高達449mV， 比初始菌株MR-I提高了 18. 2%，最大輸出功率密度為160mW/m2,比初始菌株MR-I提高了 82. 6%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 本發明的微生物分類命名為希瓦氏菌ML_5Shewanella oneidensis ML-5,保藏單 位為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072,保 藏編號為CCTCC NO :M 2014340,保藏日期為2014年7月16日。
[0042] 圖1為希瓦氏菌的等離子體誘變存活率曲線。
[0043] 圖2為以希瓦氏菌為陽極催化劑的微生物燃料電池結構原理圖。
[0044] 圖3a為本發明希瓦氏菌Shewanella oneidensis ML-5在20mM乳酸鈉陽極液中 的產電活性圖。
[0045] 圖3b為初始菌株MR-I在20mM乳酸鈉陽極液中的產電活性圖。
[0046] 圖4為本發明與初始菌株MR-I利用20mM乳酸鈉作為電子供體的產電情況。

【具體實施方式】
[0047] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0048] 實施例1 :
[0049] 本實施例說明將希瓦氏菌原始菌株進行第一步等離子體誘變的方法。
[0050] 希瓦氏菌原始菌株進行第一步等離子體誘變的方法如下：
[0051] 將希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-I菌株活化培養，培養溫度28?30°C, 50mL離心管裝液量為5?IOmL,轉速150rpm，培養時間12?16h，得到生長旺盛的菌液； 按5v/v%轉接二級，培養條件與活化相同。取新鮮培養的細胞稀釋至細胞濃度0D_ = 1? I. 5,滴加在滅菌冷卻後的載片上，用無菌空氣吹乾；以氦氣為放電氣體，以100W作為射頻 功率，以10SLM作為氣體流量，以10?1800s作為輻照時間對菌株進行等離子體誘變，誘 變後，將載體上的菌膜洗脫下來，計算存活率。實驗結果如附圖1所示；由圖1可知，90s是 最佳的誘變輻照時間。
[0052] 實施例2 :
[0053] 本實施例說明篩選出高產電的拜氏梭菌的方法。
[0054] 其中，所使用的培養基配方如下所示：
[0055] (I)TSB 種子培養基：3g TSB/100ml 水
[0056] (2)三明治式培養基如下：
[0057] a)、固體培養基：酵母粉5g/L，蛋白腖10g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂15?20g/L。
[0058] b)、WO3瓊脂懸浮液：WO3簇狀物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。
[0059] (3)乳酸鈉最小鹽溶液：乳酸鈉2. 02g/L，氯化鈉5. 85g/L，輕乙基哌嗪乙磺酸 II. 91g/L，氫氧化鈉0. 3g/L，氯化銨I. 498g/L，氯化鉀0. 097g/L，二水合磷酸二氫鈉0. 67g/ L〇
[0060] 附加微量元素溶液（比例1:1000) :NTA (C6H9NO6) I. 5g/L，七水合硫酸鎂30g/L，一 水合硫酸猛5g/L,氯化鈉 lOg/L,七水合硫酸亞鐵lg/L,二水合氯化興lg/L,六水合氯化鈷 lg/L，氯化鋅I. 3g/L，五水合硫酸銅0. lg/L，十二水合硫酸鉀鋁0. lg/L，硼酸0. lg/L，二水 合鑰酸鈉0. 25g/L，六水合氯化鎳0. 25g/L，二水合鎢酸鈉0. 25g/L。
[0061] 附加胺基酸溶液（比例1:1000) :L-穀氨酸2g/L，L-精氨酸2g/L，DL-絲氨酸2g/ L〇
[0062] 附加維生素溶液（比例1:1000):生物素2g/L，葉酸2g/L，鹽酸吡哆醇10g/L，核黃 素5g/L，菸鹼酸5g/L，維生素 B55g/L，維生素 B12O. lg/L，p-對氨基苯甲酸5g/L，硫辛酸5g/ L〇
[0063] 含WO3簇狀物的乳酸鈉最小鹽溶液：加 WO3簇狀物的乳酸鈉最小鹽溶液。
[0064] (4)雙室MFC中陽極液：乳酸鈉20mM，氯化銨0· 31g/L，二水合磷酸二氫鈉2. 772g/ L，十二水合磷酸氫二鈉11. 5g/L，氯化鉀0. 13g/L，pH = 7。
[0065] 雙室MFC中陰極液：二水合磷酸二氫鈉2. 772g/L，十二水合磷酸氫二鈉11. 5g/L， 氯化鉀0. 13g/L，鐵氰化鉀40mM，pH = 7。
[0066] 篩選步驟：
[0067] (1)三明治式培養技術初篩選
[0068] 將誘變後的載片置於裝有1?2mL生理鹽水的具塞試管中，劇烈震蕩，將載片上的 菌株洗脫，稀釋成不同濃度塗布於固體培養基平板上，20分鐘後，再在固體平板培養基上塗 布25mL無菌WO 3瓊脂懸浮液，28?30°C厭氧培養24?36h，挑選出具有顏色變化區的菌落， 種子培養基培養，保存。
[0069] (2) 96孔平板顯色技術復篩選
[0070] 將上述收集的菌株和出發菌株MR-I接種於TSB種子培養基中，培養溫度28? 30°C，轉速150rpm，培養12?16h ;在8000rpm下離心3min收集菌體，用無菌乳酸鈉最小鹽 溶液懸浮，調細胞〇D_ = I. 0備用。取IOOul含有乳酸鈉最小鹽溶液的備用菌液加入96孔 平板中，再分別加入80ul無菌含WO3 (5g/L)簇狀物的乳酸鈉最小鹽溶液，立即加入80ul凡 士林確保無氧狀態，放入30°C厭氧箱，10、15、30、60min觀察顏色變化，挑選出8株快速變藍 及顏色深的菌株。
[0071] (3)雙室MFC技術篩選
[0072] 將上述挑選得到的菌株和出發菌株MR-I接種於種子培養基中，培養溫度28? 30°C，轉速150rpm，培養時間12?16h，達到對數期菌液；轉接二級種子，500ml的三角瓶中 裝液量IOOmL,接種量5mL，培養溫度28?30°C，轉速150rpm，培養時間12?16h ;取對數期 菌液，8000rpm離心3min，棄上清液，添加無菌生理鹽水搖勻，再次離心，如此反覆清洗2次， 得到菌泥；按照初始陽極室中菌體濃度〇D_ = I. 0接種於陽極室，迅速密封陽極室，向陰極 室接入陰極液，密封陰極室，外接電阻1000 Ω，培養溫度28?30°C，數據採集。當產生的電 壓降低時，立即利用萬用表及電阻箱測定輸出電壓，進行測定篩選菌株和出發菌株MR-I的 最大功率功率密度及最大輸出電壓，如表1所示：
[0073] 表 1
[0074]

【權利要求】
1. 一株高產電的希瓦氏菌，其分類命名為希瓦氏菌（Shewanella oneidensis)，已保藏 於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC No :M2014340,保藏日期為2014年7月 16日。
2. 權利要求1所述的高產電的希瓦氏菌在產電中的應用。
3. 權利要求1所述的高產電的希瓦氏菌作為微生物燃料電池在產電中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，希瓦氏菌作為微生物燃料電池進行產電 的方法，包括如下步驟： (1) 構建微生物燃料電池：將含有燃料的陽極液加入到陽極室中，以高產電希瓦氏菌 CCTCC No :M2014340菌體作為陽極室接種物；將陰極液加入到陰極室中； (2) 利用微生物燃料電池產電：將微生物燃料電池放入28?30°C的溫室中靜置培養， 進行產電。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，步驟（1)中，所述的含有燃料的陽極液中， 以乳酸鈉為電子供體，乳酸鈉的濃度為20±0. 2mmol/L。
6. 根據權利要求4或5所述的應用，其特徵在於，含有燃料的陽極液配方如下：乳酸鈉 20±0. 2mmol/L，氯化銨 0. 31±0. 02g/L，二水合磷酸二氫鈉 2. 772±0. 05g/L，十二水合磷 酸氫二鈉 11. 5±0. 3g/L，氯化鉀 0. 13±0. 01g/L，溶劑為水，pH = 7。
7. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，步驟⑴中，所述的高產電希瓦氏菌CCTCC No :M2014340菌體預先經過如下方式活化：由28?30v/v%甘油水溶液冷凍保藏的菌種接 種於TSB種子培養基中，培養溫度28?30°C，轉速150rpm，恆溫培養菌體12?16h，達到指 數生長期，以接種量為5v/ v%轉接二級，在相同條件下培養12?16h。
8. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，步驟（1)中，初始陽極室中菌體濃度 0D600 = 1. 0±0· 1。
9. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，步驟（1)中，所述的陰極液配方如 下：二水合磷酸二氫鈉2. 772±0. 05g/L，十二水合磷酸氫二鈉11. 5±0. 3g/L，氯化鉀 0. 13±0. 01g/L，鐵氰化鉀 40±2mmol/L，溶劑為水，pH = 7。
【文檔編號】C12R1/01GK104263672SQ201410354073
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】朱大偉, 鄭曉, 孫夢茹 申請人:常州市第一人民醫院