一種擬麗突線蟲的培養方法
2023-10-09 04:53:39
專利名稱：：一種擬麗突線蟲的培養方法
技術領域：
：本發明涉及生物培養，具體為一種擬麗突線蟲的培養方法。
背景技術：
：線蟲是土壤中最為豐富的無脊推動物，在土壤生態系統腐屑食物網中佔有重要地位。線蟲作為食物鏈中的重要成員廣泛存在於土壤中，因其形態特殊性、食物專一性、分離鑑定相對簡單，以及對環境的各種變化能做出較迅速的反應等特點，可將線蟲作為土壤汙染毒理效應研究的模式生物，為環境汙染評價提供有價值的信息。擬麗突線蟲(Jcra6e/o/cfeswam^)對土壤及水體中重金屬汙染具有很好的生物指示作用，採用室內培養該種線蟲可用於汙染環境的生物檢測。擬麗突線蟲是一種單性生殖的土壤居住的食細菌線蟲(Laugsch,M.&Schierenberg,E.Differencesinmaternalsupplyandearlydevelopmentofcloselyrelatednematodespecies.InternationalJournalofDevelopmentalBiology,2004,48:655-662)。擬麗突線蟲成蟲體長0.5mm左右。在世界不同地區的土壤中，擬麗突線蟲是線蟲群落的主要組成部分，它佔據了大範圍的土壤生活環境，佔線蟲群落的20%左右(DeGoede,R.G.M.&Bongers，T.NematodeCommunitiesofNorthernTemperateGrasslandEcosystems.Focus,Giessen,Germany.1998)。擬麗突線蟲以腐生和植物病原細菌為食，通過在土壤中傳播細菌和病毒間接作用於有機質分解(Ikonen,E.K.LifehistorystudiesofthehermaphroditenematodeJcroZ>e/o/<107個，在37.5'C下165轉/分鐘搖床振蕩培養23小時得到細菌液(細菌液中大腸桿菌濃度為5xlS個/mL),備用。培養基配方為牛肉膏5g、蛋白腖10.0g、NaC15g、蒸餾水1000ml,最後調節pH為7.5。擬麗突線蟲的培養取18個乾淨的直徑為6cm的培養皿，將步驟3)得到的線蟲培養基6mL平鋪在培養皿中，靜置9小時，按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將上述得到的細菌液120nL倒入培養皿，靜置4分鐘，在每6個培養皿中分別用接種針挑入步驟4)得到的無菌擬麗突線蟲10條、15條和20條，均勻放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子。上述操作步驟均在無菌工作檯上進行。然後將培養皿置於恆溫恆溼培養箱，溼度60%、22°C8培養10天，即可得到所培養的線蟲。實施例4~11:具體實施方式同實施例1，不同之處在於線蟲培養溫溼度和培養時間有所差別(見表1)。表1編號培養溼度(％)培養溫度(°c)培養時間(天)45123952249653258754268856279572810582961159305應用例1:本應用例釆用實施例1(20。C)的培養方法，培養後得到線蟲數量如表2(表中數據為取lcn^平面，觀測線蟲數量，根據培養皿面積，以觀測數據乘以25得到，下同)。表2加入IO條線蟲加入15條線蟲加入20條線蟲培養皿1310034002600培養皿2217538253425培養皿3232523501950培養皿4290032753025培養皿5267528752725培養皿6197516003100平均252528882804根據表2結果，培養前加入擬麗突線蟲IO條、15條和20條處理，經11天培養後平均分別達到2525條、2888條和2804條。9應用例2:本應用例釆用實施例6(25t:)的培養方法，培養後得到線蟲數量如表3。表3tableseeoriginaldocumentpage10根據表3結果，培養前加入擬麗突線蟲10條、15條和20條處理，經5天培養後平均分別達到3604條、3738條和3954條。應用例3:本應用例採用實施例11(3(TC)的培養方法，培養後得到的線蟲數量如表4。表4tableseeoriginaldocumentpage10根據表4結果，培養前加入擬麗突線蟲10條、15條和20條處理，經5天培養後平均分別達到3725條、3592條和3654條。權利要求1.一種擬麗突線蟲的培養方法，其特徵在於將大腸桿菌E.coli菌株接入液體的牛肉膏蛋白腖培養基上，在36.5～37.5℃下165～175次/分鐘搖床振蕩培養23～25小時得到細菌液；然後，將細菌液加入到線蟲培養基，再挑入消過毒的無菌的擬麗突線蟲，置於恆溫恆溼培養箱，在溼度50～60％、溫度20～30℃條件下培養5～11天，即可得到所培養的線蟲。2.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特徵在於所述大腸桿菌五."//菌株為普通野生型大腸桿菌，菌株屬於革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5xl3微米，周身鞭毛，能運動，無芽孢。3.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特徵在於所述的細菌液是將大腸桿菌菌株用接種環挑取，接入4060mL液體的牛肉膏蛋白腖培養基上，每次接種大腸桿菌數量為1"07~3><107個，放進具有恆溫功能的搖床，調節搖床溫度36.537.5"C、搖動次數設置為165-175次/分鐘，振蕩培養2325小時，得到細菌液。4.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特徵在於所述的液體牛肉膏蛋白腖培養基按重量計為牛肉膏5g、蛋白腖10.0g、NaCl5g、蒸餾水1000mL,最後用2mol/LNaOH調節pH為6.5~7.5。5.根據權利要求l所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特徵在於所述的線蟲培養基按重量計為3gNaCl、17g瓊脂、2.5g蛋白腖，溶於975mL蒸餾水中，120122。C滅菌，29.5-30.5分鐘後分別加入5mg/mL膽固醇貯存液1mL、1mol/LCaCl21mL、1mol/LMgS041mL、pH為5.9~6.1的lmol/L磷酸緩衝液25mL,搖動均勾，即得線蟲培養基。6.根據權利要求1所述的擬麗突線蟲的培養方法，其特徵在於所述的擬麗突線蟲的培養步驟為，取乾淨的直徑為6cm的培養皿，將線蟲培養基46mL平鋪在培養皿中，靜置810小時，用微量移液器按細菌液/培養基為1/50的體積比例，將細菌液8012(HiL倒入培養皿，靜置35分鐘，用接種針挑入無菌擬麗突線蟲10~20條，均勻放置在培養基上，蓋上培養皿蓋子；然後，將培養皿置於恆溫恆溼培養箱，在溼度50~60%、20~3(TC培養511天，即可得到所培養的線蟲。全文摘要本發明涉及生物培養，具體為一種擬麗突線蟲的培養方法。培養步驟為以大腸桿菌E.coli菌株為生長菌，將大腸桿菌菌株接入液體的牛肉膏蛋白腖培養基上，在36.5～37.5℃下165～175次/分鐘搖床振蕩培養23～25小時得到細菌液，然後將細菌液加入到線蟲培養基，再挑入經無菌消毒的擬麗突線蟲(Acrobeloidesnanus)，置於恆溫恆溼培養箱，在溼度50～60％、溫度20～30℃條件下培養5～11天，即可得到所培養的線蟲。本發明操作簡單，成本低廉，容易實施；本發明培養得到的擬麗突線蟲，可作為環境汙染生態毒理診斷的一種有效指示生物，解決環境汙染的生物檢測問題。文檔編號A01K67/00GK101485300SQ20081001016公開日2009年7月22日申請日期2008年1月18日優先權日2008年1月18日發明者勇姜,琪李,梁文舉,偉郝申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所