一種螢光定量PCR技術檢測ERCC1mRNA表達量的試劑盒的製作方法

2023-09-18 04:50:45

專利名稱：一種螢光定量PCR技術檢測ERCC1 mRNA表達量的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用螢光定量PCR技術檢測ERCCl mRNA 表達量的試劑盒。
背景技術：
自從1967年人們發現順鉬有抗癌活性以來，鉬類金屬抗癌藥物的應用和研究得到了迅速發展。順鉬具有抗癌譜廣、作用強等特點，為當前化療中最常用的藥物之一，鉬類藥物通過與細胞內DNA結合，導致DNA鏈間交鏈或鏈內交鏈，引起DNA損傷，從而導致細胞死亡。而順鉬等細胞毒性化療藥物對腫瘤損傷後，腫瘤細胞的DNA修復機制啟動，具有較高修復能力的腫瘤細胞易於對化療耐藥。研究提示，DNA修復基因的表達狀況可以作為化療療效相對理想的預測因子。核苷酸切除修復(NER)與鉬類耐藥關係密切，其中切除修復交叉互補基因I(ERCCl) 是參與該修復過程並導致鉬類耐藥的重要因子(van Duin Μ, de Wit J, Odijk H，et al. Molecular characterization of the human excision repair gene ERCC-1 :cDNA cloning and amino acid homology with the yeast DNA repair gene RADIO. Cell. 1986 ； 44(6) 913-923) 0近年來的研究發現ERCCl基因表達水平的高低與乳腺癌、肝癌、食管癌、胃癌、卵巢癌以及非小細胞肺癌的發病、生物學特性以及預後均有關(McDaniel LD, Schultz RA. XPF/ERCC4 and ERCCl their products and biological roles. Adv Exp Med Biol. 2008 ;637 :65-82)。ERCCl不同的表達與非小細胞肺癌治療的選擇、手術後藥物的應用以及預後判斷密切相關(Simon GR, Begum Μ, Bepler G. Setting the stage for tailored chemotherapy in the management of non-small cell lung cancer. Future Oncol. 2008Feb ；4(1) :51_59)。有文獻報告，在早期非小細胞肺癌患者手術後ERCCl高表達者，其生存時間顯著延長，預後好。可作為指導非小細胞肺癌預後的獨立的預測指標；而在接受鉬類藥物化療較晚期的非小細胞肺癌患者中，ERCCl陽性表達者反而較陰性表達者預後差，ERCCl陰性者無病生存期及總的生存期較ERCCl陽性者明顯延長。體內和體外研究進一步證實ERCCl基因的表達水平同時與細胞對鉬類藥物的抵抗性呈正相關，ERCCl的高表達是導致腫瘤細胞對鉬類藥物耐藥的最重要的機制之一(Martin L P，Hamilton TC, Schilder RJ. Platinum resistance :the role of DNA repair pathways. Clin Cancer Res. 2008 ； 14 (5) : 1291-1295)。ERCCl編碼的273個胺基酸的蛋白質不具有核苷酸切除修復功能，所以在研究 ERCCl與化療療效關係時，應用免疫組化定量檢測ERCCl蛋白含量不能反映ERCCl基因功能，而可採用敏感性及特異性均較高的螢光定量PCR檢測其mRNA水平。同時目前臨床上常用的非小細胞肺癌的病理類型和臨床分期等對於預測患者療效和生存期並不理想，大量研究都希望能找到一些相關的非小細胞肺癌分子標記物，以期對患者的治療和預後提供更有益的幫助。ERCCl基因表達就適應了這種要求，它不但對於非小細胞肺癌的預後估計有所幫助，而且對於手術後輔助化療的藥物選擇更有指導意義。
目前尚無文獻報告有關檢測ERCCl mRNA表達量的試劑盒。

發明內容
本發明的目的在於提供一種能快速、簡便、敏感、特異的檢測ERCClmRNA表達量的
試劑盒。本發明的試劑盒利用螢光定量PCR技術，包含ERCCl基因引物、內參基因 (β -actin)引物和Taqman螢光探針ERCCl 基因上遊引物序列為5' -GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3『 (SEQ ID NO 1)；ERCCl 基因下遊引物序列為5' -GCGGAGGCTGAGGAACAG-3『 (SEQ ID NO 2)；Taqman 螢光探針6FAM 5' -CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-3 『 TAMRA (SEQ ID NO: 3)；β-actin 基因上遊引物序列為5' -TGAGCGCGGCTACAGCTT-3，(SEQ ID NO 4)；β-actin 基因下遊引物序列為5' -TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3，(SEQ ID NO: 5)；Taqman 螢光探針6FAM 5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3，TAMRA (SEQ ID NO 6)。所述的試劑盒還包括進行螢光定量PCR所需的試劑。本發明的試劑盒具體包括第一鏈cDNA合成試劑、陰性對照和標準品、PCR反應液、RNA提取試劑等。其中的第一鏈cDNA合成試劑為25mmol/L MgCl2 4ul,10 X逆轉錄酶緩衝液2ul，IOmmol/L dNTP 2ul,RNA 酶抑制劑 0.5ul，Oligo (dT)15 0. 5ug,AMV 逆轉錄酶 15U，DEPC 7jC ；其中陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有ERCCl總RNA樣品為陽性對照。其中的PCR反應液包括10XPCR Premix、0. 25pmol/ul的引物(ERCC1基因引物和內參基因引物)、0. 3pmol/ul的螢光探針、2. 5-4. OmM的Mgcl2、2U的Taq酶、0. 2-0. 4mM的 dNTPs、0. 2-1U 的 UNG 酶、0. 3-0. 6mM dUTP、通常取 l_2ul 的模板。用本發明的試劑盒檢測ERCCl mRNA表達量首先獲取臨床癌組織樣本，快速提取組織RNA，進行逆轉錄PCR合成第一鏈cDNA ；然後配置PCR反應液進行螢光定量PCR，在螢光定量PCR儀數據分析系統中讀出CT值結果。分別計算ERCCl及β-actin基因的Ct值， 兩者之差即為Δ Ct值。螢光定量PCR結果採用軟體分析，並標化計算樣本數據。本發明試劑盒的優點和效果如下(1)敏感螢光PCR檢測技術是綜合了 PCR技術、螢光標記技術、雷射技術、數碼顯象技術為一體的技術，因此它的檢測靈敏度很高。(2)特異使用特異性探針對定量分子進行識別，具有很高的準確性。同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高、防汙染。擴增和檢測可以在同一管 內檢測，不需要開蓋，不易汙染；同時擴增和檢測一步完成，不需要後期處理，不再需要擔心放射性汙染。(4)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。


圖IA為螢光實時定量RT-PCR檢測ERCCl標準品的螢光曲線圖。圖IB為根據ERCCl標準品的螢光曲線圖得到的標準曲線。圖2A為螢光實時定量RT-PCR檢測β -actin標準品的螢光曲線圖。圖2B為根據β -actin標準品的螢光曲線圖得到的標準曲線。
具體實施例方式現結合實施例和附圖，對本發明作進一步描述，但本發明的實施並不僅限於此。實施例1.本發明試劑盒的製備(1)本發明試劑盒組成如下①Trizol 快速提取癌組織RNA ；②第一鏈cDNA合成試劑盒(RT-PCR)；③引物包括目的基因ERCC1、內參基因GAPDH及螢光探針，具體如下ERCCl基因引物序列上遊5'-GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3『；下遊5'-GCGGAGGCTGAGGAACAG-3『；Taqman 螢光探針6FAM 5，-CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-3，TAMRAβ -actin基因引物序列上遊5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3『；下遊5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3『；Taqman 螢光探針6FAM5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3，TAMRA。上述引物序列、探針序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有ERCCl總RNA樣品為陽性對照。⑤PCR 反應液10XPCR Premix,0. 25pmol/ul 的弓丨物、0. 3pmol/ul 的探針、 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 2-1U 的 UNG 酶、0. 3-0. 6mMdUTP.il 常取l_2ul的模板、反應總體積通常為20ul (以上所有的濃度都是指終濃度)⑥PCR擴增程序的設定在lightcyclerf.O儀器上通常是先50°C 10s,95°C lOmin，然後 95°C 15 秒 60°C lmin，循環 46 次。實施例2.用實施例1製備的試劑盒檢測ERCCl mRNA的表達量以檢測30例非小細胞肺癌石蠟切片標本組織結果為例。檢測流程首先根據基因序列設計特異性的引物和螢光探針。獲取臨床癌組織樣本，快速提取組織RNA，進行RT-PCR合成第一鏈cDNA ；配置PCR反應液進行螢光定量PCR。在 LightCycler數據分析系統中讀出CT值結果。分別計算ERCCl及β -actin基因的Ct值， 兩者之差即為Δ Ct值。螢光定量PCR結果採用軟體分析，並標化計算樣本數據。具體步驟如下①組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提癌和癌旁組織總RNA。提取的 RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑑定其完整性，通過紫外分光光度計測定^Onm與^Onm光密度值計算RNA的純度與濃度，用0. 1% DEPC處理的水調節抽提的RNA至相同濃度。②反轉錄合成cDNA 取2ul上述RNA液在70°C保溫IOmin隨後加入25mmol/ L MgCl2 4ul，IOX 逆轉錄酶緩衝液 2ul，10mmol/L dNTP 2ul，RNA 酶抑制劑 0. 5ul， Oligo (dT)15 0. 5ug，AMV逆轉錄酶15U，補加DEPC處理水至總體積20ul，於42°C保溫15min， 進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈。反應結束後，加熱至99°C 5min以滅活逆轉錄酶。加 20ul無菌水混勻置冰箱一 20°C保存。④螢光定量PCR擴增=PCR反應體系為20ul 含2Xpremix 10. Oul，ERCCl引物濃度0. 2ymol/L，探針濃度0. 3ymol/L，cDNAl. Oul，超純水補齊。在Iightcycler螢光定量 PCR儀上反應擴增條件95°C IOmin預變性，95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環，儀器自
動收集螢光信號。⑤數據收集處理和分析將實時螢光定量PCR所得數據進行計算，得出目的基因相對於管家基因(β-actin)的相對表達量後再進行統計分析，以比值大於0.5為高表達
權利要求
1. 一種利用螢光定量PCR技術檢測ERCCl mRNA表達量的試劑盒，包含ERCCl基因引物、內參基因β -actin引物和Taqman螢光探針ERCCl 基因上遊引物序列為5' -GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3『； ERCC1 基因下遊引物序列為5 『 -GCGGAGGCTGAGGAACAG-3 『； Taqman 螢光探針6FAM 5，-CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-3，TAMRA ； β-actin 基因上遊引物序列為5' -TGAGCGCGGCTACAGCTT-3，； β-actin 基因下遊引物序列為5' -TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3，； Taqman 螢光探針6FAM 5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3，TAMRA。
2.根據權利要求1所述的一種利用螢光定量PCR技術檢測ERCClmRNA表達量的試劑盒，其特徵在於該試劑盒具體包括第一鏈cDNA合成試劑、陰性對照和陽性對照、PCR反應液和RNA提取試劑；其中的第一鏈cDNA合成試劑為25mmol/L MgCl2 4ul,IOX逆轉錄酶緩衝液2ul，10mmol/L dNTP 2ul,RNA酶抑制劑0. 5ul，Oligo (dT) 15 0. 5ug,AMV逆轉錄酶15U，DEPC 水；其中陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有ERCCl總RNA樣品為陽性對照；其中的PCR反應液包括10XPCR Premix、0. 25pmol/ul的ERCCl基因引物和內參基因引物、0. 3pmol/ul 的螢光探針、2. 5-4. OmM 的 Mgcl2、2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、 0. 2-1U 的 UNG 酶、0. 3-0. 6mM dUTP、通常取 l_2ul 的模板。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域。一種快速檢測ERCC1 mRNA的螢光定量PCR診斷試劑盒，目的在於提供一種能快速、簡便、敏感、特異的檢測ERCC1 mRNA的試劑盒及其應用，DNA修復基因的表達狀況可能作為化療療效相對理想的預測因子。核苷酸切除修復(NER)與鉑類耐藥關係密切，其中切除修復交叉互補基因1(ERCC1)是參與該修復過程並導致鉑類耐藥的重要因子，採用敏感性及特異性均較高的螢光定量PCR檢測ERCC1 mRNA水平，其檢測結果的特異性和敏感度均顯著提高，該試劑盒為臨床惡性腫瘤患者是否使用鉑類化療藥物提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術。
文檔編號G01N21/64GK102154475SQ20111003231
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月28日 優先權日2011年1月28日
發明者劉亞莉, 劉輝, 周偉平, 張敬磊 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學