基因表達抑制劑的製作方法
2023-08-13 09:06:56 1
專利名稱：基因表達抑制劑的製作方法
相關申請本申請要求2002年5月7日提交的臨時申請號為60/377,964的優先權權益。
發明
背景技術：
領域本發明涉及藥物和生物醫學研究。更具體地說，本發明涉及在真核細胞裡產生在本申請中統稱為siRNA的小髮夾RNAs(shRNAs)或幹涉RNAs(siRNAs)的表達系統，以及用於在真核細胞裡表達siRNAs的方法。本發明還涉及所述表達系統作為藥物產品的應用。
現有技術RNA幹涉(RNAi)是由與沉默基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)引發的動植物體中序列特異的轉錄後基因沉默(PTGS)過程。它是一種進化保守現象，並且是一種多步驟過程，其涉及通過未完全了解機制的反應在體內產生活性siRNAs。RNAi已被用作反向遺傳工具，在諸如植物、線蟲(Caenorhabditis elegants)和果蠅(Drosophila)等多種模式生物體中研究基因功能，在這些生物體裡大的dsRNAs能有效地引起基因特異沉默。
在哺乳動物細胞裡，30個或更長鹼基對的dsRNAs會激活抗病毒反應，導致RNA轉錄本的非特異性降解和寄主細胞蛋白質翻譯的總體中止。因此，長的dsRNA不是用於沉默哺乳動物細胞中特異基因的常用方法。近來，化學合成或用DNA模板和RNA聚合酶的生物學方法產生的不同siRNAs已被用於在人工培養的哺乳動物細胞裡下調靶基因的表達。在用過的方法中，人們總希望，使用包含轉錄啟動子和siRNAs的模板的DNA構建體，在體內和體外產生siRNAs。儘管在這種DNA構建體中可適用多種不同啟動子，但所用啟動子的類型仍保持局限於諸如U6啟動子和H1啟動子的III型RNA聚合酶III(Pol III)啟動子，以及諸如T7啟動子的需要病毒RNA聚合酶的啟動子。本發明提供了產生基因表達抑制劑的方法和設計，所述基因表達抑制劑能大大拓寬siRNAs的潛在應用。
發明概述本發明涉及產生用於在哺乳動物細胞中siRNAs表達的基因表達抑制劑的方法。這種抑制劑包含RNA聚合酶III(Pol III)轉錄啟動子元件、用於在寄主細胞裡轉錄的siRNAs的模板序列、及終止子序列。
所述啟動子是任何天然的或工程化的轉錄啟動子。作為這種啟動子的例子(不意味著局限於此)，在一個實施方案中，所述啟動子是I型Pol III啟動子，而在另一個實施方案中，所述啟動子是I型Pol III啟動子元件和III型Pol III啟動子元件的組合。在其它實施方案中使用了其它類型的啟動子。
siRNA的靶區域是在真核生物或病毒基因組中任何序列的轉錄本上的任意位置。所述終止子是任何天然的或工程化的序列，其通過Pol III或其它類型的RNA聚合酶終止轉錄。
這種基因表達抑制劑以任何路線、程序或方法，例如(但並不局限於)體內、體外、離體、電穿孔、轉染或病毒載體轉導，被運送進入真核細胞，包括(但並不局限於)哺乳動物、昆蟲、蠕蟲和植物。
圖1表示在哺乳動物細胞中用脊椎動物的I型Pol III啟動子產生siRNA的實施方案。具體地說，圖1表示在哺乳動物細胞中用脊椎動物的I型Pol III啟動子(5S rRNA基因啟動子及其它)產生siRNA的方法。「Abox」、「C box」、「D box」和「IE」是Pol III啟動子元件，「+1」是轉錄的起始位點，「Tn」是Pol III啟動子轉錄本的終止位點，並且箭頭表示轉錄的方向。siRNA模板由有義、間隔區、反義和終止子序列組成，並且在表達時產生髮夾dsRNA。「有義」是一段17-23核苷酸(nt)的有義序列，其與靶基因的序列相同，並且是髮夾dsRNA中莖的一條鏈的模板。「間隔區」是一段4-15核苷酸的序列，並且是髮夾dsRNA中莖鏈的環的模板。「終止子」是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉錄終止信號。
圖2表示在哺乳動物細胞中用脊椎動物的III型Pol III啟動子(U6基因啟動子、H1 RNA基因啟動子、Y1基因啟動子、Y3基因啟動子、RNA酶P基因啟動子及其它)產生siRNA的實施方案。DSE是Pol III啟動子的遠端序列元件(distal sequence element)；PSE是Pol III啟動子的近端序列元件(proximal sequence element)；TATA是一個啟動子元件；+1是轉錄的起始位點；箭頭表示轉錄的方向；siRNA模板是一段43-66核苷酸(nt)的工程化的插入物，其是用於相對於靶基因產生一髮夾dsRNA的模板；有義是來自靶基因的一段17-23核苷酸的有義序列，是髮夾中莖的一條鏈的模板；間隔區是一段4-15核苷酸的序列，是髮夾的環的模板；反義是一段17-23核苷酸的反義序列，是髮夾中莖的另一條鏈的模板；終止子是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉錄終止信號。
圖3表示在哺乳動物細胞中用工程化的包含I型和III型啟動子中的元件的Pol III啟動子產生siRNA的實施方案。「DSE」是III型Pol III啟動子的遠端序列元件(distal sequence element)。「PSE」是III型Pol III啟動子的近端序列元件(proximal sequence element)；「TATA」是一個III型Pol III啟動子元件。「A box」、「C box」、和「IE」是I型Pol III啟動子元件。「+1」是轉錄的起始位點。「Tn」是III型Pol III啟動子轉錄本的終止位點。箭頭表示轉錄的方向。siRNA模板由有義、間隔區、反義和終止子序列組成，並且在表達時產生髮夾dsRNA。「有義」是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，並且是髮夾dsRNA中莖的一條鏈的模板。間隔區是一段4-15核苷酸的序列，並且是髮夾dsRNA的環的模板；「反義」是一段17-23核苷酸反義序列，並且是髮夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板。終止子是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉錄終止信號。
圖4表示在哺乳動物細胞中用脊椎動物的兩個I型Pol III啟動子產生siRNA的實施方案，所述兩個I型Pol III啟動子分別啟動有義siRNA和反義siRNA轉錄。「A box」、「C box」、「D box」和「IE」是Pol III啟動子元件。「+1」是轉錄的起始位點。「Tn」是Pol III啟動子轉錄本的終止位點。箭頭表示轉錄的方向。「有義siRNA模板」是一段22-28核苷酸的工程化的插入序列，其是用於相對於靶基因產生一個有義單鏈RNA(ssRNA)的模板，並且由有義和終止子序列組成。「反義siRNA模板」是一段22-28核苷酸的工程化的插入序列，其是用於相對於靶基因產生一個反義ssRNA的模板，並且由反義和終止子序列組成。「有義」是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，並且是髮夾dsRNA中莖的一條鏈的模板。「間隔區」是一段4-15核苷酸的序列，並且是髮夾dsRNA的環的模板。「反義」是一段17-23核苷酸反義序列，並且是髮夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板。「終止子」是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉錄終止信號。
圖5表示在哺乳動物細胞中用工程化的T7聚合酶和T7啟動子產生siRNA的實施方案。「啟動子」是一個組成型的或依賴環境的啟動子，例如可誘導啟動子或細胞類型特異的啟動子；「T7聚合酶基因」是一段編碼T7聚合酶的序列。T7啟動子是一種T7啟動子。「+1」是轉錄的起始位點。箭頭表示轉錄的方向。siRNA模板由有義、間隔區、反義和終止子序列組成，並且在表達時產生髮夾dsRNA。「有義」是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，並且是髮夾dsRNA中莖的一條鏈的模板。「間隔區」是一段4-15核苷酸的序列，並且是髮夾dsRNA的環的模板。「反義」是一段17-23核苷酸的反義序列，並且是髮夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板。「終止子」是T7聚合酶的工程化的終止子。
圖6表示在哺乳動物細胞中用單個的多轉錄單元構建體產生多個siRNA的實施方案。「單元」是一個包含脊椎動物的I型Pol III啟動子和siRNA模板的轉錄單元。「A box」、「C box」、「D box」和「IE」是Pol III啟動子元件。「+1」是轉錄的起始位點。「Tn」是Pol III啟動子轉錄本的終止位點。箭頭表示轉錄的方向。siRNA模板的結構由有義、間隔區、反義和終止子序列組成，並且是一段設計的插入序列，其是用於相對於靶基因產生一個髮夾dsRNA的模板。「有義」是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，並且是髮夾dsRNA中莖的一條鏈的模板。「間隔區」是一段4-15核苷酸的序列，並且是髮夾dsRNA的環的模板。「反義」是一段17-23核苷酸的反義序列，並且是髮夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板。「終止子」是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉錄終止信號。多個siRNA可以靶向一個基因的單個區域、一個基因的不同區域、或多個基因中每一個基因的一個區域。
本發明的詳細描述提供以下的詳細說明是為了幫助本領域的技術人員應用本發明。不能視作對本發明的限制。
本發明旨在通過製造和使用DNA構建體，選擇性地抑制哺乳動物中靶基因的表達，所述構建體包含RNA聚合酶III(Pol III)轉錄啟動子元件、將在寄主細胞裡轉錄的siRNAs的模板序列、和終止子序列。
啟動子是任何天然的或工程化的轉錄啟動子。在一個實施方案中，啟動子是I型Pol III啟動子。I型啟動子的必要元件，如「A box」、「C box」、「D box」和「IE」都包含在DNA構建體中。在這個實施方案中，siRNA模板置於「D box」和「A box」之間。在另一個實施方案中，啟動子是I型Pol III啟動子元件和III型Pol III啟動子元件的組合。在這個實施方案中，兩種啟動子的必要元件，如I型啟動子的「A box」、「C box」、和「IE」，以及III型啟動子的「DSE」、「PSE」和「TATA」都包含在DNA構建體中，其中「DSE」、「PSE」和「TATA」位於「+1」位點的上遊區域，「A box」、「C box」、和「IE」位於「+1」位點的下遊區域。任何在哺乳動物細胞中起作用的啟動子都適用於本發明。對現有啟動子做的修飾，如增加可誘導或增強元件也適用於本發明。
siRNA的靶區域是哺乳動物或病毒基因組的任何序列的轉錄本的任何位置。在一些實施方案中，編碼具有「髮夾」結構的RNA分子的siRNA的模板包含靶基因的有義和反義序列。在其他實施方案中，有義序列的模板和反義序列的模板由不同啟動子啟動。
終止子是任何天然的或工程化的序列，通過Pol III或其它類型的RNA聚合酶終止轉錄，例如(並不局限於)，DNA分子中一段4個或更多胸腺嘧啶脫氧核苷殘基。
任何包含啟動子、RNA的模板和終止子的轉錄單元都適用於與另一個單元或多個單元一起構建到作為抑制劑的DNA分子裡。在一個實施方案中，表示了多轉錄單元的構建體。多於一種的基因表達抑制劑(DNA分子)適用於一起被導入到哺乳動物細胞中。在同一個哺乳動物細胞裡由這些多轉錄單元或共-導入方法產生的siRNAs使得抑制劑能靶向於一個靶RNA分子的一個特定區域、一個靶RNA分子的多個區域、或多於一個的RNA分子的多個區域。
上述這種DNA構建體可以被構建作為任何合適的克隆載體或表達載體的一部分。然後抑制劑可以任何路線、程序或方法，例如體內、體外、離體、注射、電穿孔法、轉染或病毒載體轉導，被運送進細胞、組織或生物體。
實施例實施例1人類5S rDNA調節序列的克隆用於下面提供的實驗設計的啟動子是人類5S rRNA基因。該序列在資料庫裡提供Genebank登錄號X12811。5S rRNA啟動子包含下遊的Abox和C box和上遊的D box。在圖1中，在5S rRNA的起始位點和A box之間的49個核苷酸的序列要被幹涉RNA序列替換。用2個步驟產生包含上遊和下遊box的盒(cassette)。A box和C box的克隆可以由化學合成得到。上遊的D box由PCR得到。
重組的5S rRNA的D box的克隆是通過PCR得到，其中使用了正向引物(AACggatccaaaacgctgcctccgcga)和反向引物(TAGACGCTGCAGGAGGCGCCTGGCT)，然後其被亞克隆到pBS2SK載體的BamHI和PstI位點。A/C box可以被作為頂鏈(top strand)(AGAAGACGAagctaagcagggtcgggcctggttagtacttggatgggagaccgcctgggaataccgggtgctgtaggctttttg)和底鏈(bottom strand)(TCGACAAAAAGCCTACAGCACCCGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAACCAGGCCCGACCCTGCTTAGCTTCGTCTTCT)合成，然後被退火、亞克隆到克隆的D box下遊的EcoRV和SalI位點。退火的DNA片斷工程化為帶有BbsI位點。
實施例2RNAi序列的插入和克隆RNAi盒(cassette)以兩條鏈合成，並克隆到PstI位點和BbsI位點之間。RNAi盒(cassette)設計如下5』GC(N19)TTTCGG(61N)TTTTT3』3』ACGTCG(61N)AAAGCC(N19)AAAAATCGA5』N19是從靶基因的轉錄區域挑選出的19核苷酸的靶DNA序列。61N是N19的反向互補鏈。轉錄從N19靶序列的第一個鹼基開始，終止於polyT。
實施例3靶向於乳腺癌的ErbB2/Her2ErbB2/Her2基因在約30％的人類乳腺癌裡擴增，導致癌細胞的快速生長和轉移。Herceptin是Genentech公司生產的一種能阻遏ErbB2作用的抗體，與只進行化療的病人相比，只有Herceptin當與化療聯用給藥時能使ErbB2陽性的乳腺癌病人減緩轉移乳腺疾病的發展，提高總存活率。通過本發明研發的產生靶向於ErbB2的siRNA的方法，能夠提供一種可供選擇的治療方法。
實施例4靶向於慢性粒細胞性白血病(CML)和其他癌症的BCR-AbI酪氨酸激酶BCR-AbI是一種在CML中經常產生的融合基因產物。Novartis公司研製的ST1571又稱Gleevec，新近被批准為靶向於CML中的BCR-AbI的抗癌藥物。通過本發明研發的產生針對融合基因BCR-AbI的siRNAs的方法，不幹涉BCR或AbI基因的正常表達，從而應有以基因治療方法治療CML的很大潛力。
實施例5靶向於B型肝炎病毒(HBV)應用本發明靶向於HBV基因組的不同位點，能夠提供一種強效的基因治療方法以治療B型肝炎病人。
實施例6靶向於I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)應用本發明靶向於HIV基因組的不同位點，能夠提供一個強效的基因治療方法以治療HIV感染病人。一個能同時靶向於多個位點，例如env、gag、pol、Vif、nef、vpr、vpu和tat的多單元抑制劑，可適用於解決HIV基因組變異引起的抗性。
權利要求
1.一種重組DNA構建體，包含至少一個轉錄單元，該轉錄單元含有轉錄啟動子、製造RNA分子的模板序列和轉錄終止子。
2.如權利要求1所述的構建體，其中天然的I型Pol III啟動子是轉錄的起始機制。
3.如權利要求1所述的構建體，其中工程化的I型Pol III啟動子是轉錄的起始機制。
4.如權利要求1所述的構建體，其中包含I型Pol III啟動子的一個或多個必要元件的天然啟動子是轉錄的起始機制。
5.如權利要求1所述的構建體，其中包含I型Pol III啟動子的一個或多個必要元件的工程化啟動子是轉錄的起始機制。
6.如權利要求1所述的構建體，其中能通過任何哺乳動物或病毒的RNA聚合酶起始轉錄的天然啟動子是轉錄的起始機制。
7.如權利要求1所述的構建體，其中能通過任何哺乳動物或病毒的RNA聚合酶起始轉錄的工程化啟動子是轉錄的起始機制。
8.如權利要求1所述的構建體，其中所述模板包括，能產生全長或部分RNA分子的序列，所產生的RNA分子能通過RNA介導的下調作用下調靶基因的表達，包括但不局限於RNAi。
9.權利要求8的構建體，其中所述靶基因是選自哺乳動物和病毒基因組的基因。
10.如權利要求1所述的構建體，其中所述轉錄單元與多於一個的其它這種單元一起構建到同一個DNA分子裡，以靶向於一個或多個基因的相同或不同的區域。
11.包含如權利要求1所述構建體的克隆或表達載體。
12.包含權利要求1的構建體的分子、細胞、組織、器官、生物體或其它任何工程化的材料。
13.如權利要求1所述的構建體，其中所述模板包含能產生全長或部分RNA分子的序列，所產生的RNA分子能結合其靶(例如DNA、RNA、蛋白質或任何其它形式的分子)並調節這些靶的功能。
14.一種製造用於真核細胞的基因抑制劑的方法，這種方法包括使用重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含至少一個轉錄單元，所述轉錄單元包含轉錄啟動子、用於製造RNA分子的模板序列和轉錄終止子。
全文摘要
本發明提供一種通過使用一種重組DNA構建體製造用於真核細胞的基因抑制劑的方法，這種重組DNA構建體包含至少一個轉錄單元，該轉錄單元包括轉錄啟動子、用於製造RNA分子的模板序列、和轉錄終止子。RNA介導的基因抑制的機制包括，但並不局限於，RNA幹涉(RNAi)。也揭示了該抑制劑作為生物醫學研究的工具和醫藥產品的應用。
文檔編號C07H21/04GK1780920SQ03826448
公開日2006年5月31日 申請日期2003年5月12日 優先權日2003年5月12日
發明者校迎憲, 馮新華 申請人:波多瑪克製藥有限公司