一種桔橙指孢囊菌及其在調控微生物代謝物非達黴素中的應用的製作方法

2023-08-13 17:42:51 1

本發明涉及一種微生物及其在製藥領域中應用，具體地說是桔橙指孢囊菌通過調控微生物代謝獲得非達黴素的應用。
背景技術：
：非達黴素(fidaxomicin，商品名dificid，曾用名opt-80，par-101)，是具有18元環結構的大環內酯類抗生素，可由桔橙指孢囊菌hamdenensis亞種(dactylosporangiumaurantiacumsubspeciehamdenensis)發酵而得，具體可由放線菌指孢囊菌nrrl18085產生。桔橙指孢囊菌發酵得到的產物是一族與非達黴素結構非常相近的產物，稱為臺勾黴素(tiacumicins)，按結構不同，分別稱為臺勾黴素a、b、c、d、e和f。非達黴素為r構型的臺勾黴素b，具有新型的作用機制(結構式如下所示)。非達黴素於2011年5月獲美國fda批准上市，用於治療艱難梭菌(難辨梭狀芽孢桿菌，clostridiumdifficile)感染相關性腹瀉(cdad)。這是fda近30年來批准的首個治療cdad的藥物，歐盟2011年12月批准上市。中國專利文獻03818016.2(發明名稱：臺勾黴素的製備)公開了製備臺勾黴素b的方法，所製備得到發酵產物中，含有較高的副產物、雜質(見附圖1)。中國專利文獻201310208223.2(發明名稱：一種遊動放線菌菌株及其在製備非達黴素中的應用)公開了其製備得到發酵產物的hplc分析圖(見附圖2)，圖中顯示發酵產物中含有較多的副產物和雜質。本領域普通技術人員均知道現有技術製備得的非達黴素發酵產物中含有較多的雜物、副產物，這些物質的存在將對後續的提純帶來很大的難度，對於一些在提純環節中很難去除的雜質，將嚴重影響最終藥品的質量。技術實現要素：本發明的目的是針對上述問題，提供一種發酵穩定、副產物少的非達黴素產生菌，同時提供該菌株在製備非達黴素中的應用，以及具體的發酵製備方法。本發明的目的是通過下列技術方案實現的：一種桔橙指孢囊菌，分類命名為dactylosporangiumaurantiacumfid1307，由中國典型培養物保藏中心保藏(簡稱cctcc)，保藏號為：cctccno：m2017311，保藏日期為：2017年6月7日。所述的保藏號為cctccno：m2017311的菌株的菌落特徵：菌落近圓形，表面平整，菌落直徑1～2mm，中間隆起，無分泌物和可溶性色素產生。所述的保藏號為cctccno：m2017311菌株可應用於發酵製備非達黴素。該製備方法包括下列步驟：a.菌株採用保藏編號為cctccno：m2017311的菌株；b.將按常規方法製備的30％甘油菌絲冷凍管，按搖瓶種子培養基體積的3～5％的接種量接入搖瓶種子培養基，220～260rpm，培養2～3天，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養基體積0.1～0.2％的接種量接種於種子罐，120～200rpm，培養3～4天，得罐種子液；將罐種子液按發酵罐培養基體積5～15％的接種量接種於發酵罐培養基，150～200rpm，發酵培養9～12天，收集發酵液中的樹脂；其中培養溫度均為26～30℃。其中所述的搖瓶種子培養基各組分在培養基中的比例為：每100ml培養基中，碳源1～4.5g，氮源4～7.7g，無機鹽0.1～0.4g，其餘為水；種子罐培養基各組分在培養基中的比例為：每100ml培養基中，碳源1.5～6g，氮源5～9g，無機鹽0.2～0.6g，其餘為水；發酵罐培養基各組分在培養基中的比例為：每100ml培養基中，碳源4.5～10g，氮源1.7～5g，無機鹽0.8～1.8g，樹脂3～6g，其餘為水；其中所述的培養基各組分在培養基中比例，搖瓶種子培養基優選比例為：每100ml培養基中，碳源2～3g，氮源5～7g，無機鹽0.2～0.3g，其餘為水；種子罐培養基各組分在培養基中的優選比例為：每100ml培養基中，碳源2～4g，氮源6～8g，無機鹽0.3～0.5g，其餘為水；發酵罐培養基各組分在培養基中的優選比例為：每100ml培養基中，碳源5～8g，氮源2～4g，無機鹽0.8～1.2g，樹脂4～5g，其餘為水。其中所述的碳源選自蔗糖、葡萄糖、燕麥粉、d-木糖、d-核糖、半乳糖、麥芽糖、麥芽糊精、玉米澱粉、可溶性澱粉、馬鈴薯澱粉、玉米糊精、甘油中的一種或幾種；氮源選自酸水解酪蛋白、牛肉浸膏、酵母膏、酵母浸出粉、麥芽浸出粉、酵母粉、大豆蛋白腖、蛋白腖、麩質粉、棉籽粉、黃豆餅粉、玉米漿粉、玉米蛋白粉、尿素中的一種或幾種；無機鹽選自檸檬酸鹽、硝酸鉀、caco3、k2hpo4、mnso4.7h2o、nacl、mgso4.7h2o、feso4.7h2o、kh2po4中的一種或幾種；樹脂選自hz818、pad900、hb60中的任一種。其中所述的培養基優選為：碳源為葡萄糖、玉米澱粉中的一種或幾種；氮源為牛肉浸膏、酵母粉、黃豆餅粉、大豆蛋白腖、玉米蛋白粉、棉籽粉的一種或幾種；無機鹽為k2hpo4、kh2po4、caco3的一種或幾種；樹脂為hz818或pad900。本發明所述的保藏號為cctccno：m2017311的菌株是目前可用於大規模生產的菌株。發酵過程是非達黴素生產的重要環節，其發酵水平與工藝優劣直接相關，本發明提供的發酵工藝經過搖瓶發酵和10噸發酵罐試驗，其生產能力穩定。經檢測，用本發明提供的菌株及發酵培養可獲得發酵效價較高的非達黴素，同時發酵副產物較少、產物組分單一、同系物雜峰較少，經hplc檢測，非達黴素歸一化含量40～43％。從而為後續的工業化生產提供了良好的基礎，降低了後續提取的難度，從而有利於高品質的非達黴素的獲得，在工業化生產的應用方面具有很大的優勢。以本發明的菌種製備得到的發酵液與中國專利文獻報導的發酵液經hplc對比，很明顯本發明的發酵液雜質少，有效物質濃度較高，有利於大生產。菌株保藏情況：保藏於武漢中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc)，保藏編號為cctccno：m2017311。保藏日期為2017年6月7日。附圖說明圖1為中國專利文獻03818016.2中的發酵液hplc圖圖2為中國專利文獻201310208223.2中的發酵液hplc圖圖3為本發明實施例2發酵液hplc圖圖4為本發明實施例3發酵液hplc圖圖5為本發明實施例4發酵液hplc圖圖6為本發明實施例5發酵液hplc圖具體實施方式下面結合具體實施例為本發明進行進一步的描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術參數理解為對本發明的限制。實施例1：保藏號為cctccno：m2017311菌株的培養及生理生化特徵和碳源利用情況1、保藏號為cctccno：m2017311菌株培養的形態學特徵將保藏號為cctccno：m2017311菌株接種於isp2(酵母膏麥芽浸出粉瓊脂)培養基，30℃培養10～14天，觀察菌落的形態特徵並進行描述。觀察發現該菌落生長豐富，14天直徑1～2mm；培養前期菌落近圓形，培養後期邊緣不規則突起，中心凹陷；菌絲顏色淺橘色至淡粉紅色，無分泌物和可溶性色素產生。2、保藏號為cctccno：m2017311菌株生理生化培養特徵菌株在培養基中的培養特徵列見下表1所示。表1cctccno：m2017311菌株培養特徵培養基生長情況菌苔顏色可溶性色素isp2酵母膏麥芽浸出粉瓊脂培養基+++淺橘色-isp3燕麥粉瓊脂++藕色-isp4無機鹽－澱粉瓊脂++淺藕色-isp5甘油天門冬素瓊脂+-淺藕色-isp6蛋白腖酵母膏浸汁鐵瓊脂++淺黃色-isp7酪氨酸瓊脂+-淺藕色-+：生長一般；++：生長中等；+++：生長豐富；—：缺乏在isp2培養基中基絲少，短，不規則分枝，無氣絲，在某些瓊脂培養基的表面形成指狀孢子囊。此次試驗以蛋白腖-磷酸鹽為基礎培養基，30℃培養，定期進行觀察。結果如下表2所示，試驗結果顯示，該菌株能同化蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、d-木糖、甘油、半乳糖、d-核糖等，不能利用d-阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、d-果糖、乳糖、山梨糖等。表2cctccno：m2017311的碳源利用情況碳源生長情況蔗糖+葡萄糖+麥芽糖+d-木糖+甘油+半乳糖+d-核糖+肌醇±棉籽糖±d-阿拉伯糖-鼠李糖-甘露糖-d-果糖-乳糖-山梨糖-+：陽或利用；-：陰或不利用；±：弱陽性或不確定實施例2：發酵培養製備非達黴素採用保藏號為cctccno：m2017311的菌株。1、菌種培養及保存固體培養基：葡萄糖1g，可溶性澱粉2g，酵母浸出粉1g，酸水解酪蛋白0.5g，瓊脂2g，加水到100ml，ph調7.0。固體培養方法：菌株接種於固體培養基斜面上，30℃培養8～10天。固體培養結束後，斜面放置4～10℃冷藏備用。2、搖瓶種子培養培養基：葡萄糖1g，玉米澱粉0.5g，馬鈴薯澱粉0.5g，酵母粉1g，大豆蛋白腖1.5g，牛肉浸膏2g，黃豆餅粉0.5g，caco30.4g，加水到100ml，ph7.0。裝液量：500ml三角瓶裡裝100ml培養基，121℃滅菌30min。接種量：5％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管培養溫度：30℃培養時間：3天搖床轉速：260rpm搖瓶種子培養方法：將30％甘油菌絲冷凍管解凍後按照接種量5％(v/v)接搖瓶種子培養基中，待菌絲長起，有明顯掛壁現象且菌濃為12％以上，將1l搖瓶種子培養液，接入1000l種子罐中。30％甘油菌絲冷凍管的製作：在無菌狀態下，將滅菌後的甘油約30ml加入生長好的種瓶裡，搖勻製成約30％甘油菌絲懸浮液，然後分裝至小試管中(5ml/支)，放置-20℃低溫冰箱冷藏備用。3、種子罐種子培養基種子罐種子培養基比例與搖瓶種子培養基比例一致，加水至500l，ph調7.0。裝量：1000l種子罐內裝培養基500l，121℃滅菌30min。種子罐培養方法：培養好的1l搖瓶種子液接入種子罐中，30℃，4天。培養過程中控制罐壓：0.04mpa，攪拌速度120rpm，通氣量1：1(v/v)。培養後，鏡檢菌絲粗壯，染色深，無染菌，菌濃≥12％。4、發酵罐培養發酵培養基各組分在培養基中的比例為：每100ml培養基中含葡萄糖1g，麥芽糖5g，玉米澱粉4g，黃豆餅粉1.5g，酵母膏2g，大豆蛋白腖1.5g，硝酸鉀0.5g，nacl0.1g，caco30.2g，hz8186g，泡敵0.15％，其餘為水，ph7.0。裝量：10噸發酵罐內裝培養基6噸發酵罐培養方法：培養好的500l罐上種子液接入發酵罐中，30℃，12天。培養過程中控制罐壓：0.04mpa，攪拌速度160rpm，通氣量1：1.3(v/v)。發酵終點判斷：菌絲染色深，空泡較多，菌絲有斷裂、自溶現象。放罐過濾，得到hz818，經常規方法浸泡，檢測，非達黴素hplc歸一化含量為40％(見附圖3)。實施例3：發酵培養製備非達黴素(1)發酵培養非達黴素採用保藏號為cctccno：m2017311的菌株。搖瓶種子培養：每100ml培養基中含葡萄糖0.5g，玉米澱粉0.5g，大豆蛋白腖5g，酵母粉0.2g，牛肉浸膏1.5g，黃豆餅粉1g，caco30.1g，其餘為水，ph自然。接入5％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管，220rpm，28℃培養2天得種子液。種子罐培養：每100ml培養基中含葡萄糖0.5g，酵母粉0.5g，玉米澱粉1g，大豆蛋白腖5g，牛肉浸膏1.5％，棉籽粉1g，玉米漿粉1g，kh2po40.5g，caco30.1g，其餘為水，ph自然。種子接種量0.1％(v/v)，150rpm，30℃培養4天。發酵罐培養：每100ml培養基中含葡萄糖1g，麥芽糊精3g，酵母粉1g，麩質粉1g，可溶性澱粉4g，kh2po40.3g，feso4.7h2o0.2g，硝酸鉀0.5g，hz8183g，泡敵0.1％，caco30.1g，其餘為水，ph自然。種子接種量5％(v/v)，180rpm，30℃培養9天。放罐過濾，得到hz818，經常規方法浸泡，檢測，非達黴素hplc歸一化含量為42％(見附圖4)。實施例4：發酵培養製備非達黴素(1)發酵培養非達黴素採用保藏編號為cctccno：m2017311的菌株搖瓶種子培養：每100ml培養基中含蔗糖1g，可溶性澱粉2g，大豆蛋白腖0.5g，牛肉浸膏0.5g，麥芽浸出粉2g，黃豆餅粉1g，caco30.2g，其餘為水，ph6.8。接入3％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管，250rpm，28℃，培養3天得種子液。種子罐培養：每100ml培養基中含蔗糖1g，可溶性澱粉2g，大豆蛋白腖1g，牛肉浸膏1g，麥芽浸出粉2g，黃豆餅粉2g，caco30.2g，加水至500l，ph6.8。種子接種量0.2％(v/v),180rpm，26℃，培養4天。發酵罐培養：每100ml培養基含葡萄糖2g，麥芽糊精1g，酵母粉1g，棉籽粉0.5g，玉米澱粉2g，k2hpo40.3g，feso4.7h2o0.2g，尿素0.2g，硝酸鈉0.5g,caco30.4g，hb604g，泡敵0.15％，其餘為水，ph6.8。種子接種量8％(v/v)，150rpm，26℃培養10天。放罐過濾，得到hb60，經常規方法浸泡，檢測，非達黴素hplc歸一化含量為43％(見附圖5)。實施例5：發酵培養製備非達黴素(1)發酵培養非達黴素採用保藏編號為cctccno：m2017311的菌株搖瓶種子培養：每100ml培養基中含葡萄糖1.5g，玉米糊精3g，大豆蛋白腖3g，黃豆餅粉2g，酵母膏2g，caco30.3g，其餘為水，ph自然。接入5％(v/v)的30％甘油菌絲冷凍管，240rpm，30℃培養2天得種子液。種子罐培養：每100ml培養基中含葡萄糖2.0g，玉米澱粉4g，酵母粉2g，玉米蛋白粉3g，黃豆餅粉2g，酵母膏1g，caco30.3g，其餘為水，ph自然。種子接種量0.1％(v/v)，200rpm,28℃培養3天。發酵罐培養：每100ml培養基中含甘油0.5g，麥芽糊精4g，酵母粉1g，玉米蛋白粉3g，kh2po40.5g，硝酸鈉1g，mgso4.7h2o0.2g，mnso4.7h2o0.1g，pad9005g，泡敵0.2％，caco30.3g，其餘為水，ph7.0。種子接種量15％(v/v)，200rpm，30℃培養9天。放罐過濾，得到pad900，經常規方法浸泡，檢測，非達黴素hplc歸一化含量為41％(見附圖6)。當前第1頁12