CemGPDH基因及其應用的製作方法

2023-08-13 12:15:01 1

CemGPDH基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種CemGPDH基因及其在提高細胞脂肪酸含量方面的用途，所述CemGPDH基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。該基因來源於橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)，編碼甘油-3-磷酸脫氫酶。甘油-3-磷酸脫氫酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)催化合成的甘油-3-磷酸(Glycerol-3-phosphate，G3P)是合成三醯甘油(TAG)的重要原料，該酶參與了線粒體G3P穿梭，為呼吸鏈提供電子，是G3P合成的關鍵酶，也是連接糖代謝和脂代謝的關鍵酶之一，對植物體內油脂合成和能量代謝有重要作用。利用本發明的基因轉化酵母細胞、植物細胞和微藻細胞能顯著提高細胞的總脂肪酸含量。
【專利說明】CemGPDH基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種甘油-3-磯酸脫氨酶基因GPDH及其應用。具體地，涉及該基因序 列的獲得和酵母表達載體的構建，W及其顯著提高酵母脂肪酸含量方面的用途。

【背景技術】
[0002] 目前，隨著傳統能源的過度消耗和日益增長的能源需求，能源問題日益嚴峻，可替 代能源的研究和開發成為全球學者關注的熱點。生物柴油主要W大豆、麻瘋樹等油料作物、 廢棄的廚餘油脂、動物性脂肪W及基因工程改造過的微藻作為原材料加工成液體燃料，是 可W替代傳統石油燃料的優質新型可再生能源。而微藻由於含油量高，易於培養，單位±地 油脂產量遠高於其他油料作物，被認為是最有潛力的能源資源之一。
[0003] 微藻繁殖能力強，對生長環境要求低，易於培養，光合作用效率高，含油量高，但目 前微藻油脂代謝途徑中關鍵酶基因的研究還相對較少小球藻（化Iorella)是微藻中 的一類，屬於綠藻口小球藻屬，是光合自養型球形單細胞綠藻，直徑大約3-8微米。小球藻 繁殖能力很強，含有豐富的營養元素，例如蛋白質、油脂、多不飽和脂肪酸、維生素、礦物質、 食物纖維、核酸及葉綠素等，還含有多種生物活性物質，例如糖蛋白、多糖。小球藻是少數幾 個可用於大規模培養的微藻。
[0004] 真核生物（例如小球藻）中，油脂的主要儲存形式是H醜甘油（TAG),由甘 油-3-磯酸（G3巧和脂醜輔酶A為前體合成。甘油-3-磯酸脫氨酶（Glycero^3-phosphate dehy化Ogenase，GPD巧催化糖酵解過程中產生的磯酸二輕丙麗（Dihy^oxyacetone phosphate, DHAP)與G3P之間的相互轉變，產物G3P是合成TAG的重要原料，因此，GPDH是 連接糖代謝和脂代謝的關鍵酶。
[0005] G3P是由甘油磯酸化而來，在植物中，澱粉通常作為光合作用的終產物被儲存起 來，甘油的主要來源是通過將澱粉分解的葡萄糖送入糖酵解過程，將糖酵解中間產物轉化 為甘油。而在微藻中，有些種類的微藻在積累澱粉的同時會產生大量的甘油，作為光合作 用的終產物儲存起來W。因此，在微藻中，主要有兩條不同的甘油合成途徑，其一是利用光 合作用直接合成甘油，另一條是通過分解儲藏物質，將澱粉及藏糖分解成為6-磯酸果糖， 後轉變為DHAP，再由甘油-3-磯酸脫氨酶催化，生成G3P，最後通過去磯酸化作用生成甘油 。從微藻GPDH在油脂合成代謝中的位置上來看，GPDH所催化的由DHAP轉變為G3P的 反應是甘油合成途徑的關鍵步驟，GPDH參與了線粒體G3P穿梭，為呼吸鏈提供電子，是G3P 合成的關鍵酶之一，而G3P是TAG和磯脂合成的重要原料，並且GPDH連接了糖代謝和脂代 謝，對植物體內油脂合成和能量代謝有重要作用。
[0006] 根據GPDH在細胞內位置不同，將其分為S種類型同工酶一細胞質型 GPDH(CtGPDH)，葉綠體型GPDH (cpGPDH)和線粒體型GPDH (mGPDH)。每種同工酶在細胞內偏 好催化DHAP與G3P之間相互轉變的正反應或逆反應，輔酶類型不同（W FAD或NADH/NADPH 作為輔酶），受不同條件誘導表達（滲透脅迫、熱激、油酸脅迫等），並且在不同物種中目前 已發現的GPDH同工酶數量不同?。


【發明內容】

[0007] 本發明發現將來源於楠圓小球藻的CemGP畑基因轉入釀酒酵母INVSCl後，可顯著 提高其主要脂肪酸組分的含量。在INVScI主要的四種脂肪酸組分中，蹤擱酸（C16:0)和 硬脂酸佑18:0)含量變化不顯著，蹤擱油酸（(：16:1)提高了15.57%，油酸（(：18:1)提高了 13. 53%。酵母細胞總脂肪酸的含量也提高了約10.07%。已有物種GPDH基因的研究基本 都選擇了酵母GPDH突變體來對其進行互補功能驗證，甚少有用野生型酵母的。本發明選擇 野生型酵母在對楠圓小球藻GPDH基因進行功能驗證的同時還發現了其對油脂合成的顯著 作用。在酵母中研究表明，CemGPDH基因轉酵母株與對照組（轉空載）相比，總脂肪酸含量 提高了約10. 07%，且其部分主要脂肪酸組分的含量也有明顯提高，其中蹤擱酸（C16:0)和 硬脂酸佑18:0)含量變化不顯著，蹤擱油酸（(：16:1)提高了15.57%，油酸（(：18:1)提高了 13. 53%。酵母細胞總脂肪酸的含量也提高了約10. 07%。單個基因使得總脂肪酸及各不同 脂肪酸的含量達到該種程度的實屬少見。
[0008] 本發明提供了一個GPDH基因，其CDNA核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示，該個基因 來源於楠圓小球藻，該基因CDNA全長為1857bp。
[0009] 本發明還提供了含本發明所述基因（CemGPDH)的酵母表達載體。
[0010] 本發明在一個方面提供了包含本發明所述基因的酵母、植物或藻類，其選自酵 母，藻類，擬南芥、菸草、油菜、向日葵、大豆、當麻、棉花、橄攬、和紅花等。優選地，所述藻 類選自小球藻。更具體地，所述酵母選自釀酒酵母，小球藻選自楠圓小球藻（化Iorella ellipsoidea)。
[0011] 本發明提供的楠圓小球藻GPDH基因，可應用於利用基因工程方法提高酵母、植物 或藻類油脂等方面。
[0012] 更具體地，本發明提供W下各項：
[001引 1. CemGPDH蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014] 2.編碼根據1所述的CemGPDH蛋白的基因。
[0015] 3.根據2所述的基因，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0016] 4.載體，其包含根據2或3所述的基因，所述載體可W通過將根據2或3所述的基 因轉入到 PYES2. 0(可購自 Invitrogen 公司），pBIN19、地I121、pBI221(可購自 Clontech), pCambial300(可購自 Gambia 公司）或 pGreen(可購自 the John Innes Centre)中來制 備。
[0017] 5.宿主細胞，其包含根據1所述的CemGPDH蛋白、根據2或3所述的基因或根據4 所述的載體。
[0018] 6. -種製備具有高蹤擱油酸和/或油酸含量，或具有高總脂肪酸含量的酵母、植 物或藻類的細胞的方法，所述方法包括將根據2或3所述的基因或根據4所述的載體轉入 所述酵母、植物或藻類的細胞中，所述酵母優選是釀酒酵母，更優選是尿嚼巧缺陷型釀酒酵 母INVSCl ;所述藻類優選是小球藻，更優選是楠圓小球藻煙ilorella ellipsoidea);所述 植物優選選自擬南芥、菸草、油菜、向日葵、大豆、番茄、當麻、棉花、芝麻或花生。
[0019] 7.根據1所述的CemGPDH蛋白、根據2或3所述的基因或根據4所述的載體在 製備具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細胞中的用途，所述酵母優選是釀酒酵母， 更優選是尿嚼巧缺陷型釀酒酵母INVSCl ;所述藻類優選是小球藻，更優選是楠圓小球藻 煙ilorella ellipsoidea);所述植物優選選自擬南芥、菸草、油菜、向日葵、大豆、番茄、當 麻、棉花、芝麻或花生，所述具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細胞優選是具有高 蹤擱油酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻類的細胞。
[0020] 8.根據1所述的CemGPDH蛋白、根據2或3所述的基因或根據4所述的載體在提 高酵母、植物或藻類的細胞中蹤擱油酸和/或油酸含量，或總脂肪酸含量中的用途，所述酵 母優選是釀酒酵母，更優選是尿嚼巧缺陷型釀酒酵母INVSCl ;所述藻類優選是小球藻，更 優選是楠圓小球藻煙ilorella ellipsoidea);所述植物優選選自擬南芥、菸草、油菜、向日 葵、大豆、番茄、當麻、棉花、芝麻或花生。
[0021] 9.利用根據6所述的方法製備的具有高蹤擱油酸和/或油酸含量，或具有高總脂 肪酸含量的酵母、植物或藻類的細胞。
[0022] 10.根據9所述的酵母、植物或藻類的細胞在生產生物柴油中的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1.含楠圓小球藻CemGPDH基因的酵母表達載體的構建。
[0024] 圖2. GC-MS法測定的酵母各脂肪酸組分含量W及總脂肪酸含量（CK為對照， pYES-GPDH為轉CemGPDH基因的酵母脂肪酸測定）。

【具體實施方式】
[0025] 下面參考實施例和附圖詳細描述本發明。本領域的普通技術人員可W理解的是， 下述實施例是舉例說明的目的，其不應W任何方式解釋為對本發明的限制。本發明的保護 範圍由後附的所限定。
[0026] 實施例1.楠圓小球藻CemGPDH基因CDNA全長的獲得
[0027] 取培養3-4天的對數生長期楠圓小球藻（來自於中國科學院水生生物研究所）藻 液，離也收集藻體後置於液氮中充分研磨。參照艾德萊EASYspin RNA提取試劑盒說明書及 Takara面ase I說明書進行總RNA提取和純化。W帶POlyT的引物進行逆轉錄獲得cDNA， 並進行RT-PCR (具體操作見TOYOBO ReverTra Ace- a試劑盒）。
[002引 cDNA的合成反應條件如下：
[0029]

【權利要求】
1. CemGPDH蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2. 編碼根據權利要求1所述的CemGPDH蛋白的基因。
3. 根據權利要求2所述的基因，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
4. 載體，其包含根據權利要求2或3所述的基因。
5. 宿主細胞，其包含根據權利要求1所述的CemGPDH蛋白、根據權利要求2或3所述的 基因或根據權利要求4所述的載體。
6. -種製備具有高棕櫚油酸和/或油酸含量，或具有高總脂肪酸含量的酵母、植物 或藻類的細胞的方法，所述方法包括將根據權利要求2或3所述的基因或根據權利要求4 所述的載體轉入所述酵母、植物或藻類的細胞中，所述酵母優選是釀酒酵母，更優選是尿 嘧啶缺陷型釀酒酵母INVSC1 ;所述藻類優選是小球藻，更優選是橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物優選選自擬南芥、菸草、油菜、向日葵、大豆、番爺、菌麻、棉花、芝麻 或花生。
7. 根據權利要求1所述的CemGPDH蛋白、根據權利要求2或3所述的基因或根據權利 要求4所述的載體在製備具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細胞中的用途，所述 酵母優選是釀酒酵母，更優選是尿嘧啶缺陷型釀酒酵母INVSC1 ;所述藻類優選是小球藻， 更優選是橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物優選選自擬南芥、菸草、油菜、向 日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生，所述具有高總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的 細胞優選是具有高棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻類的細胞。
8. 根據權利要求1所述的CemGPDH蛋白、根據權利要求2或3所述的基因或根據權利 要求4所述的載體在提高酵母、植物或藻類的細胞中棕櫚油酸和/或油酸含量，或總脂肪酸 含量中的用途，所述酵母優選是釀酒酵母，更優選是尿嘧啶缺陷型釀酒酵母INVSC1 ;所述 藻類優選是小球藻，更優選是橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物優選選自擬 南芥、菸草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生。
9. 利用根據權利要求6所述的方法製備的具有高棕櫚油酸和/或油酸含量，或具有高 總脂肪酸含量的酵母、植物或藻類的細胞。
10. 根據權利要求9所述的酵母、植物或藻類的細胞在生產生物柴油中的用途。
【文檔編號】C12N1/13GK104357415SQ201410547380
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】胡贊民, 張丹, 李帥, 範成明, 陳宇紅 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所