一種過表達ciapin1蛋白的細胞系及其製備方法和應用的製作方法
2023-08-13 11:24:11 1
一種過表達ciapin1蛋白的細胞系及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種過表達CIAPIN1蛋白的細胞系及其製備方法和應用；該細胞系名稱為BHK-21CIAPIN1+，保藏編號為CCTCCC2014149，其表達CIAPIN1蛋白的量是正常BHK-21細胞的10倍；該細胞系的製備方法為將CIAPIN1的cDNA序列插入真核表達質粒pIRESneo中，再轉染BHK-21細胞；經含G418培養液篩選後細胞經極限稀釋法獲得陽性單克隆細胞，即為永生化過表達CIAPIN1蛋白的細胞系。本發明細胞系培養狂犬病病毒可顯著影響病毒增值滴度，對該病毒的高效培養及其滅活疫苗的生產意義重大，本發明細胞系在狂犬病病毒的培養中具有很好的應用前景。
CCTCC NO:C2014149
20140730
【專利說明】—種過表達CIAPI NI蛋白的細胞系及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物技術和細胞遺傳學領域，涉及一種過表達CIAPIN1蛋白的細胞系及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]CIAPIN I (cytokine induced apoptosis inhibitor I)又稱 anamorsin,是一個新近發現與凋亡相關的分子。CIAPIN I在人類基因定位於16號染色體長臂。由8個外顯子和7個內含子組成，相對分子質量為39000。在其N端60-99胺基酸位點發現genericmethyl transferase profile結構域，C端部分序列與保守的基因C0G5636同源,246-277胺基酸有Cx2Cx24Cx2C鋅帶結構域。CIAPIN I在小鼠基因定位於8號染色體，成熟mRNA長度為 1515bp, CDS 長度為 929bp。
[0003]Shibayama等2004年第一次報導了該分子為細胞因子誘導的抗凋亡分子。研究還表明CIAPIN I是RAS信號轉導通路中的一個新調節分子，Ras信號途徑是與許多細胞增殖有關的信號轉導通路，該通路獨立於凋亡調節分子caspase家族、Bcl_2家族等。Kanakura等發現CIAPIN I可調節造血功能，CIAPIN I基因在小鼠胚胎期IL-3誘導紅系定向幹細胞分化過程中起至關重要的作用，CIAPIN I基因敲除小鼠由于于貧血而於胚胎期死亡。新近研究在成功製備了 CIAPIN I的單克隆抗體工作基礎上，發現CIAPIN I廣泛分布於胎兒和成人的正常組織中，特別是在分化型組織和活性代謝組織中具有高表達。Hao等確定了CIAPIN I的亞細胞定位為胞質、胞核，濃集於核仁。Li等通過腺病毒載體表達CIAPIN I蛋白，以及通過SiRNA等技術證明了，CIAPIN I蛋白的表達變化與肝細胞癌、胃癌密切相關。Hao等研究發現CIAPIN I蛋白與腎癌、胃癌相關。Wang等人發現，肺癌組織中CIAPIN I基因表達下調可能與肺癌發生密切相關，CIAPIN I基因可能通過下調CyclinD 1、上調P27幹預了細胞周期，從而抑制腫瘤的生長。上述研究結果揭示，CIAPIN I對細胞的增殖及分化具有重要的調控作用，在某些癌症發生時表達異常，提示CIAPIN I基因的表達與腫瘤的發生發展有密切聯繫。
[0004]目前，關於CIAPIN1研究的報導還非常有限，主要集中在腫瘤相關性方面，然而這些結果業已證明CIAPIN I對細胞的增殖及分化具有重要的調控作用，在細胞凋亡與抗凋亡中發揮重要作用。在前期的研究中，我們也發現狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染N2a細胞時可引起CIAPIN1蛋白上調表達，並且細胞適應性好的RV毒株感染時誘導的CIAPIN1蛋白上調表達量更高。這提示我們，不同細胞適應性的RV毒株，感染細胞時在細胞內增殖和代謝的速度不同，因而引起了不同的應答結果，導致CIAPIN1等蛋白的差異表達，這說明RV感染時CIAPIN1發揮著關鍵的調節作用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種過表達CIAPIN1蛋白的細胞系。
[0006]本發明的另一目的在於提供一種過表達CIAPIN1蛋白的細胞系的製備方法。
[0007]本發明的再一目的在於提供一種過表達CIAPIN1蛋白的細胞系的應用。
[0008]本發明所採取的技術方案是:
一種過表達CIAPIN1蛋白細胞系的製備方法，包括以下步驟:
O構建重組真核表達質粒=RT-PCR擴增CIAPIN1蛋白的cDNA序列，並將其插入真核表達質粒PlRESneo中，獲得重組真核表達質粒pIRES_CI ；
2)轉染:將上述重組真核表達質粒轉染BHK-21細胞；
3)篩選:將轉染後的細胞以含G418的培養液進篩選培養；
4)獲得永生化過表達CIAPIN1蛋白的細胞系:將經篩選培養的細胞經極限稀釋法獲得陽性單克隆細胞，其中能過表達CIAPIN1蛋白的即為永生化過表達CIAPIN1蛋白的細胞系。
[0009]進一步的，步驟I)中編碼CIAPIN1蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]進一步的，上述CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR擴增引物為:
CIAPIN1-F: GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC (SEQ ID NO:2)；
CIAPIN1-R: GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT (SEQ ID NO:3)。
[0011]進一步的，步驟2)中的轉染為:用FuGENE轉染試劑介導重組真核表達質粒PlRES-CI傳染匯合度為70-80%的單層BHK-21細胞，轉染後的細胞用含5?10%(V/V)小牛血清的DMEM培養基進行培養。
[0012]進一步的，步驟3)中G418的濃度為500μ g/ml。
[0013]一種過表達CIAPIN1蛋白的細胞系，其名稱為BHK-21 CIAPIN1+，已保藏於中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC C2014149。
[0014]進一步的，上述細胞系表達CIAPIN1蛋白的量是BHK-21細胞的8倍。
[0015]本發明的有益效果是:
I)本發明的細胞系可永久化的高量表達CIAPIN1蛋白，且易培養，增殖速度快，可無限擴大，性質穩定，易保存，方法技術成熟，重複性強，一般研究人員即可完成，具有遺傳穩定性。
[0016]2)本發明過表達CIAPIN1蛋白的細胞系及其製備方法具有深遠的研究性和廣泛的應用性，包括研究宿主細胞免疫反應具有穩定性以及可表達所需蛋白的哺乳動物細胞的永生化，以及細胞和CIAPIN1蛋白對狂犬病病毒增殖滴度的影響。
[0017]3)在製備過表達CIAPIN1蛋白細胞系的具體操作中，細胞攝取、整合、表達外源基因往往都是小概率事件，只有在特定的操作條件下才能提高這些小概率事件的發生；另外，外源基因整合到基因組中的概率小，而且是隨機整合到基因組中的，故轉染後的不同細胞表達的目的蛋白的量存在很大差異，且隨著培養時間的延續，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會佔據優勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少；本發明方法通過優化每一步的操作，明顯提高了基因重組細胞系的發生率，可獲得許多高表達CIAPIN1蛋白的細胞系；並且經過篩選和驗證，本發明獲得一株超高表達CIAPIN1蛋白的細胞系(表達量是BHK-21細胞的8倍)，其分類命名為敘利亞倉鼠腎細胞系BHK-21 CIAPIN1+,已於2014年7月30日保藏於中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏單位地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:C2014149，經過多代的代培養仍具有走超高效的過表達CIAPIN1蛋白能力，且穩定性很好，是一株永久化過表達CIAPIN1蛋白的細胞系。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是G418壓力篩選出的單克隆細胞株圖；
圖2 Western Blot檢測驗證細胞系過表達CIAPIN1蛋白的情況。
【具體實施方式】
[0019]一種過表達CIAPIN1蛋白細胞系的製備方法，包括以下步驟:
O構建重組真核表達質粒=RT-PCR擴增CIAPIN1蛋白的cDNA序列，並將其插入真核表達質粒PlRESneo中，獲得重組真核表達質粒pIRES_CI ；
2)轉染:將上述重組真核表達質粒轉染BHK-21細胞；
3)篩選:將轉染後的細胞以含G418的培養液進篩選培養；
4)獲得永生化過表達CIAPIN1蛋白的細胞系:將經篩選培養的細胞經極限稀釋法獲得陽性單克隆細胞，其中能過表達CIAPIN1蛋白的即為永生化過表達CIAPIN1蛋白的細胞系。
[0020]優選的，步驟I)中編碼CIAPIN1蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0021]優選的，CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR擴增引物為:
CIAPIN1-F: GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC (SEQ ID NO:2)；
CIAPIN1-R: GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT (SEQ ID NO:3)。
[0022]優選的，步驟2)中的轉染為:用FuGENE轉染試劑介導重組真核表達質粒pIRES-CI傳染匯合度為70-80%的單層BHK-21細胞，轉染後的細胞用含5_10%(v/v)小牛血清的DMEM培養基進行恢復培養。
[0023]優選的，步驟2)轉染時的具體操作為:選用0D26(i/0D28(i為1.8?2.0的重組真核表達質粒pIRES-CI，先將pIRES-CI與FuGENE按質量體積比10 μ g:24 μ L混勻孵育30min後，再加入至匯合度為75%的單層BHK-21細胞中，輕晃搖勻，37°C，5% CO2飽和溼度轉染培養5?12h後，換成含5% (v/v)血清的DMEM培養基進行恢復培養40?50小時使細胞貼壁，每隔24h換一次培養基。
[0024]優選的，步驟3)中G418的濃度為500 μ g/ml。
[0025]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。
[0026]實施例1重組pMD-CI克隆載體的構建和測序 1、寡核苷酸引物的設計與合成
根據GenBank中CIAPIN1核苷酸序列設計併合成克隆CIAPIN1 cDNA的引物: CIAPIN1-F: 5，-GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC』，(下劃線部分為 EcoR V 酶切位點)； CIAPIN1-R: 5，-GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點)。
[0027]2、BHK-21細胞總RNA的提取
50ml細胞培養瓶的BHK-21細胞(乳倉鼠腎細胞,Baby Hamster Syrian Kindey)直接加ImL Trizol,室溫放置5min,使其充分裂解，12 000r/min離心5min,取上清,按200 μ L氯仿/mL Trizol加入氯仿,振蕩混勻室溫放置15min,4°C 12 000r/min離心15min,吸上清,至另一離心管中，按0.5mL異丙醇/mL Trizol加入異丙醇混勻，室溫放置5?1min, 4°C 12000r/min離心1min,棄上清,RNA沉於管底。按ImL 75%乙醇/mT, Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，4°C 12 OOOr/min離心1min,棄上清，室溫乾燥後,加20μ L RNase-free的水溶解，一 80°C保存備用。
[0028]3、CIAPIN1基因片段全長cDNA合成
總 RNA 5μ L，70°C加熱 lOmin，冰浴 5min，加 200U 反轉錄酶M-MLV，25pmol/μ L 引物 F、25pmol/y L 引物 R 以及 10mmol/L dNTPs 各 I μ L，42°C反應 60min，即得到 cDNA。70°C水浴1min,滅活反轉錄酶。取反轉錄產物 10 μ L, 1XPCR buffer 4 μ L>25mmol/L MgCL24 μ L>引物 CIAPIN1-F (25pmol/y L)、CIAPIN1-R (25pmol/μ L)及 lOmmol/L dNTPs 各 0.5 μ L，加水30 μ L，煮沸變性1min,冰浴5min,加Taqplus DNA聚合酶0.25 μ L (5U/ μ L)混勻，具體反應條件為94°C變性30sec，57°C退火40sec、72°C延伸90sec，25個循環後72°C再延伸1min,以1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果。
[0029]4、重組pMD-CI載體的構建和驗證
將獲得的PCR產物經膠回收純化後直接克隆至pMD18-T載體質粒。轉化大腸桿菌JM109。通過氨苄青黴素抗性篩選，獲得重組質粒命名為pMD-CI。經酶切和PCR初步鑑定後，陽性重組質粒送交大連寶生物工程公司進行序列測定。
[0030]實施例2重組真核表達載體pIRES-CI的構建 1、目的片段回收
稱取Ig瓊脂糖於10mL IXTAE中加熱溶解；冷卻至40_50°C時加入終濃度(V/V)為
0.1%的EB，混勻後倒膠；插入膠回收齒梳，室溫冷卻備用；將上樣混合物(90 μ L CIAPIN1cDNA的PCR產物+1yL 1XLoading Buffer)加於上樣孔中。以5V/cm的電壓，電泳至所需時間後，取出凝膠，在透射紫外燈上觀察，或拍照。在紫外燈下切下目的條帶，反覆凍融3次，碾碎，分別用酚、氯仿抽提，無水乙醇沉澱，75%乙醇洗漆，溶於適量的水中，-20°C保存備用。
[0031]2、目的片段與真核表達載體pIRESneo的連接反應
取約20ng用限制性內切酶水解的載體，加5?10倍量的目的DNA片段、10 X連接緩衝液I μ L，加蒸餾水至10 μ L，最後加入0.1?0.2weiss單位的T4DNA連接酶，置16°C水浴過夜，取0.5-1 μ L連接反應液熱激轉化疋coli感受態細胞。粘端連接，載體與片段的摩爾比約為1:5 ;平端連接，載體與片段的摩爾比約為1:8 ;PCR產物與pIRESneo載體的連接，載體與片段的摩爾比約為1:8。
[0032]3、重組真核表達載體pIRES-CI的驗證
將上述轉化後的感受態細胞進行篩選培養，挑取陽性菌落擴大培養，然進行酶切、PCR和測序驗證，驗證正確的陽性重組質粒即為重組真核表達載體pIRES-CI。
[0033]實施例3過表達CIAPIN1蛋白的細胞系的建立
1、FuGENE介導pIRE-CI真核表達載體轉染BHK-21細胞
I)準備質粒:重組質粒PlRE-CI經苯酚/氯仿反覆抽提純化，紫外分光光度計測其OD26tZOD28tl為1.8?2.0，質粒用前需過濾除菌。
[0034]2)轉染細胞的準備:在370C >5% CO2條件下培養BHK-21細胞18_24h，待細胞匯合度為75%時，開始轉染。
[0035]3)脂質體/DNA複合物的製備:在500yL無菌Eppendorf管中配液。A液:將10 ygDNA稀釋於250 μ L無血清無雙抗的MEM培養其中。B液:將24 μ L FuGENE稀釋於250 μ L無雙抗無血清的MEM培養基中。混合AB兩液，輕微震蕩，充分混勻後，室溫放置30min,獲得脂質體/DNA複合物，此時如果溶液渾濁，不影響轉染。如果出現沉澱，則停止轉染。
[0036]4)在DNA和FuGENE作用過程中，將匯合度為75%的細胞用無血清無雙抗的MEM培養基清洗三次，加入2mL無血清無雙抗的MEM培養基，然後將作用完畢的DNA/FuGENE混合物，加入到細胞上清中，輕晃搖勻，37°C，5% CO2飽和溼度培養5?12h後，換入含5% (v/v)血清的DMEM培養基。
[0037]2、G418抗性細胞的篩選
轉染後的BHK-21細胞在37°C，5% CO2培養36小時，再傳入6孔板中(轉入6孔板前，細胞在96孔板中培養)，12h後，待細胞貼壁後，加入G418濃度為500 μ g/ml的MEM培養基繼續培養，每三天換一次液，直至出現細胞克隆。
[0038]3、獲得永生化過表達CIAPIN1蛋白的細胞系:
將6孔板中每孔加入含5%血清的MEM培養基，把長出細胞克隆的6孔板，在燈光下觀察，可見單個細胞克隆(如圖1所示)，呈明顯的不透明狀，用記號筆畫圈標記克隆的位置，在超淨工作檯上用無菌槍頭挑取細胞克隆，打入96孔板，進行極限稀釋法，依次傳入24孔板，6孔板，30mL細胞培養瓶，50mL細胞培養瓶，逐步擴大培養，擴大培養時，保持G418的濃度，血清添加量為5% (v/v)。
[0039]實施例4過表達CIAPIN1蛋白的細胞系的RT-PCR鑑定
提取過表達CIAPIN1蛋白的細胞系總RNA，方法同實施例1，並對總RNA進行定量，選取同樣模板數量RNA進行RT-PCR。RT-PCR步驟同實施例1，對擴增結果進行半定量比較，選取PCR條帶結果明顯高於正常對照的組別為過表達細胞系。
[0040]在實驗探索過程中，參考了許多真核細胞穩定轉化的方法，尤其是有關穩定轉化BHK-21細胞過表達目的蛋白的實驗方法，不僅獲得陽性單克隆細胞的概率低，而且假陽性高，即獲得正確的含目的基因的重組BHK-21細胞，但RT-PCR檢測顯示細胞內目的基因RNA表達量與正常的BHK-21細胞相比，並沒有明顯的增加，不具有後續的利用價值。
[0041]本發明方法，在現在技術的基礎上，採用特定的引物、特定的轉染方法(尤其是轉染時各細節的控制)、特定的G418篩選濃度等特定條件參數，才能最有利於cDNA插入宿主細胞基因組中，提高了轉染率，顯著促進了出現具有高表達效果重組細胞系的概率。
[0042]實施例5過表達單克隆細胞系的Western Blot鑑定
1、蛋白質樣品的製備
棄去培養液，預冷PBS漂洗兩次；空幹細胞培養瓶中的所有液體，槍抽；加入RIPA細胞裂解液(華特生H10200 107細胞/mL) ；4°C放置，間斷顛倒，至細胞完全脫落；每隔5?6分鐘振蕩器輕柔振蕩一次，共4次；10，000Xg，4°C離心5分鐘，取上清；分裝，標記，-80 V凍存備用。
[0043]2、蛋白質樣品的定量
使用BCA蛋白質定量試劑盒對各個所篩選的細胞蛋白質樣品進行定量，依照說明書進行。
[0044]3、過表達單克隆細胞系的Western Blot鑑定
配製15%的SDS-PAGE分離膠，迅速在兩玻璃板的間隙中灌注，留出灌注積層膠所需空間，並在分離膠溶液上覆蓋一層0.1% SDS，待分離膠完全聚合後傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌數次以除去未聚合的丙烯醯胺，之後用濾紙將殘留液體吸淨，同時將配製好的5%的積層膠灌注並立即插入乾淨的TefLon梳子，積層膠聚合後小心拔出梳子，用電泳緩衝液小心衝洗電泳孔道。將製備的適量體積的質粒和等體積2X上樣緩衝液混合後在100°C加熱5min以使混雜在質粒中的細菌蛋白質變性，用微量進樣器上樣，3(^g樣品和低分子量標準蛋白Marker ;對稱依次再加相同的樣品，然後用IX上樣緩衝液補齊後按8V/cm進行電泳，待染料前沿進入分離膠時將電壓提高到15V/cm，直至染料到達分離膠底部，關閉電源，小心取出凝膠並切除積層膠，然後在中間將凝膠切開，標記後分別用考馬思亮藍和銀鹽進行染色。
[0045](I)將真核過表達CIAPIN1的細胞經SDS-PAGE電泳，方法同上。
[0046](2)電轉移切出含待轉移的凝膠，包括寬分子量預染蛋白Marker，剪6張同樣大小的濾紙和I張硝酸纖維素膜，將它們浸泡於轉移緩衝液中，在塑料支架上依次疊放溼潤的海綿、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙和海綿，使其相互對齊，且各層之間無氣泡存在，將支架加緊插入電泳槽中，硝酸纖維素膜一側接陽極，凝膠一側接陰極，32V電壓4°C轉移14?16h。
[0047](3)封閉電轉移結束後，加封閉液浸泡硝酸纖維素膜，室溫封閉2小時或4°C過夜，同時對凝膠染色，檢查蛋白轉移是否完全。封閉後用洗滌緩衝液漂洗硝酸纖維素膜3次，每次5min。
[0048](4)與一抗結合根據上樣孔位置將硝酸纖維素膜切割成條，蛋白Marker纖維素膜條置於不含吐溫的洗滌液中，留存備用。其它轉印陰性對照(BHK-21細胞)，然後與1:200倍稀釋的CIAPIN1抗體(Santa Clusz)於室溫平緩搖動反應2?4h，回收抗體，將纖維素膜浸泡於大量洗滌緩衝液中，平緩搖動洗滌3次，每次lOmin。
[0049](5)與二抗結合以HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體，分別與相應纖維素膜條反應。用洗滌緩衝液1:5 OOO稀釋酶標二抗，將膜浸泡在二抗反應液中，室溫平緩搖動反應2?4小時或4°C過夜，回收二抗，洗膜，方法同(4)。
[0050](6 )顯色TMB顯色液至適當，拍照。
[0051]Western Blot結果如圖2所示，圖2A為2株(I號和2號)正常BHK-21細胞以及6株(3?8號)不同的G418抗性壓力篩選的BHK-21細胞系GAPDH內參蛋白Western Blot結果；圖2B為Western Blot檢測2株(I號和2號)正常BHK-21細胞對照以及G418抗性壓力篩選出的6株(3?8號)不同細胞系中CIAPIN1蛋白的表達情況；M為蛋白質Marker，綜合比較圖A和B，與對照組相比(I號和2號)可知，只有3、4、5號細胞系中CIAPIN1蛋白具有較明顯的過表達現象，其中5號的過表達效果最明顯，通過定量分析5號的CIAPIN1蛋白表達量是對照組的8倍，該細胞系命名為BHK-21 CIAPINi+,已於2014年7月30日保藏於中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC C2014149。
[0052]從上述結果可以看出，要獲得超高表達CIAPIN1蛋白的細胞系的概率是非常低的；因為①外源基因進入細胞後，部分能夠通過細胞質進入細胞核內，根據細胞類型，至多80%的進入核內的外源DNA得到瞬時表達極少數情況下，進入細胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，最終整合進細胞染色體，細胞基因組自由部分表達，所以整合併不一定意味著表達，只有整合到表達區的基因才會表達，而且整合到不同的染色體區段的外源基因的表達的量也是不同的，③而且隨著培養時間的延續，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會佔據優勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。由於攝取、整合、表達外源基因都是小概率事件，所以獲得高表達CIAPIN1蛋白的細胞系更是小概率事件，只有通過優化每一步的操作，才能促進這種小小概率事件發生。
[0053] 應用
目前，關於CIAPIN1研究的報導還非常有限，主要集中在腫瘤相關性方面，然而這些結果業已證明CIAPIN I對細胞的增殖及分化具有重要的調控作用，在細胞凋亡與抗凋亡中發揮重要作用。在前期的研究中，我們也發現狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染N2a細胞時可引起CIAPIN1蛋白上調表達，並且細胞適應性好的RV毒株感染時誘導的CIAPIN1蛋白上調表達量更高。這提示我們，不同細胞適應性的RV毒株，感染細胞時在細胞內增殖和代謝的速度不同，因而引起了不同的應答結果，導致CIAPIN1等蛋白的差異表達，這說明RV感染時CIAPIN1發揮著關鍵的調節作用。那麼過表達CIAPIN1蛋白的細胞系在狂犬病病毒的培養中具有很好的應用前景，使用本發明過表達CIAPIN1蛋白的BHK-21細胞系培養狂犬病病毒可顯著影響病毒增值滴度，這可能對狂犬病病毒的高效培養及其滅活疫苗的生產意義重大。
【權利要求】
1.一種過表達(:1八?1附蛋白細胞系的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟: 1)構建重組真核表達質粒:奶-？0？擴增八?I附蛋白的⑶嫩序列，並將其插入真核表達質粒？1即31160中，獲得重組真核表達質粒⑷卩四-口 ； 2)轉染:將上述重組真核表達質粒轉染8^-21細胞； 3)篩選:將轉染後的細胞以含6418的培養液進篩選培養； 4)獲得永生化過表達八?I附蛋白的細胞系:將經篩選培養的細胞經極限稀釋法獲得陽性單克隆細胞，其中能過表達八?爪1蛋白的即為永生化過表達八?I附蛋白的細胞系。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:步驟1)中編碼八?1附蛋白的⑶嫩序列如820 10勵:1所示。
3.根據權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於八?1附蛋白⑶嫩的奶-？0？擴增引物為:
?:1八？1X1-？: 6^1^X0^X66^66^6X1X666^X0X00 (820 10 勵:2)；
?:1 八？爪1-尺:6^11001^660^100166^11601^1 (820 10 ^0:3?0
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:步驟2)中的轉染為:用而⑶肥轉染試劑介導重組真核表達質粒傳染匯合度為70-80%的單層8皿-21細胞，轉染後的細胞用含5109(7/4小牛血清的0121培養基進行培養。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:步驟3)中6418的濃度為500^邑/1111。
6.權利要求1所述的一種過表達八?I[蛋白的細胞系，其名稱為8皿-21已保藏於中國典型培養物保藏中心保藏編號為⑶!!!: 02014149。
7.根據權利要求6所述的一種過表達八?I附蛋白的細胞系，其特徵在於:該細胞系表達仙I附蛋白的量是8皿-21細胞的8倍。
8.權利要求1?7任一所述的過表達八?I附蛋白的細胞系在狂犬病病毒培養中的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK104450781SQ201410547146
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月15日 優先權日:2014年10月15日
【發明者】王曉虎, 向華, 黃元, 陳晶, 陳遠媚 申請人:廣東省農業科學院動物衛生研究所