植物組學涉及草藥組合物的基於基因組的方法

2023-11-02 11:33:42

專利名稱：植物組學涉及草藥組合物的基於基因組的方法
技術領域：
本發明涉及草藥組合物。更具體地說，本發明提供了改善草藥組合物的選擇、測試、質量控制和製造的工具和方法學，以幫助指導開發新穎的草藥組合物和鑑別現有草藥組合物的新用途。
背景技術：
本文中的所有出版物和專利申請都結合在此作為參考，就好象每一篇獨立的出版物或專利申請都具體而獨立地被指示結合在此作為參考一樣。
草藥已被亞洲和歐洲人民使用了數百年。在美國(US)，草藥已在食品強化劑工業以及整體醫學中取得商業上的價值。大約有三分之一的美國人至少嘗試過一次某些形式的替代醫學(Eisenberg等.，1993，新英格蘭醫學雜誌.328246-252).
植物性藥材，包括草藥，已成為用於鑑別新穎的治療疾病的活性藥劑的焦點。從植物提取物得到的活性化合物一直是製藥業的興趣所在。例如，紫杉醇是從西方紫杉樹的樹皮得到的一種抗腫瘤藥。據估計，在當今所常用和指定的數千種藥物中，大約有50％是從植物來源得到的，或者含有植物化合物的化學仿製品(Mindell，E.R.，1992，Earl Mindell草藥聖經，家庭生活圖書).
目前，有許多醫藥製劑、食物添加劑、食品強化劑等等都含有來自草藥的藥草成分或提取物。很長時期以來，草藥已在許多不同國家用於治療各種人類和動物的疾病(參見，例如I.A.Ross，1999，世界藥用植物，化學構成，傳統與現代醫藥應用，Humana Press；D.Molony，1998，美國東方醫學協會對中草藥的完全指南，BerkleyBooks；Kessle等，1996，恢復醫學的醫生完全指南，BerkleyHealth/Reference Books)；Mindell，同上).
草藥醫學。世界上有許多草藥醫學的分支，諸如印度草醫學、Unani、Sida和中醫(TCM)。現代西方醫學一般由給藥能夠幹預特定生化途徑的單一化學物質組成，而每種TCM製劑通常含有來自若干種草藥的上百種化學物質，它們經過調配在體內以協同方式與多個目標相互作用。雖然實踐經驗有效地促進了這些古老的草藥醫學的草藥組合物和處方的發展，但它們也在不同程度上得到一套理論的支持，這套理論在解剖學、藥理學、病理學、診斷處理等方面全然不同於現代西方醫學。在不同的草藥醫學領域中，TCM已經過數個世紀發展了一套更為完整的理論，它們有充分的文字記載，並且在大中華和東亞地區包括韓國和日本由當地醫師對廣大人群(＞13億人)加以實踐應用。
西方醫學通常使用天然或合成的純化合物，大部分指向單一的生理學目標。然而，TCM中所用的組合物常常由多種草藥和化合物組成，它們基於獨特而完整的概念，針對的是體內的多個目標。TCM主要使用炮製過的粗天然產物，經過各種組合和製劑，用於治療不同的病態，同時使產生的副作用較小。TCM的巨大潛力已為世界上大多數人所認識。
草藥在典型的TCM處方中可按作用分為主藥和從藥，包括輔藥、佐藥和使藥。主藥在對病因或疾病的主要症狀的治療中起主導作用。輔藥幫助加強主藥的作用並在對兼證的治療中起主要作用。佐藥有三種類型1)增強主藥和輔藥的治療作用或治療次要症狀的佐藥，2)減小或消除主藥和輔藥的毒性和其他副作用的佐藥和3)作用於不明確受到君藥影響的補充目標組織的佐藥。使藥引其他諸藥的作用直達病所和/或調和處方或製劑中其他草藥的作用。與由一份或多份單一植物組成的大多數草藥或強化劑相比，TCM的預定作用針對的是多個組織。
例如，廣為人知的用於治療哮喘的TCM方劑「麻黃湯」由麻黃、桂枝、苦杏仁和甘草組成。麻黃是主藥，散寒、發汗並開宣肺氣而平喘，針對的是主證。桂枝作為輔藥，增強麻黃的發汗功能並溫經通脈以確保肺氣通暢而除疼痛之症。苦杏仁為佐藥，能宣降肺氣，佐助麻黃平喘。甘草為使藥，調和麻黃與桂枝的作用，以確保生氣的體內平衡。儘管這四味藥各自清楚地顯示出各自的活性，但它們合用時彼此功效互補。實踐中，根據患者顯露出的症狀，主藥可以伴有一味或多味從藥(中醫方劑學，第1章，10-16頁，E.Zhang，editor in Chief，Publishing House，上海中醫藥大學，1998)。
指導用草藥和其他方式如針灸治療疾病的主要TCM理論是1)陰陽學說，2)五行學說，3)臟腑學說，4)氣、血和津液學說，和5)經絡學說。
在TCM中，作出正確診斷的首要方面是確定疾病的陰陽。例如，發燒的病人，若有口渴、便秘或脈急等症狀，就是陽症。畏寒的病人，若不渴、腹瀉且脈緩，就是陰症。草藥的性、味和功能也可以按照陰陽理論加以分類。例如，寒性和涼性的草藥屬陰，而溫性和熱性的草藥屬陽。酸、苦和鹹味的草藥屬陰，而辛、甜和淡味的草藥屬陽。收斂、沉降功能的草藥屬陰，而發散、升浮功能的草藥屬陽。在TCM中，治療原則是基於陰陽的勝衰。草藥按照它們的陰陽特性和功能組方，以恢復陰陽平衡，如此達到治療目的。
按照五行學說，有五種基本物質構成物質世界(即木、火、土、金和水)。在TCM中，該學說用於解釋人體的生理和病理並指導臨床診斷和治療。草藥醫師已應用五行的生、克、相乘和反克規則制定出了許多有效而特定的治療方案，諸如培土生金(加強脾的功能以利肺)，滋水涵木(滋腎養肝)，扶土抑木(補充脾的功能以治療肝機能亢進)，和補水瀉火(滋養腎精而治療心機能亢進)。具體地說，有些草藥的性與五行相對應，目的是指導TCM的方劑配伍。
在TCM中，將人體的內部器官分為三組五臟(心、肝、脾、肺、腎)，六腑(膽、胃、大腸、小腸、膀胱、三焦)，奇恆之府(腦、髓、骨、脈、膽、女子胞)。在TCM中，臟腑不僅是解剖單位，而且是關於不同器官之間相互作用的生理和病理學概念。例如，心也指某些精神活動，並影響血、發、舌和皮膚的功能。陰陽五行會影響這些髒、腑和器官之間的相互作用。理論學說的互相影響的複雜性被用於解釋草藥所針對的疾病的病理，如下文中所討論的。
TCM中開藥方是從診斷開始的，診斷主要包括四項問診、望診、聽診和聞診、切診。問診過程中，搜集大量信息，包括主證的特徵。例如，如果主證的特徵是上腹部鈍痛，並可通過熱、壓減輕，就提示為脾陽不足。腰膝酸軟、怕冷且手腳涼，顯示為腎陽虛。望診過程中，對活力、皮膚的顏色和全身的外觀以及舌象進行觀察。例如，面色蒼白在內部與秋天的肺對應，其氣躁。這可出現在陽氣不足且氣血阻滯的時候，或者出現在經絡受寒而收縮的時候。
在TCM中，正是從氣血津液生成臟腑、經絡、組織和其他器官完成它們的生理學功能所需的能量；且取決於氣血津液的形成與代謝。TCM處方考慮草藥對氣血的作用而進行治療。
TCM認為，經脈、絡脈以及它們的輔助部分遍布全身。正是通過它們，草藥得以發揮對病理學目標的影響，達到改善疾病的效果。例如，麻黃作用於肺和膀胱經，故能發汗平喘和利尿。如上所述，針灸的臨床應用也受經絡學說的指導。
總之，在TCM中每種草藥的性質可指定陰陽並與五行之一相配，它們通過經絡發揮作用並經由氣血津液介導而對目標諸如臟腑產生治療作用。致病因子可能通過完全相同的經絡系統而被佯裝為圈套，從而對臟腑功能產生不利影響，並由此導致疾病。
從前面的討論可以清楚地看出TCM術語既是解剖學上的概念，也是哲學上的概念。例如，心代表體內組織、器官或系統的主體，發揮TCM中所述的功能。因此，心的概念需要一個多維的數據集來描述TCM的每個概念。一旦實現這點，就可發展分子整體醫學。
美國的管理方法。在美國，食品強化劑(諸如植物產物、維生素和礦物質、胺基酸和組織提取物)由1994年的《食品強化劑衛生與教育條例》(DSHE條例)管理。該條例將食品強化劑成分與受《聯邦食品、藥物和化妝品條例》管理的食品添加劑區別開來。此外，DSHE條例要求，若上市銷售的食品強化劑在標籤上顯示的或通常的使用條件下出現嚴重或不合理的危險時，食品和藥物管理局(FDA)負責檢驗。因此，目前沒有確立食品強化劑的純度、鑑別和製備規程的具體標準的聯邦規章。另外，1992年經國會替代醫學辦公室制定，公布了有關草藥質量的不多的幾個文件(Angell等，1998，新英格蘭醫學雜誌339839-841)。
目前，FDA必須批准藥物組合物或合劑中的每一種化學物質，然後必須進行臨床試驗，以便獲得有關銷售藥物的分開的FDA批准。該過程極其冗長而昂貴。由於前述的使用特定草藥組合物作為植物性藥物允許一開始就用多個化學物質進行臨床試驗(即使用草藥組合物或草藥組合物的特定成分進行臨床試驗)，因此分子整體醫學需要進行的評估較為容易。最近，FDA已批准一些草藥作為植物性藥物進行臨床測試(FDA關於植物性藥物的指導，1997年4月)。儘管這些事件表明了全身保健的積極發展，但也提出了有關草藥和食品強化劑包括中藥的製劑、製備和質量控制等重要問題。
由草藥中多種化學物質誘導的大量相關生物應答目前是無法獲得的，為了支持FDA的上市批准，這將逐漸變得重要。
在不斷增加的提高草藥的實際應用的壓力下，出現了以草藥為基礎的產業(參見例如Angell等，同上)。將科學測試應用於草藥和食品強化劑的製備和給藥的需要已非常突出，因為有一些攝取了基於草藥的製劑後出現毒性的最新報導。例如，有一名患者吃了以草藥為基礎的食品強化劑後出現了洋地黃毒性(Slifman等，1998，新英格蘭醫學雜誌339806-811)。後來經過測定，在該強化劑中標記為車前草的草藥成分實際上受到了毛地黃的汙染，而毛地黃是一種已知含有至少60種強心甙的草藥。在另一個例子中，草藥製劑被發現引起了患者的慢性鉛中毒(Beigel等，1998，新英格蘭醫學雜誌339827-830)。由於傳統的亞洲草藥被鉛和其他重金屬汙染已有充分的記載，因此出現這種情況並不完全是意外(Woolf等，1994，內科學紀事121729-735)。
植物性藥材的特性描述。眾所周知，遺傳特性(例如屬、種、栽培、變種、克隆)、草藥的生長年限、收穫時間、所用的特定植物部位、加工方法、地理起源、土壤類型、氣候模式、肥料的類型和比率、以及其他生長因素都對從任何特定區域「收穫」的任何特定草藥的特定化學組成具有重要影響。
已制定了越來越多數量的各種類型的試驗以確保在藥品中所用的和作為食品強化劑的草藥有恆定的質量；包括在宏觀和微觀水平進行檢驗以及用各種各樣的化學分析進行檢驗。最近，草藥提取物中標誌分子的高效液相色譜(HPLC)圖形已成為一個參照標準。但是，這種方法存在一些問題，包括有一些生物活性分子可能不吸收用於HPLC檢測的紫外線或可見光，和化學物質的量不必然與其生物學效能成比例。出於這些原因，草藥製造商採取將不同來源的原料混合的手段來減小化學變異。
質譜法(MS)是一種測定從高真空中的樣品產生的一束電離分子或分子片段的各成分的相對質量和相對豐度的分析方法。MS與HPLC不同，它不依賴於光密度。實踐中，其與HPLC或毛細管電泳(CE)聯合使用HPLC將化學物質分離開，然後可以用MS鑑別它們是什麼。將MS和HPLC結合成整體用於生物學用途的系統可以從商業上獲得。質譜限於在低壓下為氣態或揮發性的樣品，或者可以通過衍生達到這一點的樣品。
這些步驟已經不夠了。最近的一些出版物報導了某些特定供應商提供的草藥質量方面的更多的變化，要提供草藥提取物的生物等價化學是困難的。此外，安全與功效和草藥中化學物質之間的相互關係在大多數情況下是不太確定的。最近，為響應來自消費者和管理機構的意見(聯邦登記簿，1997年2月6日，62卷，25號，摘要No.96M-0417，製造、包裝或保持食品強化劑中的cGMP，建議規則)，有些草藥製造商已開始執行在各個方面要求嚴格的藥品生產和質量管理規範(GMP)。
化學和光譜學方法已用於描繪草藥和食品強化劑各組分的特性。例如，使用這兩種方法從墨西哥丁香(Gliricidia sepium)的果實中分離出了三種新的基於常春藤皂甙元的乙醯化皂甙(Kojima等，1998，植物化學48(5)885-888)。大量商品樣本中的中草藥的植物學來源是通過對比用高效液相色譜(HPLC)或毛細管電泳(CE)分析出的某些特徵組分推斷出的(Shuenn-Jyi Sheu，1997，食品和藥物分析雜誌5(4)285-294)。例如，麻黃鹼/偽麻黃鹼的比例被用作區別中麻黃(Ephedra intermedia)與其他種麻黃的標誌；總生物鹼含量可用於區分各種黃柏；而人參甙的含量可用於區別各種人參。但是，這些方法沒有直接測量各種草藥對病人用這些草藥進行了治療後的分子、生理學或形態學應答的作用。
加利福尼亞衛生學部門的食品和藥物分部最近使用氣相色譜-質譜和原子吸收方法對從草藥庫房得到的亞洲藥品的汙染物進行了測試(R.J.Ko，1998，新英格蘭醫學雜誌339847)。在他們所檢測的260種產品中，至少有83種(32％)含有未申報的藥物或重金屬，23種有一種以上的摻雜物。使用高效液相色譜法、氣相色譜法和質譜法，對從商業上購得的8種草藥的組合物(PC-SPES)進行了測定，發現含有雌激素類有機化合物(DiPaola等，1998，新英格蘭醫學雜誌339785-791)。研究人員得出結論，PC-SPES有強雌激素活性，且服用PC-SPES的前列腺癌患者可能混淆標準治療的結果並可能出現臨床上顯著的副作用。還收集了中藥「威靈仙」不同樣品的氣相色譜數據以及與樣品抗炎活性的關係(Wei等，用於中藥「威靈仙」質量評定的化學圖譜識別的研究，藥學通報26(10)772-772(1991))。該研究沒有提供相關的HBR陣列數據，諸如時間過程、劑量依賴性應答、控制樣品以證實生物標誌的不同強度，也沒有利用重複類型的數據構造方法以建立用於描繪該草藥組合物作用的特徵的綜合資料庫。
蛋白質濃度的變化也已用於表徵草藥組合物或草藥的特定組分的作用。例如，來自外周血單核細胞的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的產生據發現根據加入到培養物中的特定中藥而發生變化(Yamashiki等，1992，臨床實驗免疫學雜誌37(2)83-90)。白介素-1α受體的表達在用日本最常用的中藥小柴胡湯(Sho-saiko-to)處理過的培養的人表皮角質細胞中被顯著上調(Matsumoto等，1997，日本藥理學雜誌73(4)333-336)。Fcγ11/111受體和巨噬細胞的補體受體3的表達通過用當歸芍藥散(Toki-shakuyakusan)(TSS)處理而增加(J.C.Cyong，1997，日本藥理學雜誌110(Suppl.1)87-92)。從天然中藥中分離得到的生物鹼-漢防己甲素可抑制大鼠肺泡巨噬細胞中信號誘導的NF-κB的活化(Chen等，1997，生物化學與生物物理學研究通訊231(1)99-102)。草藥Sairei-to、澤瀉(日本名為「Takusha」)和茯苓(日本名為「Bukuryou」)在患抗腎小球基底膜性腎炎的大鼠體內抑制內皮肽-1的合成和表達(Hattori等，1997，日本心臟學會志39(2)121-128)。
mRNA濃度的增加或減少也被用作各種草藥和草藥組分作用的指示劑。腹膜內注射具有抗癲癇性能的中藥青陽參(QYS)和苯妥因鈉減少了大鼠紅藻氨酸誘導的慢性癲癇發作期間α-和β-微管蛋白(tublin)mRNA和海馬c-fos mRNA的產生(Guo等，1993，中藥雜誌13(4)281-286；Guo等，1995，中藥雜誌15(4)292-296；Guo等，1996，中藥雜誌16(1)48-51)。用從黃芪(Astragalus membranaceus)純化得到的成分-黃芪皂甙IV處理培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，結果減少了I型纖溶酶原活化劑抑制劑(PAI-1)特異性mRNA的表達，並增加了組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)特異性mRNA(Zhang等，1997，血管研究雜誌34(4)273-280)。從人參(Panax ginseng)的根分離出的一種成分據發現是由人單核細胞和人單核細胞系THP-1生成的白介素-8(IL-8)的強誘導劑，這種誘導伴隨有增加的IL-8mRNA的表達(Sonoda等，1998，免疫藥理學38287-294)。
核酸微陣列技術的最新進展使得能夠大規模地平行採集有關基因表達的信息。這種方法已用於研究細胞循環、生化路徑、酵母中基因組範圍的表達、細胞生長、細胞分化、細胞對單一化合物的應答、以及遺傳疾病，包括疾病的發生和進展(M.Schena等，1998，TIBTECH16301)。因為細胞通過改變特定基因的表達水平來響應微環境的變化，所以對細胞中表達的基因的鑑定可確定細胞來自何處和牽涉到哪些生化與調節系統，等等(Brown等，1999，自然遺傳學，21(1)增刊33)。因此，細胞的基因表達圖形描繪了細胞的起源、現在的分化以及細胞對外部刺激物的應答。迄今沒有研究人員，若有的話，曾嘗試將這些新技術用於研究全部草藥治療和強化劑的分子作用。
有一些研究人員曾嘗試表徵從選定的草藥分離出的主要活性成分的作用。例如，用從三七(Panax notoginseng)純化得到的三七皂甙R1(NR1)處理HUVEC，導致了TPA合成的劑量和時間依賴性的增加(Zhang等，1994，動脈硬化與血栓形成14(7)1040-1046)。用NR1處理沒有改變尿激酶型纖溶酶原活化劑和PAI-1抗原的合成，也沒有影響PAI-1在胞外基質中的沉積。當HUVEC用NR1處理時，TPA mRNA增加了兩倍，而PAI-1特異性mRNA的表達沒有受到NR1的顯著影響。由於關於三七的大多數研究都涉及到其與其他草藥的混合物，因此研究人員注意到，當用於治療人時，很難評定它們的體內情況會是怎樣(同上，1045頁，第2列，第1段)。此外，由於研究人員僅研究了草藥的一種主要成分，因此從該研究不可能確定整個草藥的分子作用或草藥的各成分之間的相互作用。
Dobashi等(1995，神經科學快報197235-238)研究了用於治療腎病症候群、支氣管哮喘和慢性類風溼性關節炎的中藥柴胡劑的兩種主要成分。給藥SS-d以劑量依賴方式增加了血漿促腎上腺皮質激素(ACTH)的濃度、垂體前葉中阿黑皮素原mRNA的濃度和大鼠下丘腦中CRF mRNA的濃度。相反，用SS-a治療沒有對這些分子標誌的濃度產生影響。儘管該研究指示給藥SS-d可能在柴胡劑誘導的CRF釋放和大鼠下丘腦中CRF基因的表達中具有重要作用，但沒有針對草藥治療總體上的分子作用。
Kojima等(1998，生物藥理學通報4426-428)描述了利用mRNA差別顯示來分離和鑑別在小鼠肝臟中由在日本用於治療各種炎性疾病的草藥小柴胡湯進行轉錄調節的基因。這些研究人員將他們的研究限於在調查研究草藥的分子機理中使用mRNA差別顯示技術。該研究同樣沒有針對受治療的動物的多個器官的作用，也沒有提供任何有關質量控制、新用途和作用標準化的指導。另外，該研究沒有對草藥的單個成分進行分析並將獨立的結果與使用整個草藥混合物得到的結果進行比較。
Ma Ji等(1998，中醫雜誌111(1)17-23)研究了草藥黃芪(Astragali membranaceus)對大鼠主動脈瘻引起的實驗性充血性心力衰竭的鈉水瀦留的治療作用。對比用黃芪治療和不用黃芪治療的慢性心力衰竭的大鼠在各種形態學特徵方面的變化(例如體重、血鈉濃度)；生理學特徵方面的變化(例如平均動脈壓、心率、血細胞比容和血漿同滲重量摩爾濃度)；mRNA表達水平的變化(例如下丘腦精氨酸後葉加壓素(AVP)、AVP V1a受體、腎AVP V2受體、水通道蛋白-2(AXP2))和蛋白質分泌的變化(例如血漿心房肽(ANP)和尿環鳥苷酸(cGMP))。研究人員發現，用黃芪治療改善了心臟和腎的功能，部分地糾正了AVP系統和AQP2的異常的mRNA表達，和改善了腎對ANP的反應。該研究沒有解決使用收集的數據來指導開發新製劑或用於闡明製劑中各種草藥之間的協同或其他相互作用、或出於質量控制的目的驗證各種作用的力量差異的問題。
如上文中所述的相關科學文獻顯示，基於分子的技術尚沒有用於研究和證實同時用多種化學物質諸如草藥和TCM治療或刺激的生物系統中的細胞和分子應答。而且，這些最新進展尚沒有與其他技術和方法統一起來而得到一種用於系統研究草藥和TCM的生物作用的方法。
發明概述本發明提供了用於生成、保持、改善和利用草藥生物應答陣列(HBR陣列)的工具和方法學，其中HBR陣列構成了與特定草藥組合物相聯的數據集。本發明的HBR陣列可包括關於草藥組分的與植物相關的參數信息、生物系統與草藥組合物接觸後收集的標誌信息以及生物系統與草藥組合物接觸後收集的生物應答信息。
本發明提供了為建立特定草藥組合物的標準化HBR陣列所需的工具和方法學，其中標準化HBR陣列用作基準，通過它來評估成批的類似或不同草藥組合物。本發明還提供了更新和維持標準化HBR陣列所必需的工具和方法學。本發明的特定實施方案涉及迭代過程，由此將另外的草藥組合物的批量數據、另外的與植物相關的數據、另外的標誌信息、和/或另外的生物應答信息定期加入到標準化HBR陣列中。於是，本發明提供了在不斷前進的基礎上用於生成、保持、更新和使用HBR陣列的工具和方法學。
本發明提供了指導草藥組合物的標準化所需的工具和方法學；以確定草藥組合物的哪些具體成分引起了特定的生物活性；以預測草藥組合物的生物活性；用於開發改進的草藥治療劑；用於調節或修飾草藥組合物；用於測定不同草藥組合物的關係；用於鑑別保留了所需生物活性的批量草藥組合物中的特定分子；用於確定已知草藥組合物的哪些草藥成分可以從該已知草藥組合物中去除但仍保持或改善了該已知草藥組合物的所需生物活性；用於鑑別批量草藥組合物的新用途和以前未知的生物活性；和用於使用批量草藥組合物的預測生物活性來幫助設計包括草藥成分和合成化學藥物的治療劑，包括使用組合化學的方法設計治療劑。
更具體地說，本發明提供了建立草藥組合物的標準化草藥生物應答陣列(HBR陣列)的方法，其中該方法包括a)選出特徵化的草藥組合物；b)使生物系統與一批特徵化的草藥組合物接觸並收集關於兩種或多種標誌的數據，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；c)將步驟b)的標誌數據儲存起來作為標準化HBR陣列。
本發明還提供了這樣一些方法，其進一步包括使生物系統與一批或多批草藥組合物接觸、收集關於一個或多個生物應答的數據和將所收集的生物應答數據加入到該草藥組合物的標準化HBR陣列中。
本發明提供了評估草藥組合物的方法，其中該方法包括使生物系統與一批草藥組合物接觸並收集關於兩種或多種標誌的數據；和將所收集的標誌數據與標準化HBR陣列加以比較，選出與成批草藥組合物中的組分相同或基本相同的草藥組分。
本發明提供了用於預測草藥組合物的生物活性的系統，它包括1).包含一種或多種不同類型的細胞、組織、器官或體外測定的生物系統；2).一批草藥組合物；3).兩種或多種分子標誌；4).用於使生物系統與該批草藥組合物接觸並測量分子標誌的不同應答的工具；5).一個計算機處理器，包括用於分析和儲存分子標誌的不同應答量度的存儲器，以便生成該批草藥組合物的草藥生物應答陣列(HBR陣列)數據集；6).一個計算機處理器，包括用於對比該批草藥組合物的HBR陣列和一個或多個先前儲存的HBR陣列的存儲器，以便預測該批草藥組合物的生物活性，其中用於產生一個或多個先前儲存的HBR陣列的草藥組合物的生物活性是已知的。
附圖的簡要描述

圖1。圖1提供了用於構造任何選定的草藥組合物的標準化草藥生物應答陣列(HBR陣列)的基本方法步驟的圖表。為了容易理解，該圖顯示的是其最基本的形式。如本文中所討論的，該圖中的每條途徑都可迭代進行。而且，一個框中包含的任何信息都可用於指導有關採集任何其他框中信息的決定。以這種方式，在整個方案中也可能有很多反饋迴路。
圖2。圖2提供了用於構造任何批量草藥組合物的草藥生物應答陣列(HBR陣列)和用於對比該批HBR陣列與選定的來自標準化HBR陣列的信息子集的基本方法步驟的圖表。為了容易理解，該圖顯示的是其最基本的形式。如本文中所討論的，該圖中的每條途徑都可迭代進行。而且，一個框中包含的任何信息都可用於指導有關採集任何其他框中信息的決定。以這種方式，在整個方案中也可能有很多反饋迴路。
圖3。圖3提供了用於建立和使用主要數據集的基本方法步驟的圖表。為了容易理解，該圖顯示的是其最基本的形式。如本文中所討論的，該圖中的每條途徑都可迭代進行。而且，一個框中包含的任何信息都可用於指導有關採集任何其他框中信息的決定。以這種方式，在整個方案中也可能有很多反饋迴路。
圖4。各種草藥組合物的蛋白質印跡。
A.沒有草藥組合物。
B.黃連湯A(HQT A)(0.2mg/ml)。
C.HQT A(4mg/ml)。
D.HQT B(0.2mg/ml)。
E.HQT B(4mg/ml)。
F.黃芩(0.2mg/ml)。
G.黃芩(4mg/ml)。
圖5。芍藥(Paeonie lactiflora pallus)的HPLC。
圖6。大棗(Ziziphi fructus)的HPLC。
圖7。圖7提供了建立草藥組合物的生物應答數據集的圖解。該數據集是基於在哺乳動物的細胞培養物中用三種以上不同濃度的草藥誘導的差別表達的基因。
圖8。圖8提供了建立草藥或複方草藥製劑的特徵表達圖形資料庫或HBR陣列的圖解。
圖9。圖9提供了鑑別未知草藥組合物的圖解。將由未知草藥誘導的表達圖形與表達圖形資料庫相對應，並利用統計學方法對資料庫中存檔的草藥的可能一致性打分。
圖10。圖10提供了提取草藥組合物或複方草藥製劑的標記基因的圖解。
圖11。圖11提供了提取草藥或複方草藥製劑中單個化學成分的標記基因的圖解。
圖12。用高和低濃度(分別用H和L指示)的三種類型的單一組分草藥提取物(冬蟲夏草菌絲體(CSM)，ST024，ST117)處理的細胞的基因表達數據的聚簇顯示。
(A)簇分析利用帶有492種選定基因(參見正文)的程序「聚簇」進行(Eisen等，1999)。
(B)用ST117處理而上調但用其他草藥提取物處理卻下調的基因的放大圖。指示了克隆ID和推定的基因名。
(C)簇算法將CSM、ST024和ST117分到3個不同的聚簇中。按照分級樹狀圖的顯示，各聚簇之間的距離可以看作是三種草藥提取物處理過的細胞的表達圖之間的差異。
圖13。
(A)在選定的492種基因的基礎上計算出的聚簇結果的假顏色編碼的顯示。(A)中的方框指示了上述三種基因聚簇的位置。
(B)被CSM下調但被其他物質上調的基因的放大圖。
(C)被各種草藥處理上調的基因。
(D)被CSM下調和被其他物質上調的基因。指示了IMAGE克隆ID和推定的基因名。
圖14。用高和低濃度(分別指示為H和L)的2批多成分草藥製劑黃芩湯(PHY906-303503(#11)和PHY906-284003(#12))處理的細胞的表達數據的聚簇顯示。數據是在三個不同日期的三次重複實驗基礎上的平均值。簇分析在選定的500種基因(參見正文)的基礎上進行。(B)簇算法將#11-L、#11H和(#12-H和#12-L)分到3個不同的聚簇中。聚簇間的距離或相似係數由分級聚簇樹狀圖指示。
圖15。利用三個獨立的實驗測量的(A)平均的和(B)單個的基因表達水平的放大圖。方框1中包括在#11-L處理的細胞中被下調但在其他細胞中被上調的基因，方框2中包括被所有的草藥處理上調的基因。方框3中包括對#11-L處理顯示沒有應答但被其他物質下調的基因。方框4中包括被低濃度的草藥處理大大下調但在高濃度的草藥處理下只顯示輕微應答的基因。各基因旁指示了克隆ID和推定的基因名。
圖16。用草藥處理的細胞中的基因表達圖形的分類。(A)用未經處理的對照細胞的表達數據正常化的數據集和(B)標準化為具有0均值和單位變數的數據集的分級聚簇。(C)用自組織圖型算法得到的非分級聚簇的結果。
圖17。用於在由草藥誘導的基因表達圖形的基礎上對草藥分類的候選種類預測物。該圖中顯示了帶有它們的對差別#11和#12草藥製劑的表達圖形的50類預測物。各基因旁指示了IMAGE克隆ID和推定的基因名。
圖18。由一批5種不同濃度的複方草藥製劑誘導的基因表達圖。(A)中顯示了表達圖形的6×4聚簇，(B)中顯示了選定聚簇的基因表達圖形的詳細情況。
圖19。圖19說明了圖18中的表達圖形怎樣歸類到用於隨後的漢明間距計算的三個不同組中。
圖20。圖20顯示了對由5批覆方草藥製劑誘導的基因表達圖形的分析結果。表中的數字是漢明間距。間距越小，表達圖形越相似。
圖21。(A)中顯示的是5批覆方草藥製劑的HPLC分析中4種化學成分的綜合最大強度的列表。將另外兩種參數BG+B和BG/B加入到該表中，並在(B)中顯示了6種參數的放射狀圖，以說明通過HPLC分析，與和其他各批的相似性比較，一批更類似於第2批#18。
圖22。在Jurkat T細胞中，由複方草藥製劑黃芩湯誘導的標記基因的顯示。
圖23。圖23說明了鑑別由草藥混合物中的單個化學成分誘導的標記基因的原理。標記基因是表達水平與草藥中的化學成分的量相關且相關係數大於0.99或小於-0.99的那些基因。(A)顯示了基因和甘草甜素之間的R值為0.998，(B)顯示表達水平隨著漢黃芩素的減少而增加的基因的R值為-0.997。
圖24。Jurkat T細胞中，由複方草藥製劑黃芩湯中的化學成分白花素誘導的標記基因。(A)顯示了與白花素正相關的基因，(B)顯示了與白花素負相關的基因。
圖25。基因表達圖形與對照組的相互關係。(A)是對照組的基因表達圖，(B)是樣品組的基因表達圖。(C)顯示了隨草藥處理濃度而變化的具有增加2倍以上的差別表達率的基因數。
圖26。利用非分級分析程序分類歸併的表達圖形的聚簇，其中該程序是基於自組織圖型(SOM)原理。X軸表示從低到高的草藥濃度，Y軸是基因表達率。
圖27。圖27顯示了在2批黃芩湯中常見的誘導和受抑基因。
圖28。有關2批黃芩湯的SOM聚簇結果。(A)顯示了有關2批黃芩湯的表達圖形的SOM聚簇結果。(B)顯示10種基因對這兩批黃芩湯具有類似應答，(C)顯示了當聚簇I和聚簇j變得更加不同時稱量因子怎樣減少。
圖29。簇分析中成對草藥製劑間的S得分的計算。(A)是分值的列表，(B)示範了5批類似的草藥製劑的關聯情況。
發明詳述除非另有定義，否則本文中使用的所有科技術語都具有本發明所屬領域內的普通技術人員通常理解的含義。雖然在實施或檢驗本發明中可以使用與本文中描述的那些類似或等價的任何方法和材料，但下面描述了優選的方法和材料。
發明概述如上所述，本發明涉及用於預測草藥組合物的生物應答的工具和方法。更具體地說，本發明提供了生成草藥生物應答陣列(HBR陣列)資料庫的方法以及使用這類資料庫來提高有效的以草藥為基礎的治療劑的設計應用的方法。本發明的目標是對用於草藥組合物的製備、測試和給藥的HBR陣列的全面設計、生成、改善和使用，並用於指導開發新的草藥組合物和現有採用組合物的新用途。
植物組學(Phytomics)。根據其使用的上下文，在本文中所用的「植物組學」是指使用生物信息學和統計學方法來解決草藥組合物各成分的定性和定量問題，或者是指為解決這些問題而開發的實際資料庫。
草藥生物應答陣列。本文中所用的HBR陣列構成了與草藥組合物有關的兩個或多個觀測或測量結果的數據集。HBR陣列可包括有關組合物中各植物的定性和定量數據(與植物有關的數據)，生物系統與草藥組合物接觸後得到的標誌信息包括劑量依賴性研究，和生物系統與草藥組合物接觸後得到的生物應答數據的資料庫。任何特定HBR陣列中的數據都可在二維或三維空間中進行統計學分析。
HBR陣列可以指定為批量HBR陣列和標準化HBR陣列。批量HBR陣列是與具體某批草藥組合物有關的數據的陣列。標準化HBR陣列是與標準化草藥組合物有關的數據的陣列。
主數據集。本文中所用的術語「主數據集」是指用作基準數據集的數據集，其他各種數據集與它進行比較，或者用它分析是否為相同或不同的草藥組合物。一般說來，主數據集使用生物工程技術建立，以確定草藥組合物的某些遺傳或蛋白質情況。因此，主數據集將通常但並不總是以基因組或蛋白組(proteomic)數據集為基礎。例如，核酸微陣列結果可以是用於比較其他相關或次要數據集的主數據集。
次要或相關數據集。本文中所用的「次要數據集」或「相關數據集」指的是用於比較主數據集的一個或多個數據集。通常，但並不總是，次要數據集將由利用更傳統的方法收集的草藥組合物的信息組成。例如，次要或相關數據集可由利用更常規的方法得到的與植物有關的數據集合組成。與植物有關的數據的實例包括但不限於草藥組合物中各草藥的屬/種，組合物中各草藥的特定植物部分和草藥所種植的地理位置。次要數據集的另一個例子可由用一種或多種不同量的草藥組合物治療後的細胞、組織、器官或生物體的一組生物應答組成。這種生物學數據或整個生物體的實例可包括但不限於細胞毒性研究，酶處理研究，生長速率，重量的增或減，運動技能的變化和心智能力的變化。
草藥。從技術上來說，草藥是小的、非木質(即肉質莖)的、一年生或多年生的種子植物，其中在空氣中的所有部分在每個生長季末期死亡再復生。草藥的價值在於它們的藥用、風味可口或芳香特性。這個詞的使用更為普遍，在本文中使用的這個詞「草藥」是指具有食物補充劑、醫學、藥物、治療或強身用途的任何植物或植物部分。因此，本文中使用的草藥不限於對草藥的植物學定義，而是包括用於這類目的的任何植物性藥材、植物或植物部分，包括後生植物王國的任何植物種或亞種的任何植物或植物部分，包括草、灌木、半灌木和喬木。用於草藥組合物中的植物部分包括但不限於種子、葉、莖、小枝、分支、芽、花、鱗莖、球莖、塊莖、根莖、長匐莖、根、果實、球果、漿果、形成層和樹皮。
草藥組合物。本文中所用的「草藥組合物」指的是包括藥草、草藥植物或草藥植物部分的任何組合物。因此，正如本文中所用的，草藥組合物是任何草藥製劑，包括草藥食物補充劑、草藥藥品、草藥和藥用食品。草藥組合物的實例包括但不限於以下組分單植物種的全植物或植物部分；多植物種的全植物或植物部分；從單植物種得到的多種成分；從多植物種得到的多種成分；或這些不同成分的任意組合。為了充分回顧各種草藥組合物，參見例如Kee Chang Huang，中草藥藥理學，CRC Press(1993)，其完整地結合在此作為參考。各種草藥組合物的代表性實例見以下段落。
英國從十八世紀中期開始就已使用包括柳樹皮的草藥組合物來治療熱病。柳樹皮中的活性成分是一種叫做水楊苷的苦味苷，它水解後得到葡萄糖和水楊醇。常統稱為非類固醇性抗炎藥(NSAID)的阿斯匹林(乙醯水楊酸)和阿斯匹林樣藥物(例如布洛芬)經常用於治療疼痛、發熱和炎症。繡線菊屬植物是另一類含有水楊酸鹽的草藥。用柳樹皮或繡線菊屬植物治療關節炎和關節炎樣症狀需要消耗由這些植物製成的大量草藥茶劑。整個楊種植物(即楊屬喬木和灌木)還含有水楊酸鹽前體，楊樹芽已用於抗炎、退熱和鎮痛藥物治療。
美國已批准了一些關於用於治療各種疾病和處理影響人和動物的其他與健康相關的問題的草藥組合物的專利。例如，美國專利No.5,417,979公開了一種組合物，它包含包括千金藤和甘草種屬植物的草藥以及它們的提取物的混合物，可用作食慾刺激劑並用於治療疼痛。包括甘草(Glycyrrhiza uralensis)的草藥組合物已發現可用於治療皮膚溼疹、牛皮癬、瘙癢和炎症反應(美國專利No.5,466,452)。美國專利No.5,595,743公開了多種草藥組合物，它包括甘草提取物(甘草屬)和豨薟屬、槐屬、百部屬和四雄蕊植物(tetrandra)草藥，可用於治療各種哺乳動物疾病，包括炎症和類風溼性關節炎。眼炎可以用含有植物生物鹼漢防己甲素的藥物組合物治療(美國專利No.5,627,195)。
美國專利No.5,683,697公開了一種具有抗炎、退熱、祛痰或止咳作用的藥物組合物，其中該組合物包括來自楝屬、Angepica、石斛屬、鳳仙花屬、柑橘屬、桑寄生屬、青葙屬、白前屬和珊瑚菜屬的各種植物部分。包括良姜(Alphinia)、菝葜、心葉青牛膽莖、刺蒺藜、睡茄和姜的根、根莖和/或植物的提取物的草藥組合物已發現可減少或減輕與類風溼性關節炎、骨關節炎、反應性關節炎有關的症狀和用於減少促炎細胞因子的產生(美國專利No.5,683,698)。
草藥組合物可製成多種形式，包括膠囊、片劑或包衣片劑；顆粒劑；浸膏劑或酊劑；散劑；新鮮或乾燥的植物或植物部分；特製茶劑；汁液；膏霜和軟膏；揮髮油；或製成這些形式的任意組合。草藥可利用任何一種方法給藥，包括口服、直腸、胃腸外、腸內、經皮、靜脈內、經由飼管和局部途徑。
本發明所包含的草藥組合物包括還含有非草藥成分的草藥組合物。這類非草藥成分的實例包括但不限於全蟲和昆蟲的某部分，蠕蟲，動物或昆蟲的糞便，天然油或石油，氨的碳酸鹽，酒石酸鹽，酒，水，甘油，類固醇，藥物，維生素，營養液，乳清，鹽和明膠。
關於口服給藥，所公開的草藥組合物可以採用例如片劑或膠囊劑的形式，利用常規方法與常用的賦形劑混合製備，所述賦形劑是諸如粘合劑(例如預凝膠化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或澱粉羥乙酸鈉)；或潤溼劑(例如月桂基硫酸鈉)；滑動劑；人工和天然調味劑和甜味劑；人工或天然著色劑和染料；以及加溶劑。草藥組合物還可配製成以緩釋方式釋放活性成分，如本領域中公知的，和如美國專利Nos.4,690,825和5,055,300中所討論的。片劑可以用本領域中熟知的方法包衣。
用於口服給藥的液體製劑可以採用例如溶液、糖漿、懸浮液或漿液等形式(諸如Mulchandani等1992的美國專利No.5,108,767中描述的液體營養補充劑)，或者它們可以製成乾燥產物，使用前用水或其他適宜賦形劑重新構成。葉酸以及其他維生素和礦物質的液體製劑可以加入到專為ESRD病人設計的液體營養補充劑型中。這類液體製劑可以用常規方法製備，使用藥學上可接受的添加劑諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、甲基纖維素或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非含水賦形劑(例如杏仁油、油性酯或乙醇)；防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)；以及人工或天然著色劑和/或甜味劑。
關於局部給藥，草藥成分可以與構成可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的至少一種其他成分混合在一起而製成組合物，諸如最適於局部應用的膏霜、凝膠、固體、糊劑、油膏、粉末、洗劑、液體、氣溶膠或類似形式。單獨的無菌蒸餾水和簡單的膏霜、油膏和凝膠基質可以用作草藥成分的載體。也可以加入防腐劑和緩衝劑。該製劑可以用於無菌敷料、可生物降解的、可吸收的局部用貼片或敷料，或用於一開始快速釋放、逐漸降至緩慢釋放的緩釋植入系統。
為了更全面地回顧和討論以草藥為基礎的組合物，參見EarlMindell，Earl Mindel草藥聖經，Simon Schuster(1992)；Culpeper草藥大全，W.Foulsham Co.，Ltd.(十七世紀中期首次出版)；和Rodale草藥圖解百科全書，Rodale Press(1987)。
標準化草藥組合物。本文中所用的「標準化草藥組合物」或「特徵化草藥組合物」是指選定作為用於評估與標準化草藥組合物的成分具有相同、相似或不同成分的批量草藥組合物的標準草藥組合物的特定草藥組合物。有時在本文中也稱作「主要草藥組合物」。標準化草藥組合物通常是已充分表徵並在特定生物系統中顯示所需生物應答的草藥組合物。標準化草藥組合物一般利用本領域技術人員熟知的化學試驗加以標準化並適當地儲存用於長期使用和參照。用標準化草藥組合物在有關植物(即與植物相關的數據)、標誌和生物應答的觀測和測量結果的基礎上建立標準化HBR陣列，以便描繪草藥組合物的特性。
批量草藥組合物。本文中所用的「批量草藥組合物」是指用於在有關植物和標誌的觀測和測量結果的基礎上建立HBR陣列以便描繪草藥組合物的特性的任何測試草藥組合物。有時在本文中也稱作「測試」或「批量」草藥組合物。可以包括或不包括生物應答的觀測和測量數據。用於確定標準化草藥組合物的那些草藥組合物也可以稱作「批量草藥組合物」直到其被指定為「標準化草藥組合物」為止。
批量。本文中所用的「批量」是指可以鑑別出具有一些特定屬性的特定數量的草藥組合物，以便將其與其他任何特定數量的相同草藥組合物區別開。例如，一批草藥組合物與另一批相同草藥組合物的差別可能在於這兩批草藥組合物的收穫時間不同或地理位置不同。將特定批次區別開的其他差異可包括但不限於以下這些1)所用的特定植物部分(例如在一批中用的是草藥的根，而在不同的另一批中用的是相同草藥的葉子)；2)對單個草藥或草藥組合物在採集後的處理情況(例如一批可以用蒸餾水加工，而不同的另一批可以用氯化氫加工以模擬人胃中的酸度；和3)草藥組合物中當草藥的相對比例(例如一批的三種不同草藥可以具有相等的重量份或體積份，而另一批中的一種草藥具有比另兩種草藥更高的比例)。
生物系統。本文中所用的「生物系統」是指可以觀察或測量生物應答的任何生物學實體。因此，生物系統包括但不限於任何細胞、組織、器官、全生物體或體外測定。
生物活性。本文中所用的草藥的「生物活性」是指草藥組合物所特有的對所給生物系統的特定生物學作用。
與植物有關的數據。本文中所用的「與植物有關的數據」是指所收集的關於草藥組合物的數據，包括但不限於有關植物的數據，它們的生長條件以及採集過程中和採集後對植物的處理。與植物有關的數據還包括草藥組合物中各組分的相對比例，其中各組分可以是不同的植物部分，不同的植物種，其他非植物成分(例如昆虫部分。化學藥物)或這些變數的任意組合。
可以搜集的有關草藥組合物的與植物相關的數據包括但不限於以下這些1)植物種屬情況(以及可能時，特定的植物變種、栽培、克隆、家系等情況)和在組合物中所用的特定植物部分；2)草藥的地理來源，包括經度/緯度和海拔；3)草藥的生長條件，包括肥料類型和用量，降雨量和灌溉量和次數，每天所接受的平均微愛因斯坦，農藥用法，包括除草劑、殺蟲劑、殺蟎藥和殺真菌劑，以及耕種方法；4)用於加工草藥的方法和條件，包括草藥的年齡/成熟期，浸泡時間，乾燥時間，提取方法和研磨方法；和5)草藥組分和最終的草藥組合物的儲存方法和條件。
另外，標準化草藥組合物可以進行化學分析。化學特性描述可以利用本領域技術人員公知的任何化學分析方法完成。可以採用的化學分析的實例包括但不限於HPLC、TLC、化學指紋法、質量分光光度計分析和氣相色譜法。
細胞庫系統。本文中所用的「細胞庫系統」包括細胞的主細胞庫(MCB)和工作細胞庫(WCB)。使用細胞庫系統可以將草藥測試的細胞變異性減至最小，並可用於核酸微陣列研究中的所有細胞類型。
生物信息學。本文中所用的「生物信息學」指的是生物學方面的信息的使用和組織。除了別的以外，生物信息學還包括以下這些內容(1)數據的獲得和分析；(2)資料庫的發展；(3)綜合與聯繫；和(4)對所得資料庫作進一步分析。到二十世紀九十年代早期幾乎所有生物信息學資源都被開發成公共域自由軟體，且大多數仍可自由地從網際網路上獲得。有些公司已開發了專有資料庫或分析軟體。
基因組或基因組學。本文中所用的術語「基因組學」指的是對基因及其功能的研究。基因組學強調比較基因定位、分子克隆、大規模限制酶切作圖以及DNA測序和計算分析中的基礎和應用研究的綜合。遺傳信息使用基礎技術諸如DNA測序、蛋白質測序和PCR加以提取。
基因功能(1)通過分析基因中DNA突變對細胞、組織、器官或生物體的正常發育和健康的作用來確定；(2)通過分析DNA序列中編碼的各種信號來確定；和(3)通過研究利用基因或相關基因系統產生的蛋白質來確定。
蛋白組或蛋白組學(Proteomic或Proteomics)。本文中所用的術語「蛋白組學」也叫做「蛋白組研究」或「非增殖部」，指的是在規定條件下基因組的定量蛋白質表達模式。普遍使用的蛋白組學是指使用蛋白質生物化學的高流通量、自動分析方法。
除了進行基因組研究外，還必需進行蛋白組研究的原因有很多。首先，基因表達水平不必然表示細胞中活性蛋白質的量。其次，基因序列不描述蛋白質功能與活性所必需的翻譯後修飾。再次，基因組本身不描述上下改變蛋白質濃度的動態細胞過程。
蛋白組程序尋求的是表徵細胞中的所有蛋白質，鑑別分離蛋白質的至少部分胺基酸序列。一般而言，蛋白質首先使用2D凝膠或HPLC分離，然後使用高流通量質譜法對肽或蛋白質測序。使用計算機可以對質譜的輸出加以分析，以便將基因和其編碼的特定蛋白質聯繫起來。這整個過程有時稱作「功能基因組學」。現在有許多商業風險提供蛋白組服務(例如Pharmaceutical ProteomicsTM，TheProteinChipTM系統，來自Ciphergen Biosystem；PerSeptiveBiosystems)。
有關蛋白組研究的一般信息，參見例如J.S.Fruton，1999，蛋白質、酶、基因化學與生物學的互相影響，Yale Univ.Pr.；Wilkins等，1997，蛋白組研究功能基因組學中的新邊界(原理與實踐)，Springer Verlag；A.J.Link，1999，2-D蛋白組分析方案(分子生物學方法，112，Humana Pr.；Kamp等，1999，蛋白組和蛋白質分析，Springer Verlag。
信號轉導。本文中所用的「信號轉導」，也稱作細胞信號轉導，是指細胞通過它接受外部信號並在內部傳遞、放大和指導它們的途徑。信號途徑需要以分步方式傳遞信號的蛋白質的內部通信鏈。蛋白激酶常常參與這種反應級聯，因為許多信號轉導涉及接受細胞外化學信號，由此引發胞質蛋白的磷酸化作用而放大信號。
翻譯後修飾。本文中所用的「翻譯後修飾」是一個籠統的術語，它包括了蛋白質已作為初級多肽合成後所發生的各種改變。這類翻譯後修飾包括但不限於糖基化，N末端甲硫氨酸(或N-甲醯基甲硫氨酸)的除去，信號肽的去除，乙醯化，甲醯化，胺基酸修飾，肽鏈內部裂解而釋放出更小的蛋白質或肽，磷酸化和甲硫氨酸的修飾。
陣列或微陣列。本文中所用的「陣列」或「微陣列」是指一種網格系統，它具有由規定核酸片段佔據的各個位置或探針細胞。陣列本身有時稱作「晶片」、「生物晶片」、「DNA晶片」或「基因晶片」。高密度核酸微陣列常常有在各種各樣的網格中的上千個探針細胞。
一旦製成了陣列，就加入從生物系統得到的DNA或蛋白質分子，且在DNA或蛋白質分子與陣列間發生某些形式的化學作用而產生一些該陣列和生物系統所特有的識別圖型。放射性標記的批次的自體放射照相術是一種傳統檢測策略，但也可選擇其他方法，包括螢光、比色法和電子信號轉導。
標誌。本文中所用的術語「標誌」是指為與特定某批草藥組合物接觸的特定生物系統所特有的特定草藥組合物的任何基於生物學的測量或觀測結果。術語「標誌」包括生物系統的定性和定量測量和觀測結果。標誌資料庫構成了表徵響應草藥治療的基因表達模式的數據集，其中這些模式顯示了哪些基因響應特定草藥組合物而興奮、轉變、上升或下降。因此，「標誌」指的是任何基於生物學的測量或觀測結果，其在生物系統中的表達水平的向上和向下或暫時調整、或定性或定量變化可用於表徵生物系統對草藥組合物的不同生物應答。
生物系統所接觸的特定批次的草藥組合物可以是未知的草藥組合物、已知的草藥組合物或標準化草藥組合物。可用於完成本發明的標誌的實例包括但不限於分子標誌、細胞遺傳標誌、生化標誌或大分子標誌。大分子標誌包括但不限於酶、多肽、肽、糖、抗體、DNA、RNA、蛋白質(翻譯蛋白質和翻譯後蛋白質)、核酸、多糖。
滿足本文「標誌」定義的任何標誌都可適當地用於實施本發明。術語「標誌」包括相關的可替代選擇的術語，諸如「生物標誌」或「遺傳標誌」或「基因標誌」。為達到增加HBR陣列的區別力的目的，可能有一種或多種主要標誌以及次要標誌，或一套分級結構的標誌。因此，選定的分子標誌可以與各種其他分子、細胞遺傳、生化或大分子標誌結合，以得到甚至更精確、擴大的HBR陣列。
分子標誌包含來自一類或多類分子化合物的一種或多種微觀分子，諸如DNA、RNA、cDNA、核酸片段、蛋白質、蛋白質片段、脂質、脂肪酸、糖類和糖蛋白。
適宜分子標誌的建立、產生和使用是本領域技術人員熟知的。特別有用的表徵分子標誌的技術的實例包括差別顯示、逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、表達的序列標記物(EST)的大規模測序、基因表達的系列分析(SAGE)、蛋白質的蛋白質免疫印跡或2D、3D研究、以及微陣列技術。分子標誌技術領域的技術人員熟悉這些技術的方法和應用(參見，例如Bernard R.Glick和Jack J.Pasternak，重組DNA的分子生物技術、原理與應用，第二版，ASM Press(1998)；MathewR.Walker和Ralph Rapley，基因技術中的路線圖，BlackwellScience(1997)；Roe等，DNA的分離與測序，John Wiley Sons(1996)；James D.Watson等，重組DNA，第二版，ScientificAmerican Books(1992))。
DNA、RNA和蛋白質的分離與測序方法是本領域技術人員熟知的。這類公知技術的實例可以見分子克隆實驗室指南，第二版，Sambrook等，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Hanspeter Saluz和J.P.Jost，基因組測序的實驗室指南天然非克隆DNA的同向測序(生物方法第1卷)，Birkhauser(1988)；和B.Roe等，DNA的分離和測序，Wiley(1996)。常規分子生物學技術的實例包括但不限於體外連接，限制內切酶消化，PCR，細胞轉化，雜交，電泳，DNA測序，細胞培養，等等。可從商業上購得的用於本發明的特定試劑盒和工具包括但不限於用於RNA分離、PCR cDNA文庫構建、逆轉錄病毒表達文庫、載體、基因表達分析、蛋白質抗體純化、細胞毒性測定、蛋白質表達和純化以及高流通量質粒純化的那些(參見，例如CLONTECHniques產品目錄，XIII(3)，1-32(1998)或www.clontech.com；AtlasTMcDNA表達測定產品目錄(1998)；SIGMA_產品目錄(1997))。
有關寡核苷酸陣列、微陣列、DNA晶片或生物晶片的討論、方法學和應用，參見例如美國專利5,445,934、5,605,662、5,631,134、5,736,257、5,741,644、5,744,305、5,795,714；Schena等，人基因組平行分析對1000個基因的基於微陣列的表達監測，美國國家科學院院報93，10614-10619(1996)；DeRisi等，研究在基因組規模上對基因表達的代謝和遺傳控制，科學278，680-686(1997)；Wodicka等，釀酒酵母中基因組範圍的表達監測，自然生物技術15，1359-1367(1997)；Pardee，完全基因組表達監測人種，自然生物技術15，1343-1344(1997)；Schafer等，DNA變異與人類遺傳學的未來，自然生物技術16，33-39(1998)；DeRisi等，使用cDNA微陣列分析人類癌症中基因表達模式，自然遺傳學14，457-460(1996)；Heller等，使用cDNA微陣列發現和分析與炎性疾病有關的基因，美國國家科學院院報94，2150-2155(1997)；Marshall等，DNA晶片可能性的陣列，自然生物技術16，27-31(1998)；Schena等，微陣列用於功能基因組學的生物技術的發現平臺，Tibtech16，301-306(1998)；Ramsay，DNA晶片最新技術，自然生物技術16，40-44(1998)；Chee等，用高密度DNA陣列獲得遺傳信息，科學274，610-614(1996)；和Chen等，利用帶有比色法檢測的cDNA微陣列系統描繪表達圖型和分離不同表達的基因，基因組學50，1-12(1998)；P.AndrewOutinen等，高半胱氨酸的應力誘導的作用的特性描繪，生物化學雜誌332，213-221(1998)；和Gelbert等，遺傳學將真正變革藥物發現過程，生物技術流行觀點8(6)，669-674(1997)。
適用於本發明的其他更具體的參考文獻包括但不限於針對表達技術的那些，諸如EST(參見，例如Michael R.Fannon，正常和疾病狀態下的基因表達-治療目標的鑑別，TIBTECH14，294-298(1996))；蛋白質圖的產生(參見，例如Robinson等，前列腺癌的酪氨酸激酶圖，美國國家科學院院報93，5958-5962(1996))；用於草藥組合物成分鑑定的化學和光譜學方法(Kojima等，墨西哥丁香的皂甙，植物化學48(5)，885-888(1998))；功能抗原的測定(參見，例如Aris Persidis，功能抗原，自然生物技術16，305-307(1998))；HPLC(參見，例如Milton T.W.Hearn(編輯)，蛋白質、肽和多核苷酸的HPLC現代話題與應用(臨化化學分析技術與實驗室指南)，VCH Pub.(1991)；電泳(參見，例如Westermeier等，電泳實踐DNA和蛋白質分離的方法與應用指南，John Wiley Sons(1997))；和交叉反應性標誌測定(參見，例如Irving Millman等，土撥鼠肝炎病毒實驗感染與自然發生，肝臟學4(5)817-823(1984))。解決完全基因組中被編碼的所有蛋白質的結構問題的結構基因組學的使用，其中方法包括高流通量同向結構測定和計算方法，由Terry Gaasterland在結構基因組學駕駛員座位中的生物信息學，自然生物技術16，625-627中作了論述。關於生物信息學方法，參見，例如Andreas Baxevanis(編輯)，生物信息學基因和蛋白質分析實踐指南，John Wiley Sons(1998)和Luke Alphey，DNA測序從實驗方法到生物信息學(生物技術介紹叢書)，SpringerVerlag(1997)。
細胞遺傳學參數包括但不限於染色質組型分析(例如，相對染色體長度，著絲點位置，有沒有次生狹窄)，表意文字(例如，有機體染色質組型的圖解表示)，有絲分裂和減數分裂期間的染色體行為，染色體染色和帶型，DNA-蛋白質相互作用(也稱作核酸酶保護測定)，中子散射研究，滾環(A.M.Diegelman和E.T.Kool，核酸研究26(13)3235-3241(1998)；Backert等，分子細胞生物學16(11)6285-6294(1996)；Skaliter等，病毒學雜誌70(2)1132-1136(1996)；A.Fire和S.Q.Xu，美國國家科學院院報92(10)4641-4645(1995))，和用放射性標記的核糖核苷酸培養後整個核的放射自顯影。
生化參數包括但不限於具體路徑分析，諸如信號轉導，蛋白質合成和轉運，RNA轉錄，膽固醇合成與降解，糖生成以及糖酵解。
指紋法。本文中所用的術語「指紋法」是指為了鑑別物質、特別是草藥而製作它的特徵圖形的方法。本文中所用的術語「指紋」指的是指紋法所採用的特定方法的結果顯示。
各種類型的指紋法的實例包括但不限於DNA指紋法、蛋白質指紋法、化學指紋法和足跡法。
DNA指紋法，或圖，是指從特定生物學來源(例如特定植物、植物種、植物屬、植物部分或植物組織)的DNA製作獨特的圖型的方式。DNA指紋，或圖，可以用於將該特定生物學來源與不同的生物學來源區別開來。使用微陣列、寡核苷酸陣列、DNA晶片或生物晶片分析某批草藥所得到的圖型也稱作「指紋」。
蛋白質指紋法是指產生細胞、組織、器官或生物體諸如植物中的蛋白質的圖型，這提供了該細胞、組織、器官或生物體在那時的完全特有的「指紋」。
化學指紋法是指對細胞中低分子量化學物質的分析，所得圖型用於鑑別細胞、組織、器官或生物體，諸如植物。分析通常使用氣相色譜法(GC)、HPLC或質譜法進行。
足跡法指的是找到兩種分子怎樣粘著在一起的方法。在DNA的情況下，蛋白質與DNA的標記部分結合，然後該DNA利用酶或化學刺激使分解。該方法產生了各種大小的片段的「梯」。DNA被結合蛋白保護時，它降解得少，於是「梯」顯得較模糊。足跡法是針對調節基因活性的蛋白質真正結合DNA時的一種常用技術。
本文中的其他地方詳細地描述了用於完成各種類型的指紋法的方式，或方法。
生物應答。本文中所用的「生物應答」是指生物系統與草藥組合物接觸後的生物應答的任何觀測或測量結果。有時在本文中也稱作「生物作用」。生物應答是特定草藥組合物的生物活性的定性或定量數據點。生物應答數據包括劑量信息和暫時信息，其中這類信息是測量生物系統對各種處理的應答領域中的技術人員熟知的。因此，生物應答數據包括有關特定生物系統對以特定方式給藥特定時間的特定劑量的草藥組合物的特定生物應答的信息。
生物應答包括但不限於生理學應答、形態學應答、認知應答、激發性應答、自主應答和翻譯後修飾，諸如信號轉導測量。許多草藥組合物顯示了不止一種生物應答(參見例如Kee Chang Huang，中草藥藥理學，CRC Press(1993))。有些特定生物應答可能包含在不止一個所描繪的組中，或者具有包括不止一個組的應答的多個方面或組分。適用於本發明的生物應答是本領域技術人員熟知的。以下參考文獻是該領域中技術狀況的代表Kee Chang Huang，中草藥藥理學，CRC Press(1993)；Earl Mindell，Earl Mindell草藥聖經，Simon Schuster(1992)；Goodman Gilman’s治療學的藥理學基礎，第九版，Joel G.Hardman等(編)，McGraw Hill，衛生職業處(1996)；P.J.Bentley，藥理學基礎，藥物作用入門，Cambridge UniversityPress(1981)；P.T.Marshall和G.M.Hughes，哺乳動物與其他脊椎動物的生理學，第二版，Cambridge University Press(1980)；委員會關於傳染病的報告，American Academy of Pediatrics(1991)；Knut Schmidt-Nielsen，動物生理學適應與環境，第五版，Cambridge University Press(1997)；Elain N.Marieb，人類解剖生理學，Addison-Wessley Pub.Co.(1997)；William F.Ganong，醫學生理學評論(第18版)，Appleton Lange(1997)；Arthur C.Guyton and John E.Hall，醫學生理學課本，W.B.Saunders Co.(1995)。
「生理學應答」是指與生物系統的生理學、或功能有關的任何特徵。細胞、組織或器官水平上的生理學應答包括但不限於溫度、血流速度、脈搏率、氧濃度、生物電勢、pH值、膽固醇濃度、感染狀況(例如病毒、細菌)和離子通量。整個生物體基礎上的生理學應答包括胃腸功能(例如潰瘍、肚子痛、消化不良、胃灼熱)、生殖道功能(例如基於生理學的陽痿、子宮痙攣、痛經)、排洩功能(例如泌尿道問題、腎病、腹瀉、便秘)、血液循環(例如高血壓、心臟病)、氧消耗量、骨胳健康情況(例如骨質疏鬆)、軟骨和結締組織病況(例如關節痛和炎症)、運動、視力(例如近視、失明)、肌肉緊張(例如消耗症候群、肌肉勞損)、有沒有疼痛、表皮和皮膚健康狀況(例如皮膚刺激、瘙癢、皮膚創傷)、內分泌系統的功能、心功能、神經協調、與頭有關的健康狀況(例如頭痛、頭暈)、年齡(例如生命跨度、壽命)和呼吸(例如充血、呼吸疾病)。
「形態學應答」是指涉及生物系統與草藥組合物接觸後的形態學、或形式和結構的任何特徵。不管生物系統的類型如何，形態學應答包括但不限於大小、重量、高度、寬度、顏色、炎症程度、一般性外觀表現(例如不透明性、透明性、淡薄)、溼潤或乾燥程度、有沒有癌生長、以及有沒有寄生蟲或瘟疫(例如鼠、蝨、跳蚤)。整個生物體基礎上的形態學應答包括但不限於毛髮生長的量和位置(例如多毛症、禿髮)、有沒有皺紋、指甲和皮膚生長的類型與程度、印跡凝固的程度、有沒有潰瘍或傷口、以及有沒有痔瘡。
「認知應答」是指與生物系統接觸草藥組合物後的認知或精神狀態有關的任何特徵。認知應答包括但不限於理解、識別、構思、判斷、記憶、推理和想像。
「激發性應答」是指與生物系統接觸草藥組合物的促動或誘導作用有關的任何特徵。激發性應答包括但不限於情緒(例如高興)、欲望、需要學習的動力、特定生理學需要(例如食慾、性慾)或起行為刺激劑作用的類似衝動(例如精力、性衝動)。
「自主應答」是指與生物系統接觸草藥組合物後的自主應答有關的任何特徵。自主應答涉及生物系統的自主神經系統。自主應答的實例包括但不限於不隨意功能(例如神經過敏、恐慌發作)，或生理學需要(例如呼吸、心律、激素釋放、免疫應答、失眠、發作性睡眠)。
用各種草藥組合物或草藥成分治療的細胞、組織、器官和整個生物體的生物應答是草藥領域中眾所周知的。例如，草藥組合物Sairei-to(TJ-114)、澤瀉(日本名為「Takusha」)和茯苓(日本名為「Bukuryou」)各自發現能抑制大鼠體內內皮肽-1的合成與表達(Hattori等，Sairei-to可抑制內皮肽-1在腎小球中的合成，日本心臟學會志39(2)，121-128(1997))。白介素(IL)-1α的產生通過用草藥小柴胡湯處理培養的人表皮角質細胞而得以顯著促進(Matsumoto等，小柴胡湯對培養的人角質細胞的白介素-1α介導的自泌生長的增強，日本藥理學雜誌73(4)，333-336(1997)。向從健康志願者得到的外周血單核細胞的培養物中加入小柴胡湯導致粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的產生出現劑量依賴性的增加(Yamashiki等，草藥「小柴胡湯」在體外誘導外周血單核細胞中粒細胞集落刺激因子產生，臨床實驗免疫學雜誌37(2)，83-90(1992))。這些研究人員得出結論給藥小柴胡湯可用於治療慢性肝病、惡性疾病和其中G-CSF有效的急性傳染病。用從中藥黃芪(Astragalus membranaceus)純化得到的黃芪皂甙IV(AS-IV)處理人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)後，減少了I型纖溶酶原活化劑抑制劑(PAI-1)特異性mRNA的表達，並增加了組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)特異性mRNA(Zhang等，培養的人臍靜脈內皮細胞的纖維蛋白分解潛力的調節黃芪皂甙IV向下調節纖溶酶原活化劑抑制劑-1並向上調節組織型纖溶酶原活化劑的表達，血管研究雜誌34(4)273-280(1997))。從人參(Panax ginseng)的根分離出的四種成分中的一種成分據發現是由人單核細胞和THP-1細胞生成的IL-8的強誘導劑，這種誘導伴隨有增加的IL-8 mRNA的表達(Sonoda等，從人參的根得到的酸性多糖對白介素-8產生的刺激，免疫藥理學38287-294(1998))。利用流動血細胞計數分析，Fcγ 11/111受體和巨噬細胞上的補體受體3(CR3)的表達據發現通過用Kampo-草藥當歸芍藥散(Toki-shakuyakusan)(TSS)處理而增加(Cyong，來自kampo-草藥的新BRM，日本藥理學雜誌110(增刊1)87P-92P(1997))。使用計算機圖像分析，Chen等(MRI/lpr小鼠體內細胞間粘著分子-1表達的圖像分析中草藥的作用，中華醫學雜誌75(4)，204-206(1995))發現，用中藥stragalin處理後，MRL/lpr小鼠體內細胞間粘著分子-1(ICAM-1)、免疫球蛋白和C3的分布強度顯著減小。蛋白質印跡分析顯示從天然中藥分離得到的漢防己甲素可抑制大鼠肺泡巨噬細胞中信號誘導的NF-κB的活化(Chen等，漢防己甲素抑制大鼠肺泡巨噬細胞中信號誘導的NF-κB的活化，生物化學與生物物理學研究通訊231(1)99-102(1997))。
算法。本文中所用的「算法」是指分步解決問題的步驟，尤其是步驟數有限的確定的遞歸計算步驟。對與植物有關的標誌和生物應答數據集的二維和三維分析的適宜算法是計算領域內的技術人員熟知的。這些算法在構建本發明的草藥生物應答陣列中是有用的。關於算法的一般信息參見例如Jerrod H.Zar，生物統計學分析，第二版，Prentice Hall(1984)；Robert A.Schowengerdt，遠程測定中的影像加工和分類技術，Academic Press(1983)；Steven Gold等，2D和3D點匹配的新算法姿態估計與對應，圖型識別31(8)1019-1031(1998)；Berc Rustem，用於非線性編程與多目標判定的算法，Wiley-Interscience Series in Systems and Optimization，JohnWiley Sons(1998)；Jeffrey H.Kingston，算法與數據結構設計、正確性、分析、國際計算機科學叢書，Addison-Wesley Pub.Co.(1997)；Steven S.Skiena，算法設計指南，Springer Verlag(1997)；和Marcel F.Neuts，算法概率問題的收集(隨機建模)，Chapman Hall(1995)。關於將算法用於基於遺傳的數據的更具體的信息參見例如Dan Gusfield，關於附帶條件、樹和序列的算法電子計算機科學與計算生物學，Cambridge University Press(1997)；Melanie Mitchell，遺傳算法簡介(複雜適應系統)，MITPress(1996)；David E.Goldberg，研究、優化和機器學習中的遺傳學算法，Addison-Wessley Pub.Co.(1989)；ZbigniewMichalewicz，遺傳學算法+數據結構＝進化程序，SpringerVerlag(1996)；Andre G.Uitterlinden和Jan Vijg，二維DNA分型平行基因組分析方法，Ellis Horwood分子生物學叢書，EllisHorwood Ltd.(1994)；和Pierre Baldi和Soren Brunak，生物信息學機器學習方法(適應計算和機器學習)，MIT Press(1998)。
組合化學。本文中所用的「組合化學」是指用於創造數百或數千個化合物的許多技術，其中每個化合物有一個或多個特徵彼此不同，諸如它們的形狀、電荷和/或疏水特性。組合化學可以用於產生草藥或草藥成分的化學變種化合物。這些化合物可以用本發明的方法加以評估。
基本組合化學概念是化學領域中的普通技術人員熟知的，也可見於Nicholas K.Terrett，組合化學(牛津化學，碩士)，Oxford Univ.Press(1998)；Anthony W.Czarnik和Sheila Hobbs Dewitt(Editors)，組合化學實踐指南，Amer.Chemical society(1997)；Stephen R.Wilson(編輯)和Anthony W.Czarnik(投搞人)，組合化學合成與應用，John Wiley Sons(1997)；Eric M.Gordon和James F.Kerwin(編輯)，藥物發現中的組合化學與分子多樣性，Wiley-Liss(1998)；Shmuel Cabilly(編輯)，組合肽文庫方案(分子生物學方法)，Human Press(1997)；John P.Devlin，高流通量篩選，Marcel Dekker(1998)；Larry Gold和Joseph Alper，通過組合物化學與基因組學並駕齊驅，自然生物技術15，297(1997)；Aris Persidis，組合化學，自然生物技術16，691-693(1998)。
實施例實施例1.建立選定草藥組合物的標準化HBR陣列圖1中給出了建立標準化HBR陣列的基本方案。圖表中各部分的定義如上所述。
選擇了感興趣的草藥組合物後，收集與草藥組合物有關的各種特徵的數據，包括但不限於與植物有關的特徵和標誌與生物應答信息。
與植物有關的數據包括但不限於植物種、特定植物部分、草藥組合物中植物的地理來源、植物的生長條件、用於製備草藥成分的加工方法、儲存方法和條件、以及對草藥組合物的各種化學分析。標誌信息包括生物系統與草藥組合物接觸後收集的標誌的定性和定量數據。適宜的標誌包括但不限於分子標誌、細胞遺傳標誌、生化標誌和大分子標誌。生物應答信息包括生物系統與草藥組合物接觸後收集的生物應答的定性和定量數據。
使用一種或多種測定法可以得到相同、類似、基本類似或不同批次的感興趣的草藥組合物的各種類型的數據(例如化學、標誌、生物應答數據)。這些不同的測定可以同時或不同時進行。另外，可以同時或不同時收集相同或不同標誌的數據。與此類似，可以同時或不同時收集相同或不同生物應答的生物應答數據。因此，HBR陣列的數據的收集可以是同時收集的，也可以是逐漸收集的。當生物系統與草藥組合物接觸以便收集數據時，記錄有關草藥組合物的給藥劑量以及處理次數的信息。生物應答數據還可由翻譯後修飾組成，諸如信號轉導的測量。
收集了兩種或多種類型的數據後(例如，有關兩種或多種標誌和生物應答的數據；有關與植物相關的特徵的數據和生物應答數據)，使用算法分析數據以便製作2-和/或3-維草藥生物應答陣列。
計算HBR陣列的各種統計學參數並可成為HBR陣列數據集的一部分。這些統計學參數可包括但不限於均值、標準偏差、相關或匹配(或不匹配)矩陣、比率、回歸係數和轉換值(例如原始數據的反正弦百分比變換)。於是，HBR陣列可以由原始數據以及某些計算結果、分布、圖解表示和與原始數據有關的其他數據處理結果組成。這類信息的特定實例包括但不限於數字影像、散射圖、簇分析和標誌數據的大規模基因表達圖。
所積累的所有數據和所得分析結果構成了用於建立HBR陣列數據集的特定草藥組合物的標準化HBR陣列。由於用於建立和保持草藥組合物的HBR陣列的方法的反覆特性，使得這類陣列可以視為在任何一個時間點是靜止的，或者是隨時間而動態變化的。
所得分析結果可以鑑別與任何特定草藥組合物的一個或多個特定生物活性相關(正或負相關)或相聯繫(即顯示總的趨勢)的標準化HBR陣列的子集。
實施例2.建立批量草藥組合物的批量HBR陣列圖2中給出了建立一批草藥組合物的HBR陣列的基本方案。圖表中各部分的定義如上所述。建立這種陣列的步驟與上文中剛剛述及的建立標準化HBR陣列的步驟相同。
通常，所收集的用於批量HBR陣列的數據的量將小於所收集的用於建立標準化HBR陣列的數據量。不過，所收集的批量草藥組合物的數據可以加入到確定的HBR陣列中或者用於建立新的標準化HBR陣列。
一般說來，所收集的批量草藥組合物的數據只是據發現與所測試的草藥組合物的所需生物活性高度相關或相聯的數據。例如，如果(根據上文中所討論的標準化HBR陣列數據和分析)已確定與植物有關的數據和標誌數據的特定子集與特定草藥組合物的所需生物活性高度相關的話，就只需要測試該批草藥組合物的該特徵子集即可，以確定該批草藥是否具有所需生物活性。通過對比從某批草藥組合物得到的該特徵子集的數據(即批量HBR陣列)與該特定草藥組合物的標準化HBR陣列，本領域技術人員可以確定該批特定草藥組合物是否具有所需生物活性。
實施例3.建立和使用主數據集圖3中給出了建立和使用草藥組合物的主數據集的基本方案。圖表中各部分的定義如上所述。
第一步是建立選定的草藥組合物或批量草藥組合物的主數據集。這通過使生物系統與草藥組合物接觸並收集將構成主數據集的所得標誌信息而完成。在大多數但不是所有情況下，主數據集將由陣列形式的基因組和/或蛋白組數據構成，諸如用DNA生物晶片得到的陣列。
接著，對主數據集進行分析，看是否已得到了所測試草藥組合物的不同的表達/結果。不同的表達/結果是必需的，以在下一個步驟中產生有意義的算法。這類不同的表達/結果的實例包括但不限於其中某些基因為響應與草藥組合物的接觸而被上調或下調或者某些蛋白質的濃度為響應這種接觸而增加或減少的適應症。
若沒有獲得有意義或有用的不同表達/結果，則需要重複接觸和標誌收集步驟。若據信第一次是由實驗誤差導致了缺乏足夠的結果，則可以用與第一次相同的所有變量(例如相同的生物系統、相同的標誌集、相同的實驗方案等)來重複接觸/數據收集步驟。但是，有可能需要改變生物系統的取樣(例如所利用的細胞的類型、細胞生長階段)、使用不同的標誌集和/或改變實驗方案以便得到不同的表達/結果。
實施例4.使用HBR陣列信息本文中所討論的HBR陣列信息可以用於許多不同目的，包括但不限於以下這些1)評估草藥組合物的成分；2)預測草藥組合物的生物應答；3)確定哪個標誌信息是與草藥組合物的特定生物應答最高度相關的；3)確定什麼信息數據集(即與植物有關的數據、標誌數據和生物應答數據)是與草藥組合物的特定生物應答最相關的；4)確定哪種類型的生物系統最適用於評估草藥組合物的生物活性；5)調節或改變草藥組合物的成分，使該草藥組合物的HBR陣列與相同或基本相同的草藥組合物的標準化HBR陣列相一致；6)調節或改變草藥組合物的成分，使該草藥組合物具有所需的生物活性；7)測定不同草藥組合物的關係；8)生成和更新標準化HBR陣列；9)鑑別保持草藥組合物的所需生物活性的具體成分(例如植物部分、蛋白質、分子)；10)確定可以將草藥組合物的哪些成分消除但同時仍保持或改善了草藥組合物的所需生物活性；11)鑑定草藥組合物的一種或多種先前未知的生物活性；12)幫助設計包括草藥和非草藥成分如化學合成藥物或藥劑的治療劑，和13)利用HBR陣列信息來補充設計治療劑的組合化學方法。本發明的這些實施方案中的每一個都可以由適當領域內的技術人員用本文中提供的方法和工具完成。
實施例5.質量控制使用本發明的HBR陣列技術來使得或確定具體某批草藥組合物(單一草藥或多種草藥的配方)與相同或基本類似的某批標準化或主要草藥組合物實質等價。該方法中所用的HBR陣列包括每種生物作用(即生物應答)的數量差異的可接受的範圍，以及由賦予每種生物作用的稱量值組成的可能的綜合得分，所述生物作用可由從生物系統的多個生化途徑得到的標誌組成。
「數據迷你化」是指用於確定或選擇在任何特定HBR陣列中哪個生物作用子集是所需最小數目的生物作用的方法。用於數據迷你化的信息是通過使生物系統(例如細胞系)以劑量依賴性方式與標準化草藥組合物接觸來建立標準化HBR陣列而得到的。這種標準化HBR陣列然後可以與建立的測試草藥組合物的各種HBR陣列進行比較。這些測試草藥組合物包括但不限於在不同日期製備的不同批次；用在不同時間收集的原藥材製備的不同批次；以及用在不同地點收集的原藥材製備的不同批次。
實施例6.改善草藥組合物或鑑定草藥組合物的新用途使生物系統與配方中單個草藥的提取物接觸或者與整個配方的提取物接觸，並檢驗提取物的生物作用，從而生成HBR陣列。觀察到的生物作用可以來自生物系統的多個生化途徑和/或來自動物的多個組織，其中對各種標誌相應的定性和/或定量變化加以評估。所得HBR陣列可以與從不同草藥組合物或用不同方法製備的草藥組合物得到的新的HBR陣列或類似HBR陣列比較。該步驟可用於選出給定的一組生物作用和要預測給定的某批草藥組合物具有給定的該組生物作用所需的最小數量的標誌。
為了構建HBR陣列，本領域技術人員利用了各種數據迷你化工具，包括但不限於統計學分析、人工智慧和對神經活動的資料庫研究。所選擇的統計學方法包括但不限於基本探索性數據分析(EDA)、圖形EDA(諸如管襯)和多元探查技術(例如簇分析、識別因素分析、非線性回歸上的階梯線型、分類樹)(參見例如STATISTICATM軟體包，來自StatSoft，Tulsa，OK 74104；Tel918-749-1119；Fax918-749-2217；www.statsoft.com)。
在構建HBR陣列的研究中使用數據迷你化工具來探查大量HBR陣列數據和各種HBR陣列其中、之間或當中的一致圖形。步驟包括探查、構建HBR陣列以及證實。該步驟一般進行迭代重複，直到鑑別了穩健HBR陣列或標準化HBR陣列。
實施例7.建立人參配方的標準化HBR陣列為進行該實施例，選擇的標準人參是在東北或韓國生長的PanaxGinseng C.A.Meyer G115。生長的氣候是-10-+10℃，年降雨量50-100cm(參見Huang，中藥藥理學(1993)pp21-45，CRC Press，BocaRaton，FL，完整結合在此作為參考)。對人參批次將首先確定以下特徵地理來源、種類、植物部分(例如根莖、根、葉片、種子、芽和花)；生長條件，加工方法和加工前後的儲存條件。對這些批次的化學內容的檢驗將通過測定人參皂甙(例如Ro，Ra1，Ra2，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rg1，Rg2，Rd，Re，Rf，Rh1，Rh2，NG-R2和Z-R1)的定性HPLC分析進行，包括對親脂性成分的TLC定性分析(參見Elkin等，中國藥理學報(1993)1497-100和Yoshikawa等，藥學雜誌(1993)113460-467)。根據不同的種類，不同草藥的皂甙含量應當在2.1和20.6％(重量)之間(參見表1)。然後將這些數據優選存儲在計算機處理器的存儲器中，用於進一步處理。
表1.不同人參的皂甙含量*
標準人參(即G115)的表達生物標誌包括以下這些IL-8、IL-2、GM-CSF、NfκB、ICAM-1、幹擾素γ、膽鹼乙醯轉移酶、、trk A、神經生長因子(Kim等，植物醫學(1998)64110-115；Sonoda等，免疫藥理學(1998)38287-294；Baum等，歐洲應用生理學雜誌(1997)76165-169；Iwangawa等，自由基生物醫學(1998)241256-1268；Rhind等，歐洲應用生理學雜誌(1996)74348-360)。另一方面，對於更廣的批次大小，可使用400,000寡核苷酸組/1.6cm2Affymetrix晶片(美國專利No.5,556,752)。標準人參的表達生物標誌將用光刻法、機械微斑點試驗或噴墨應用程式通過核酸微陣列技術製備(參見Schena等，TIBTECH(1998)16301-306)。選定的幾組細胞將在不同條件下與標準人參接觸不同時間以生成多個微陣列集。這些微陣列集然後將通過對生化提取物的基於雜交的表達監控經由來自微陣列上的各個位置的螢光強度的穩態mRNA濃度的減除來進行分析(Schena等，科學(1995)270467-470；Schena等，美國國家科學院院報(1996)9310614-10619；Lockhart等，自然生物技術(1996)141675-1680；DeRisi等，自然遺傳學(1996)14457-460；Heller等，美國國家科學院院報(1997)942150-2155)。然後將陣列數據集輸入到算法中產生標準人參的表達生物標誌統計值。標準人參的生化生物標誌包括對與蛋白質合成按比例加入的放線菌酮敏感性[3H]-亮氨酸和有絲分裂的[3H]-胸苷結合反射的增加的定量分析。(參見Yamamoto等，Arzneimittelforschung(1977)271169-1173)。對於生化生物標誌，將使骨髓細胞與標準人參在[3H]-胸苷的存在下(對於DNA合成)或在放線菌酮和[3H]-亮氨酸的存在和不存在下(對於蛋白質合成)在不同條件下接觸不同時間，以進行對生化生物標誌(即BBM集)的多個定量分析。然後將BBM集輸入到算法中產生標準人參的生化生物標誌統計值。然後將統計數據優選存儲在計算機處理器的存儲器中用於進一步操作。
生物系統的生物應答(即生物應答)將用細胞和完整動物測定。對於細胞，使人參批次在0.5mg/ml至100mg/m1的濃度下與特定細胞類型接觸，所述細胞類型包括但不限於成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞、PMNL、LAK細胞、B16-F10黑瘤細胞、THP-1細胞和海馬神經元。對於動物處理，將0.5-100mg/kg的人參提取物對動物口服給藥、通過腹膜內注射或皮下注射給藥。
為了測定生物系統對標準化人參的生物應答，將人卵巢癌細胞接種到裸鼠體內，使得形成可觸知的腫瘤。腫瘤形成後，小鼠同時給藥順式二氯·二氨合鉑和標準人參進行治療。檢驗小鼠的腫瘤生長抑制、存活時間的增加以及降低的有關血細胞比容值和體重的副作用等情況(Nakata等，日本癌症研究雜誌(1998)89733-740)。用各種濃度的標準人參重複進行測定，生成各變量的集中趨勢、分散和變異性的測量結果。
然後對收集的數據進行多維分析，以產生多變體正常分布集，作為測定生物活性與標準人參之間的相互關係基準的方式(參見Zar，J.H，載於生物統計分析，第二版(1984)，328-360頁，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ)。生物系統對標準人參的生物應答的第二次獨立測定將是標準人參對運動期間生理表現的作用。大鼠用不同濃度的標準人參處理4天(0.5-100mg/kg/天)，檢驗動物的增加的血漿游離脂肪酸濃度和在大約70％ VO2max下運動期間葡萄糖濃度的維持(參見Wang等，植物醫學(1998)64130-133)。收集所產生的數據，然後進行多維分析以產生多變體正常分布集，作為測定生物活性與標準人參之間的相互關係基準的方式(參見Zar，J.H，載於生物統計分析，第二版(1984)，328-360頁，Prentice Hall，Englewood Cliffs，NJ，完整結合在此作為參考)。然後將各生物應答的分布集輸入到算法中得到標準人參的統計值。然後將統計數據優選存儲在計算機處理器的存儲器中用於進一步操作。
反覆地進行這些步驟(即化學分析、產生生物標誌信息和測定生物系統的應答)，以生成統計值大資料庫。將這些值進行編輯並輸入到算法中以生成標準化人參的2-和3-維草藥應答陣列(HBR陣列)。通過反覆操作，所得陣列(即標準化陣列)顯示出標準化人參的成分(包括生長條件)、生物標誌信息和生物應答之間最密切的相互關係。通過測定兩個或多個成分和生物標誌信息值的已知相關變量，經由在測試批次的HBR陣列上的顯示，通過比較測試值和標準化人參的標準化HBR陣列值，可以預測測試批次的生物應答變量的值。所得預測結果將用於評估所給人參批次的質量，而不需要使用生物系統的觀測的生物應答(參見實施例2)。
實施例8.使用與特定生物應答相關的變量子集評估選定的人參草藥組合物為了評估測試批量草藥組合物的質量，首先收集選定的草藥組合物中的草藥的與植物有關的參數數據(例如植物種類、植物部分、地理來源、生長條件、加工方法和儲存條件)。然後對選定的草藥組合物進行處理，使其可以進行化學分析以確定草藥的化學含量(參見Elkin等，中國藥理學報(1993)1497-100和Yoshikawa等，藥學雜誌(1993)113460-467)。以前得到的人參數據已顯示需氧運動過程中的耗氧量與存在皂甙成分、尤其是Rg1和Rb1之間關係非常密切(Wang等，植物醫學(1998)64130-133)。
然後使測試批次與試驗細胞接觸，試驗細胞包括但不限於濃度為0.5mg/ml至100mg/ml的成纖維細胞、巨噬細胞、單核細胞、PMNL、LAK細胞、B16-F10黑瘤細胞、THP-1細胞和海馬神經元，以測定表達生物標誌值。從接觸後的細胞分離得到mRNA，隨後進行處理以用作使用包含IL-8、IL-2和幹擾素γcDNA的微陣列進行的對生化提取物的基於雜交的表達監控的底物(Schena等，科學(1995)270467-470；Schena等，美國國家科學院院報(1996)9310614-10619；Lockhart等，自然生物技術(1996)141675-1680；DeRisi等，自然遺傳學(1996)14457-460；Heller等，美國國家科學院院報(1997)942150-2155)。以前得到的人參數據已證明在需氧運動過程中的耗氧量和試驗細胞中表達生物標誌IL-8、IL-2和幹擾素γ的誘導之間有密切關係(Venkatraman等，醫藥科學體育運動(1997)29333-344和Wang等，植物醫學(1998)64130-133)。對於生化生物標誌，使大鼠骨髓細胞與測試批次接觸並測定有絲分裂的[3H]-胸苷結合反射。以前得到的人參數據已證明了Rb1和Rg1顯示出與大鼠骨髓細胞中的DNA合成有密切關係(Yamamoto等，Arzneimittelforschung(1978)282238-2241)。
反覆分析後，將從各個測定得到的數據輸入到算法中，以在列舉的與植物有關的數據包括化學分析和與某些生物標誌有關的數據的基礎上產生選定草藥組合物的試驗HBR陣列。通過比較試驗HBR和指向上述觀測結果和子集的分析的標準人參的標準化HBR陣列變量來確定測試批次的質量，其中IL-2、IL-8和INFγmRNA在體外的誘導和大鼠骨髓細胞中[3H]-胸苷結合的增加的證明表現(包括收集的有關生長條件、來源和皂甙Rg1和Rb1的檢驗的數據)是測試批次對耗氧量的等價生物應答作用的預兆，正如標準人參所顯示的那樣。在該操作的基礎上，可以確定測試批次與標準物質在所給生物應答或所感興趣的生物應答方面是否有類似或不同的質量。
實施例9.建立黃連(HL)配方的標準化HBR陣列為了進行該實施例，選擇的標準黃連(HL)是來自西南亞的Coptis chinesis France，其中生長條件是本領域技術人員熟知的(參見Huang，中草藥藥理學(1993)，69和287-288頁，CRC Press，Boca Raton，FL)。通過定量化學分析檢驗乾燥黃連根莖的化學含量，測定砷、小檗鹼、暗酸(caeruleic acid)、非洲防己鹼、copsine、黃連次鹼、黃連甙I(coptiside-I)、黃連甙-II、黃連鹼、考雷明、表小檗鹼、阿魏酸、greenlandicine、異黃連鹼、光暗酸、木蘭花鹼、氧化小檗鹼、唐松草分定、傘花鹼、urbenine、甲基黃連鹼、巴馬汀、藥根鹼和非洲防己鹼(還參見Zhu M.，中藥通報(1984)963-64)。不同草藥的生物鹼小檗鹼的含量應當在7-9％(重量)之間。這些數據將優選儲存在計算機處理器的存儲器中，以用於進一步操作。
標準HL的表達生物標誌包括以下這些NfκB；bc1-2類似物，A1；鋅指蛋白，A20；IL-2受體；細胞周期探針；c-Ki-ras2；生長調節劑探針和糖皮質激素受體依賴性細胞凋亡探針(參見Chi等，生命科學(1994)542099-2107；Yang等，瑙約-施密特貝爾格藥物學文獻(1996)354102-108；Miura等，生化藥理學(1997)53；ChangK.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14)。另一方面，對於更廣的批次大小，可使用400,000寡核苷酸組/1.6cm2Affymetrix晶片(美國專利No.5,556,752)。標準HL的表達生物標誌如實施例1中所述利用微陣列技術製備，包括分析和統計數據產生。標準HL的生化生物標誌包括糖皮質激素受體的增加和與HL接觸的HepG2細胞中甲種胎兒球蛋白分泌的抑制(參見Chi等，生命科學(1994)542099-2107)。如實施例1所述產生BBM集並進行分析。然後將統計數據優選儲存在計算機處理器的存儲器中，以用於進一步操作。
生物系統的生物應答將用細胞和完整動物進行測定。各批選定的草藥組合物將與特定細胞類型接觸，包括但不限於人HepG2肝細胞瘤細胞、人胚胎癌細胞和胸腺細胞，濃度為0.1-100mg/ml。對於動物處理，將0.1mg-2g/kg的黃連草藥組合物(即HL)口服給藥、通過腹膜內注射或皮下注射給藥。為了確定生物系統對標準化HL的生物應答，使人胚胎癌克隆NT2/D1與各種濃度的標準HL接觸，並檢驗其分化到細胞中的情況，此時有神經元樣細胞形態(Chang K.S.，JFormos Med Assoc(1991)9010-14)。測定反覆進行以產生測量值並如實施例1中對人參所述進行分析。生物系統對標準HL的生物應答的第二個獨立測定將是標準HL對因腸毒素大腸桿菌(Escherichiacoli(ETEC))引起的腹瀉的作用。因ETEC而出現腹瀉的病人用不同濃度的HL(例如2g/kg)進行治療，並測定大便體積(參見例如Rabbani G.H.，Dan Med Bull(1996)43173-185)。測定反覆進行以產生測量值並如實施例1中對人參所述進行分析。然後將每個生物系統的分布集輸入到算法中以產生標準HL的統計值。然後將統計數據優選儲存在計算機處理器的存儲器中，以用於進一步操作。
最後，如實施例1中所述，重複各步驟以得到標準化HL的HBR陣列，其中所得HBR陣列將隨後用於預測生物活性和評估批次質量。用這種方法，可以產生並定期更新標準化HBR陣列。
實施例10.用與特定生物應答相關的變量子集評估選定的黃連草藥組合物為了評估選定的測試批次的黃連草藥組合物的質量，首先收集關於與植物有關的特徵的數據(例如植物種類、植物部分、地理來源、生長條件、加工方法和儲存條件)。然後處理草藥組合物使其可進行化學分析以確定組合物的化學含量(也參見Zhu M.，中藥通報(1984)963-64)。
以前得到的HL數據已證明人胚胎癌克隆向神經元樣細胞中的終末分化與小檗鹼的存在密切相關(參見Chang K.S.，J Formos MedAssoc(1991)9010-14)。然後使測試批次與試驗細胞接觸，試驗細胞包括人胚胎癌克隆NT2/D1，起始濃度為無毒濃度(其確定在普通技術人員的技能範圍內)。從接觸後的細胞分離得到mRNA，隨後對其進行處理以用作使用包含IL-2受體和NfκB的微陣列進行的對生化提取物的基於雜交的表達監控的底物(參見Chi等，生命科學(1994)542099-2107；Yang等，瑙約-施密特貝爾格藥物學文獻(1996)354102-108；Miura等，生化藥理學(1997)53；Chang K.S.，J FormosMed Assoc(1991)9010-14；美國專利No.5,556,752)，這可用於測定所述細胞中c-Ki-ras2基因表達的向下調節。以前得到的HL數據已證明人胚胎癌克隆向神經元樣細胞中的終末分化與促細胞分裂原探針的誘導以及c-Ki-ras2基因表達的下調密切相關(參見ChangK.S.，J Formos Med Assoc(1991)9010-14)。
對於生化標誌，使HepG2細胞與測試組合物接觸，並測定細胞的糖皮質激素受體增加和甲種胎兒球蛋白分泌抑制的情況(參見Chi等，生命科學(1994)542099-2107)。以前得到的HL數據已顯示糖皮質激素誘導的細胞凋亡的抑制與小檗鹼型生物鹼密切關聯(參見Miura等，生化藥理學(1997)531315-1322)。反覆分析後，將從各個測定得到的數據輸入到算法中，以在列舉的觀測數據、化學數據和關於某些生物標誌的數據的基礎上產生試驗HBR陣列。
通過比較試驗HBR和指向上述觀測結果和子集的分析的標準HL的HBR陣列變量來確定測試批次的質量，其中HepG2細胞的IL-2受體和NfκB的誘導、c-Ki-ras2基因表達的下調、糖皮質激素受體的增加以及甲種胎兒球蛋白分泌的抑制的證明表現(包括收集的有關生長條件、來源和小檗鹼生物鹼的檢驗的數據)是測試批次對人胚胎癌克隆向神經元樣細胞中的終末分化和地塞米松誘導的細胞凋亡的抑制的等價生物應答作用的預兆，正如標準HL所顯示的那樣。在該操作的基礎上，可以確定測試批次與標準物質是否有類似或不同的質量。
實施例11.用兩個生物測定評估小柴胡湯(sho-saiko-to)為了評估三種來源的小柴胡湯的質量，使用兩個生物測定1)細胞生長抑制和2)B型肝炎病毒從受感染細胞的分泌。小柴胡湯組合物由6-7種草藥植物的混合物製成(柴胡(Radix Bupeuri)，半夏(Rhizoma Pinelliae)，生薑(Rhizoma Zingiberis)，黃芩(RadixScutellariae)，大棗(Fructus Ziziphi)，黨參(CodonopsisPilosula)，人參(Radix Ginseng)和甘草(Radix Glycyrrhizae)，參見表2的相對量，以重量計)。
表2.小柴胡湯的組成
三個「配方」來源於新加坡、韓國或臺灣。評估各批次的毒性和抑制B型肝炎病毒的能力，利用DNA定量或對B型肝炎表面抗原(HbsAg)的檢測來測定(參見Dong等，美國國家科學院院報(1991)888495-8499)。
簡言之，1克製劑加10ml水。將該混合物煮沸30分鐘。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。使用兩種細胞類型a)分泌B型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學院院報(1987)841005-1009)和b)HepG2細胞(ATCCcat # HB-8065)。1比50倍稀釋後用於各項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學院院報(1991)888495-8499中所述進行。用三個批次得到的測定結果顯示在表3中。根據這些數據，選定臺灣來源的那份作為標準草藥組合物，因為其毒性低，且其有效地將HbsAG分泌(這與病毒的釋放成比例)減少了一半以上。
表3.小柴胡湯(Sho-saiko-to)的生物測定
表2和3中顯示的有關臺灣草藥組合物的數據構成了這種草藥組合物的標準化HBR陣列的原始數據。因此，該數據集一開始將包括草藥組合物的來源、植物種類以及草藥組合物中各種草藥的相對用量，和兩種生物應答(即細胞生長抑制和B型肝炎病毒從受感染細胞的分泌)。
用圖1以及實施例1和3中列出的步驟，可以收集標準草藥組合物的與植物有關的數據、標誌和生物應答等其他數據。將這些進一步數據加入到原始的標準化HBR陣列中，產生擴展的標準化HBR陣列。如詳細的說明部分和實施例中所述的那樣，可以對所得資料庫進行適當的分析，以確定與所感興趣的生物應答最密切相關或相聯的變量子集。用圖2以及實施例2和4的操作中說明的方法可以確定批量HBR陣列。
所得批量HBR陣列可以與標準化HBR陣列對比，以便預測該批量草藥組合物的生物應答。
實施例12.草藥製劑草藥提取物製劑的標準化方案如下將適當比例的原藥材組分置於夾套反應鍋中，在抬高的恆定溫度下邊混合邊用水提取。用120目篩將固體與液體分離。收集所得濾液，通過在減壓下將水蒸發而濃縮。濃縮液在抬高的溫度下噴霧乾燥得到顆粒狀粉末劑。然後將該散裝物質配製成所需劑型。
實施例13.評估黃連湯黃連湯(HQT)是一個中藥古方，由四種不同草藥組成黃芩(scute)，甘草(licorice)，芍藥(白芍)和大棗(椰棗)。(表4)。這個草藥配方從300AD.起就在亞洲長期用於治療各種胃腸疾病。
表4.TCM配方HQT的草藥組分
生物和酶測定表5.批量性能(HQT)
簡單地說，每批黃連湯(HQT)1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表5中所述進行處理。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。用兩種細胞類型來測試每批HQT的生物作用a)Jurkat T細胞(ATCC cat #TIB-152)和b)HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)。1比50倍稀釋後用於每項測定。將冷凍的細胞(107/ml)在37℃水浴中快速融解。然後細胞用10ml預熱的培養基稀釋(參見LifeTechnologies，Inc.，商品目錄與索引，1998-1999，細胞培養物部分)，接著以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，細胞在100ml培養基中在37°、5％ CO2下培養。2天後，對細胞計數(大約8×105/ml，總共100ml)。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制B型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克製劑加10ml水。將該混合物煮沸30分鐘。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌B型肝炎病毒的HepG2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋後用於每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學院院報(1991)888495-8499中所述進行。
測定β-葡萄糖醛酸酶，因為HQT因其抗腹瀉性能而眾所周知。將不同HQT提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mM Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自SigmaTM)，使終體積為80μl。37℃下培養2小時後，用含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應終止，並用動力學微量平板讀數器在540nm下監測OD。
用三個批次得到的測定結果顯示在表6中。在這些數據的基礎上，HQT來源A和B具有相對批次HQT C來說較低的毒性以及更高的抑制活性(即，與HQT A或B相比，對HepG2細胞的毒性約大5倍，而對β-葡萄糖醛酸酶的抑制活性小3.3倍，參見表6)。
表6.三種HQT製劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2 Jurkatβ-葡萄糖 DNA醛酸酶HQT A 0.6 1.50 0.76 無HQT B 0.7 1.60.81 NDHQT C 2.2 0.32 ND ND*數值表示 ％對照IC50值.
ND，未測定.
HQT對蛋白質表達的作用的評估藥物加入前24小時，將HepG2細胞(1×106)種植於25cm2燒瓶中的3.0ml RPMI-1640培養基中(參見Life Technologies，Inc.，商品目錄與索引指南，1998-1999，細胞培養物部分)。細胞用或不同草藥處理，用草藥處理時分別以兩種終濃度0.2mg/ml或4mg/ml加入，並在37℃下培養24小時。去除培養基，細胞用冷的PBS洗滌兩次。將細胞收穫到1ml PBS中並以10,000rpm離心2分鐘，在冰上用含有50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.2mM PMSF和10％甘油的緩衝液提取，接著進行三個冷凍-融解循環。以終濃度0.15M向細胞溶解產物中加入氯化鉀，之後離心。測定蛋白質濃度，細胞提取物按照Laemmli的方法(自然(1970)227680-685)進行電泳。蛋白質印跡利用本領域公知的標準技術進行，參見例如Sambrook等(1989)。所用抗體指向以下蛋白質Topo I；Stat(20707)；細胞周期蛋白B1；MAPK(Ab2)和Nm 23 H1。
圖4顯示了較高濃度的HQT A或HQT B對細胞周期蛋白B1多肽表達的差別作用。
HPLC分析用Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析並用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監控。流動相以1ml/分鐘傾注，並由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘裡溶劑變為10％溶劑A/90％溶劑B。在這之後加入100％溶液A持續5分鐘。HPLC標誌是黃芩甙和黃芩甙元。
質譜草藥提取物用從PE Biosystems購得的MarinerTMESI-TOF質譜(MS)進行分析。對照示蹤物用HQT中的兩種已知活性成分黃芩甙元和黃芩甙產生。
用水和酸處理過的HQT批次樣品通過HPLC和質譜法進行分析。水處理的HQT批次A和B具有不同的HPLC和MS示蹤物，但酸處理的批次得到了幾乎相同的圖形(數據未顯示)。
算法用從所用的多維分析部分收集的數據生成多變體正常分布集，作為測定生物活性與標準HQT化學(HPLC和質譜)以及來源/生長特徵之間的相互關係基準的方式。
實施例14.單個成分A.甘草對甘草(Glycrrhizae Radix)的評估甘草可用於潤肺止咳，幫助解除痙攣和疼痛。該實施例中所用的甘草批次的性能顯示在表7中。
表7.批次性能(甘草)
生物和酶測定為測定草藥來源的質量，對每個草藥提取物上清液進行測定並重複分析三次。對於給出的要測定的樣品，將1克草藥粉末溶於聚丙烯試管中的10ml 80℃去離子水中(中性pH)。然後試管如表7中所述進行溫育，之後離心得到上清液。測試各批甘草對抗HepG2細胞(ATCCcat #HB-8065)或Jurkat T細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。細胞如上所述培養24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制B型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克製劑加10ml水。將該混合物煮沸30分鐘。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌B型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋後用於每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學院院報(1991)888495-8499中所述進行。
另外，測定β-葡萄糖醛酸酶。將不同甘草提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mMTris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl，並如上文所述進行測定。
用兩個批次得到的測定結果顯示在表8中。在這些數據的基礎上，甘草批次A比批次B對Jurkat細胞有大得多的毒性(約9倍)且是更有效的β-葡萄糖醛酸酶抑制劑(參見表8)。
表8.四個甘草製劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2Jurkat β-葡萄糖醛 DNA酸酶甘草A 1.1 1.070.41 無甘草B NDND 3.6ND甘草C 2.1 ND ND ND甘草D NDND ＞2.0 53.8*數值表示 ％對照IC50值.
ND，未測定.
表達測定為了測定基因表達，Jurkat T細胞如下所述用草藥提取物處理使Jurkat細胞(107/ml)在37℃水浴中快速融解。然後細胞用10ml預熱的培養基稀釋(參見Life Technologies，Inc.，商品目錄與索引指南，1998-1999，細胞培養物部分)，接著以1500rpm離心5分鐘。丟棄上清液，細胞在100ml培養基中在37°、5％ CO2下培養。2天後，對細胞計數(大約8×105/ml，總共100ml)。
如上所述製備草藥提取溶液(例如，用2g草藥粉末製得20ml無菌溶液(0.1g/ml)。將細胞以2.5×105/ml的密度分到3個燒瓶中，每個燒瓶100ml。測定用對照(沒有提取物)以及10ml 10mg/ml和1mg/ml提取物進行。另外，用毒性結果來確定所給任何提取物的「高」和「低」濃度。加入提取物後，細胞培養物在如上所述的條件下培養24小時。對細胞計數，隨後收集到50ml離心管中。所得細胞顆粒用RNA分離方法處理以提取mRNA(參見例如Sambrook等，1989，7.3-7.39頁)。
微陳列微陣列印刷如下進行通過其銷售者從IMAGE協會文庫得到人基因克隆，包括來自不同組織的基因。大多數克隆已部分定序，序列可作為GenBank的dbEST資料庫中的表達序列標記得到。對克隆進行培養並用商業上可獲得的引物進行擴增，之後加到尼龍膜上(Chen等，基因組學(1998)51313-324)。用PC(個人電腦)控制陣列系統將約10ng每種擴增後的目標物應用於帶正電荷的尼龍膜上。陣列系統允許高密度斑點並能用24針排陣列工具在一片18-27mm的尼龍膜上沉積31,000個斑點。
CDNA探針和膜雜交各2微克mRNA樣品(mRNA如上所述分離得到)用無規則引物逆轉錄用生物素和/或地高辛配基標記。標記後的樣品用鹼處理，所得標記核酸沉澱後用於雜交。膜雜交和洗滌操作如Chen等(1998)公開的用標記探針進行。為了以雙色模式(即生物素和地高辛配基)檢測膜上的斑點，使用β-半乳糖苷酶-綴合鏈黴抗生物素蛋白(Strept-Gal)和鹼性磷酸酶-綴合地高辛配基抗體(抗-Dig-AP)。顯色後，採用成像方法進行圖象數位化(例如，平板掃描儀或數位照相機)。定量量度通過使用測量每個斑點的主要顏色成分的積分密度的程序的計算機分析進行測定，進行積分密度數據的回歸分析並找出統計異常值作為差別表達基因。
樣品1、2和甘草(ST117)的基因表達數據分別與冬蟲夏草提取物、茯苓(ST 027)和甘草相對應的提取物1、2和6利用以下方法進行測定用Jurkat T細胞評估各批次的毒性。
提取物如實施例6中所述加以製備。通過以5×105/ml的密度加入1ml Jurkat細胞而將細胞分到24孔培養板中。測定用對照(沒有提取物)以及所述5個濃度的提取物(參見表9)進行。用於細胞培養物測定的高和低濃度根據提取物對細胞的毒性在10mg/ml和0.05mg/ml之間變化(即，mg草藥提取物乾重/ml)。對於某些樣品，10mg/ml的毒性是這樣的將「高」和「低」濃度向下調節，但最大最小值之間至少保持一個數量級。例如，對於甘草(ST117)，「高」濃度是0.5mg/ml，「低」濃度是0.05mg/ml(參見表9)。加入提取物後，細胞培養物在如實施例6中所述的條件下培養24小時。對細胞計數，將所得數據制表以顯示提取物毒性。所得數據顯示在表9中。
表9.不同濃度的草藥提取溶液下的存活細胞數
注意初始細胞數是5×105/ml，培養24小時後變為10×105/ml。″-″表示所有細胞死亡。方案1.將1ml 5×105/ml Jurkat細胞加入到24孔培養板中。2.製備12種草藥提取溶液並滅菌。3.測試5種濃度的每個樣品。10mg/ml，5mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml4.將細胞在37℃下用5％ CO2恆溫箱培養24小時。
在每個分析中，對144×96個基因(即13,824個基因)進行分析(數據未顯示)，與對照相比有約100個基因顯示出顯著差異(表10)。有些基因被上調，而有些被下調。與對照差異的大小有時會根據與特定細胞接觸的草藥組合物的相對量而變化。C1欄下的數值(對照處理)和H或L(草藥)代表減去背景後的mRNA表達的強度(表10)。基因指示編碼在陣列AD中，其可追蹤到特定GenBank克隆。表達水平通過用H或L除以C來確定。在每種草藥處理過的樣品中13,824個基因中只有部分顯示出明顯變化，即上調、下調或無變化(參見表10)。rem K、L、M、N、O、P列中顯示的數值表示#1、#2、#6草藥處理的mRNA表達水平的比例名稱 C1 1H 1L 2h 2L陳列AD 轉導素樣增強子蛋白1Sg-Bk Sg-BkSg-BkSg-BkSg-Bk94,030腺苷琥珀酸裂解酶 55.29 8.55 7.15 46.7438.0791,097神經營養酪氨酸激酶，受體，1型 89.55 98.2970.2684.8393.8389,083MHC類I蛋白 HLA-A(HLA-A28，-B40，-Cw3) 80.68 61.9146.1359.8629.6487,083 85.33 50.9637.7553.2525.5486,131ESTs，高度類似於HELIX-LOOP-HELIX PROTEIN 99.48 109.46 105.62 56.6867.5485,129膜內在蛋白質E1690.64 72.1292.7537.9770.0885,112 35.23 60.8248.8744.0429.7184,075 89.56 77.5477.9 66.1 59.4483,129 118.83 108.15 118.05 75.8464.0982,082人類雄激素受體伴隨蛋白24(AI60.23 47.8734.9637.419.8482,027 65.11 90.0166.7466.3 64.4480,129 96.27 99.96109.381.8887.6680,035人小GTP結合蛋白Rab7 mRNA，完全 44.91 46.2325.1978.2140.7574,108 65.277.2568.0960.2 66.2174,012 34.68 60.9257.7324.6148.9373,132人KIAA0078基因的mRNA，完全編碼 109.86 103.38 82.3585.9769.1572,101人反-Golgi p230 mRNA，完全編碼 46.96 25.7618.3510.5417.8772,014開蓬還原酶 4.3715.0813.3142.8722.7670,101 60.86 13.5535.2333.3940.6569,107 37.92 31.4126.1282.8228.6468,064人KIAA0034基因的mRNA，完全編碼 2.241.27 5.31 0.21 2.5(H，L表示高濃度和低濃度)與未經處理細胞(C1)對比
62,117106.71 94.6783.9881.3961.4562,084NA 1.13 0013.550.5862,001不均一核核糖核蛋白A197.1171.9273.1642.0178.9461,118NA 89.5259.9754.1166.8643.0559,142ATPase，Na+/K+轉運，α1多肽 13.0315.4847.7527.7127.8659,13560.8590.2339.8393.0138.1758,087ESTs，不太類似於KIAA0062[人類] 77.7246.8676.3364.4322.5257,016成神經細胞瘤RAS病毒(v-ras)致癌基團相同物71.7116.4744.6139.5166.8956,0883-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A 56.7752.6659.5359.6 16.8956,060翻譯延伸因子1-α-1 81.2692.2892.0836.8679.0955,040043.5839.4753.6746.4254,134碳酸酐酶III 004.38 43.478.2353,048人類幹擾素調節因子3的mRNA 0.25 0033.47053,023人蛋白酶體亞單位HsC7-I的mRNA，完全c 67.7614.9842.3338.4866.5252,13549.2646.8144.4 72.9555.551,131ATP檸檬酸裂合酶 2.02 052.0639.336.0351,101多腺苷酸結合蛋白8.65 0.17 0.45 38.9914.3150,035血清白蛋白前體 0.88 010.2144.14047,055ESTs38.5331.6919.4543.8 56.146,09734.2635.9532.4939.8163.1945,100核糖體蛋白L526.1533.6 26.3 55.8648.5944,103NA 72.0154.3670.2775.4391.5343,03955.8618.0220.8311.6817.843,03514-3-3 PROTEIN TAU 86.8623.1836.2318.1412.7643,01972.4810.4 23.3827.5912.83
42,099 30.25 33.73 36.8361 51.5640,100ESTs 0 0 0.2 38.3712.7839,118硫氧還蛋白4.260.342.83 37.288.0339,007前α(球蛋白)抑制劑，H3多肽9.4624.06 15.8226.0825.4838,097NA11.81 6.9423.8280.1416.6538,081人GP36b糖蛋白mRNA，完全編碼 101.51 82.61 89.8622.8871.435,096 47.35 24.52 023.2 32.8834,143 61.23 2.9925.0530.6116.9332,118ESTs，微類似於酪蛋白激酶1相同物 21.98 8.9114.1153.5424.0132,034丙酮酸激酶，肌肉 78.41 54.15 79.3629.5640.530,102成視網膜細胞瘤結合蛋白P48 27.323.116.0662.3534.3930,033 70.49 30.32 65.1317.1833.6529,058NA25.77 16.66 059.8533.2429,035 60.19 57.12 86.6646.4756.5928,104核糖體蛋白S13 0 0 037.191.3728,035 71.46 35.93 51.8611.2730.7527,119 0 0 048.271.6627,097ESTs，中等類似於Etr-3[人類] 16.06 24.53 9.26 76.0124.3425,126ESTs 42.93 22.03 29.8867.7640.3925,106 61.948.38 43.4191.2658.8924,098人剪接體蛋白(SAP61)mRNA，完全編碼 24.26 25.43 21.8 56.1837.2824,071熱激70KD蛋白1 63.92 58.19 61.1 50.8666.2723,126 5.181.1 10.0854.7112.1123,099核糖體蛋白S3A 5.131.931.25 38.9914.3522,013真核起始因子4B61.849.95 41.5222.9949.11
22,0063-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A 83.1757.8439.8 40.0444.3320,126線粒體壓力-70蛋白前體 27.0222.1933.8656.8732.9720,104人真核翻譯起始因子(elF3)mRNA 22.0915.1717.3374.9819.1720,103層粘連蛋白受體(2H 5表位) 1.45 1.26 039.668.6719,098人 semaphorin(CD100)mRNA，完全編碼17.7914.3810.7952.9428.9718,103核糖體蛋白L5 31.4721.1330.0778.6 27.1818,084ESTs 54.6175.1746.1679.5 60.0117,103NA00033.962.8717,097NA1.52 2.1 1.21 37.7711.5917,062 92.7273.27103.64 69.7969.3516,103整聯蛋白，β1(纖連蛋白受體，β多肽， 00.92 041.3 1.8416,100人類E1B 19K/Bcl-2-結合蛋白Nip3 mRN0.79 00.7 38.068.2815,112 16.4711.6511.8746.5222.9814,103NA27.6134.2630.1855.6738.4514,011NA47.4234.8768.2838.7153.613,114人類克隆24689 mRNA序列20.6413.8719.2 51.2632.3412,144人類NADH泛醌氧化還原酶NDUFS 76.7867.2 76.1164.5 50.0412,111 40.0455.0446.3477.7846.0711,135 90.34114.29 87.8880.4987.2211,105核糖體蛋白質L38.27 14.4115.5936.8225.8711,053需鈣蛋白酶，大多肽L2 10.4823.5814.8 15.698.8710,136蘋果酸酶2，線粒體 74.3481.6390.9483.1874.8510,101ESTs 13.6516.3413.9747.5726.6809,136NA59.8295 87.1677.3483.5109,110ER腔蛋白質維持受體1 17.3 41.7348.9255.3235.56
09,085人磷脂轉移蛋白mRNA，完全編碼80.1488.8396.2280.477.4408,13841.5760.4 69.5373.27 81.2608,13267.22102.84 103.65 90.56 88.4308,122人類DRAK1的mRNA，完全編碼 32.0123.2147.7463.02 35.6408,10569.5858.7 84.4990.568.9108,05519.5 20.0122.8327.87 34.6607,11130.8 44.6748.7573.84 51.3107,107ESTs4.57 3.23 9.01 41.32 8.8306,13571.42112.68 128.81 102.8 101.4806,102ESTs39.8236.0332.5767.74 46.0406,101胞間粘著分子2 4.43 2.95 4.21 38.95 16.606,034核糖體蛋白L50000 33.9306,006人脆性X精神發育遲緩症候群相關蛋白 031.7100 004,13439.0354.6246.6171.858.8204,106鐵蛋白，輕多肽 15.7423.8121.9446.74 21.9403,14056.0888.3361.2993.174.0403,099ESTs22.9718.5712.1 52.83 23.4802,111ESTs，高度類似於HYPOTHETICAL 64.5 KD PRO34.8923.6325 77.41 28.8401,136人類5-氨基咪唑-4-甲醯胺的mRNA 21.3634.8423.9553.14 45.6601,058醯基輔酶A脫氫酶，C-4至C-12直鏈 60.6853.3573.2662.56 56.58總計116
以這種方式，我們能將特定基因表達與細胞和無、低(L)或高(L)用量的草藥組合物的接觸聯繫起來。以這種方式鑑定的許多基因編碼已知的代謝或生化途徑中的重要蛋白質。這些蛋白質中有許多對某些生理、形態和心理參數有直接和間接作用。因此，該方法可以將草藥組合物的特定遺傳指紋與其陣列生物作用關聯起來。這種關聯可以用於描繪或表徵草藥組合物，目的是用於質量控制和質量保證，和評估藥理學或毒理學性能。草藥配方中的主要和次要草藥的作用也可以利用該方法加以評定。
HPLC分用Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析並用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監控。流動相以1ml/分鐘傾注，並由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘裡溶劑變為10％溶劑A/90％溶劑B。在這之後加入100％溶液A持續5分鐘。HPLC標誌是甘草甜素。
算法用從所用的多維分析部分收集的數據生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標準甘草分子、化學(HPLC和質譜)以及來源/生長特徵之間的相互關係基準的方式。
B.黃芩黃芩(Radix Scutellariae)的評估黃芩已發現可用於降低毛細管滲透性和炎症。它也可用於治療腸炎和痢疾，增加膽汁的分泌以治療黃疸；減輕肌肉痙攣；治療咳嗽和驅蟲。該實施例中所用的黃芩批次的性能顯示在表11中。
表11.批次性能(黃芩)
生物和酶測定簡言之，每種黃芩提取物製劑1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表11中所述進行處理。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。測試各批黃芩對抗HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)或JurkatT細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。1比50倍稀釋後用於各項測定。細胞如上所述培養24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制B型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克製劑加10ml水。該混合物如表11中所述進行處理。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌B型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋後用於每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學院院報(1991)888495-8499中所述進行。
至於β-葡萄糖醛酸酶，將不同的黃芩提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mMTris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl。37℃下培養2小時後，用含有0.2M甘氨酸和0.2M NaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應終止，並用動力學微量平板讀數器在540nm下監測OD。
用三個批次得到的測定結果顯示在表12中。
表12.四個黃芩製劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2 Jurkat β-葡萄糖醛酸酶DNA黃芩A1.5 0.33 0.45 無黃芩B1.8 NDNDND黃芩C0.3 NDNDND黃芩DND0.65 ND27.5*數值表示 ％對照IC50值。
ND，未測定.
評估黃芩對蛋白質表達的作用提取物加入前24小時，將HepG2細胞(1×106)種植於25cm2燒瓶中的3.0ml RPMI-1640培養基中(參見Life Technologies，Inc.，商品目錄與索引指南，1998-1999，細胞培養物部分)。細胞用或不同草藥處理，用草藥處理時分別以兩種終濃度0.2mg/ml或4mg/ml加入，並在37℃下培養24小時。去除培養基，細胞用冷的PBS洗滌兩次。將細胞收穫到1ml PBS中並以10,000rpm離心2分鐘，在冰上用含有50mM Tris-Cl(pH7.5)、0.2mM PMSF和10％甘油的緩衝液提取，接著進行三個冷凍-融解循環。以終濃度0.15M向細胞溶解產物中加入氯化鉀，之後離心。測定蛋白質濃度，細胞提取物按照Laemmli U.K.的方法(自然(1970)227680-685)進行電泳。蛋白質印跡利用本領域公知的標準技術進行，參見例如Sambrook等(1989)。所用抗體指向以下蛋白質Topo I；Stat(20707)；細胞周期蛋白B1；MAPK(Ab2)和Nm 23 H1。
圖4顯示黃芩批次A和B對蛋白質印跡上分解的多肽的表達沒有不同影響。
HPLC分用Beckman ODS UltrasphereTM柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析並用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監控。流動相以1ml/分鐘傾注，並由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘裡溶劑變為10％溶劑A/90％溶劑B。在這之後加入100％溶液A持續5分鐘。HPLC標誌是黃芩甙和黃芩甙元。
用水和酸處理過的黃芩批次樣品通過HPLC進行分析。水和酸處理批次事實上無法區別開。
算法用從所用的多維分析部分收集的數據生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標準黃芩化學(HPLC)以及來源/生長特徵之間的相互關係基準的方式。
C.白芍芍藥(Paeonie lactiflora pallus radix)的評估芍藥可用於緩急止痛。還已知它能緩和韌帶和純化血液。該實施例中所用的芍藥批次的性能顯示在表13中。
表13.批次性能(芍藥)
生物和酶測定簡言之，每種芍藥提取物製劑1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表13中所述進行處理。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。測試各批芍藥對抗HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)或JurkatT細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。1比50倍稀釋後用於各項測定。細胞如上所述培養24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制B型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學院院報(1991)888495-8499)。
簡言之，1克製劑加10ml水。該混合物如表13中所述進行處理。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌B型肝炎病毒的2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋後用於每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學院院報(1991)888495-8499中所述進行。
將不同的芍藥提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mM Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl。37℃下培養2小時後，用含有0.2M甘氨酸和0.2MNaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應終止，並用動力學微量平板讀數器在540nm下監測OD。結果顯示在表14中。
表14.兩個芍藥製劑的生物測定*大腸桿菌HepG2Jurkat β-葡萄糖醛酸酶芍藥A 2.8 ＞1.51.1 無芍藥B ＞2.5ND NDND*數值表示 ％ of控制IC50值。
ND，未測定HPLC分析用Beckman ODS Ultrasphere柱(5微米顆粒，4.6mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析並用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監控。流動相以1ml/分鐘傾注，並由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘裡溶劑變為10％溶劑A/90％溶劑B。在這之後加入100％溶液A持續5分鐘。HPLC標誌是芍藥甙。
芍藥批次如圖5中所示利用HPLC進行分析。
算法用從所用的多維分析部分收集的數據生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標準芍藥化學(HPLC)以及來源/生長特徵之間的相互關係基準的方式。
D.大棗大棗(Ziziphi Fructus)的評估大棗可用於利尿和強身。該實施例中所用的大棗批次的特性顯示在表15中。
表15.批次性能(大棗)
生物和酶測定簡言之，每批大棗提取物1克加10ml水(1mg/ml)。該混合物如表15中所述進行處理。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。測試各批大棗對抗HepG2細胞(ATCC cat #HB-8065)或Jurkat T細胞(ATCC cat #TIB-152)或二者的情況。1比50倍稀釋後用於各項測定。細胞如上所述培養24小時。
利用DNA定量進行檢測，對各批次的抑制B型肝炎病毒的能力進行評估(參見Dong等，美國國家科學院院報(1991)888495-8499)。簡言之，1克製劑加10ml水。該混合物如表15中所述進行處理。離心後收集上清液並通過0.22μm濾器過濾。在該測定中使用分泌B型肝炎病毒的HepG2.2.15細胞(由G.Ace教授好心提供；參見Ace等，美國國家科學院院報(1987)841005-1009)。1比50倍稀釋後用於每項測定。細胞生長抑制測定進行72小時。其他所有操作如Dong等在美國國家科學院院報(1991)888495-8499中所述進行。
將不同的大棗提取物一式三份地加入到96孔平板的各孔中，其中各孔中含有0.1mM葡萄糖醛酸酚酞、70mM Tris-HCl(pH6.8)和0.8ng透析β-葡萄糖醛酸酶(來自大腸桿菌，購自Sigma)，使終體積為80μl。37℃下培養2小時後，用含有0.2M甘氨酸和0.2MNaCl(pH10.4)的200μl終止溶液使反應終止，並用動力學微量平板讀數器在540nm下監測OD。結果顯示在表16中。
表16.三個大棗製劑的生物測定*大腸桿菌 HepG2Jurkat DNAβ-葡萄糖醛酸酶大棗A1.2 1.5 5.1 無大棗BND＞2.0 ND 52.3大棗C2.5 NDND ND*數值代表％對照IC50值。
ND，未測定HPLC分析用Beckman ODS Ultrasphere柱(5微米顆粒，4.6 mm×25cm)通過HPLC對草藥批次進行分析並用UV分光光度計(Perkin Elmer)進行檢測。UV檢測波長在280nm和340nm下監控。流動相以1ml/分鐘傾注，並由以下梯度的溶劑AH2O和溶劑B20％MeOH組成1)頭5分鐘溶劑為100％溶劑A；2)接下來的10分鐘溶劑組合物變為10％溶劑A/90％溶劑B；和3)接下來的40分鐘裡溶劑變為10％溶劑A/90％溶劑B。在這之後加入100％溶液A持續5分鐘。大棗的HPLC標誌是白屈菜酸和cAMP。
大棗批次樣品如圖6中所示利用HPLC進行分析。
算法用從所用的多維分析部分收集的數據生成多變體正常分布集，作為確定生物活性與標準大棗化學(HPLC)以及來源/生長特徵之間的相互關係基準的方式。
實施例15.通過核酸微陣列分析來表徵草藥介紹核酸微陣列技術的迅速發展已導致基因表達數據的激增(Lander，1999，Duggan等，1999)。基因表達的四個特徵可解釋使用核酸微陣列來研究基因表達圖形的巨大價值。(i)核酸微陣列使得更容易立刻測量數千個基因的轉錄物。(ii)基因產物的功能與其表達型之間的緊密聯繫使得基因的功能可以預測。(iii)通過改變特定基因的表達水平使得細胞對微環境變化有良好反應。(iv)在細胞中表達的各組基因可確定細胞的起源是什麼、涉及哪些生化和調節系統，等等(Brown和Botstein，1999)。通過使用微陣列系統，上述特徵可以整體方式加以研究。
使用核酸微陣列技術可以檢測任何所需數量的基因的表達。例如，可以將最多約20,000個基因置於一個陣列上。我們已研製了一種帶有比色檢測系統的核酸微陣列(微陣列/CD)(Chen等，1998)。使用帶有呈現約10,000個不同人轉錄物的約10,000個cDNA的微陣列濾膜(2.7cm×1.8cm)來研究不同細胞系的基因表達圖形。已對微陣列/CD系統的靈敏度和檢出限作為表徵，它比得上帶有放射性檢測的系統或帶有雷射誘導的螢光檢測的系統(Bertucci等，1999)。
如前所述，細胞基因表達圖形描繪了細胞的來源、現時的分化以及對外部刺激物的細胞應答。換句話說，基因表達圖形揭示了細胞的狀態，微陣列是實現這一目的的理想工具。在本研究中，我們使用微陣列/CD系統來表徵細胞對外部刺激物的應答，在這種情況下，外部刺激物是中藥。反過來，我們還在所激發的基因表達圖形的基礎上將不同的草藥分類。
圖7是一個流程圖，描述了可用於建立用草藥組合物處理的細胞的表達應答數據集的通用方法。該方法包含以下步驟(a)通過在哺乳動物細胞培養物中培養各種濃度的草藥來確定草藥組合物的IC50濃度，並鑑定在預定時間後留下了50％存活細胞的濃度。
(b)對加有不同IC50濃度部分的草藥提取物的哺乳動物細胞培養物進行培養。
(c)在預定培養時間後收穫所培養的細胞並計數。
(d)將細胞從孵化箱中取出後立即溶解細胞並從細胞溶解產物提取mRNA。
(e)通過逆轉錄反應標記mRNA，使mRNA變成標記的cDNA。
(f)將標記的cDNA與植物來源的對照cDNA混合，與哺乳動物基因探針的微陣列進行雜交。
(g)通過分析微陣列雜交結果的數位化圖象來測量基因的表達水平。
(h)進行數據預處理，選出用於統計學分析的數據。
(i)獲得利用不同濃度的草藥組合物的微陣列實驗產生的表達數據。
(j)對數據進行預處理，選出在用不同濃度的草藥處理的細胞中具有統計學顯著性的基因。
(k)利用統計學方法諸如自組織圖型算法將表達圖形分到各聚簇中。
(l)在表達圖形聚簇的基礎上推斷草藥的特徵表達圖形。
圖8是一個流程圖，顯示了不同批次的草藥組合物的表達數據的數據集怎樣綜合後製作特定草藥組合物的表達圖形資料庫。然後使表達圖形資料庫成為HBR陣列的一部分。
含有表達圖形的HBR陣列還可用於鑑別未知的草藥組合物。圖9是一個流程圖，描述了用於鑑別未知草藥組合物的通用方法，該方法包括以下步驟(a)通過上述步驟構建含有草藥的特徵表達圖形或各種草藥的表達圖形的集合的HBR陣列。
(b)得到未知草藥組合物的特徵表達圖形數據集。
(c)對比含有用所述未知草藥組合物產生的特徵表達圖形的HBR陣列與含有用諸如Hamming間距算法等算法得到的表達數據的標準化HBR陣列。
(d)對可能的對準計分以鑑別出其特徵表達圖形在所述HBR陣列中已存檔的最可能的草藥組合物。
對含有表達圖形的HBR陣列的可能的對準計分這一步驟可以用Hamming距離矩陣的分級簇分析進行。Hamming距離矩陣的分級簇分析的使用是本領域中眾所周知的。
基因表達圖形也可加入到標準化HBR陣列中。正如已討論過的那樣，含有由草藥組合物產生的這種基因表達圖形的標準化HBR陣列可以用於研究草藥組合物的藥理學機理、用於發現草藥組合物的新應用和用於設計複方草藥製劑的優化配方。從圖10的流程圖可以看出，該方法一般可包括以下步驟(a)構建含有草藥組合物的特徵基因表達圖形的數據集。
(b)使用已知的統計學參數諸如變異係數，利用基因在數據集中的表達圖形的一致性對各個基因打分。
(c)在統計學計分的基礎上，對草藥的基因表達圖形進行選擇並加入到標準化HBR陣列中。
含有基因表達圖形的HBR陣列還可用於鑑別由複合化學成分組成的草藥組合物中單個化學成分導致的標記基因表達圖形，如圖11的流程圖所示。該方法包含以下步驟(a)通過上述步驟構建含有草藥組合物的特徵基因表達圖形的HBR陣列。
(b)利用高效液相色譜(HPLC)或液相色譜-質譜聯用(LC-MASS)確定草藥中化學成分的組成。
(c)對不同批次的草藥製劑重複步驟(b)。
(d)對各個基因的表達水平與草藥製劑中單個化學成分的量之間的相關係數打分。
(e)用超過0.99或小於-0.99的Pearson相關係數選擇單個化學成分的標記基因表達圖形。
使用核酸微陣列產生基因表達圖形，任何草藥組合物然後可通過使用該基因表達圖形加以表徵。另外，我們可以選擇不同表達的任何數量的基因包括在描繪基因表達圖形的數據集中。例如，可以選擇約10個基因、約100個基因、約500個基因、約1000個基因、約1500個基因、約2000個基因、約2500個基因或更多，或這之間的任何數目。
中藥黃芩和甘草組合的配方(黃芩湯)可止瀉、解痙和清熱。黃芩湯的組分是黃芩、芍藥、甘草和大棗。這個方子已用了1000多年，但對它的化學和生物醫學研究直到最近幾十年才開始。在該研究中，我們使用核酸微陣列技術來研究草藥處理過的細胞的基因表達圖形。我們的目標是證明使用微陣列/CD系統對不同草藥組合物或不同製劑分類的可行性，和找到黃芩湯處方的預示基因(標誌基因)。長期目標是找到各草藥組合物中的生化成分與不同處理過的細胞的基因表達圖形的關係，和以合理的方式解釋中藥的分子藥理學機理。
材料與方法1.細胞庫系統的開發目的微陣列系統是一種靈敏的檢測方法，可監測細胞的基因表達型。有必要建立一個具有主細胞庫(MCB)和工作細胞庫(WCB)的細胞庫系統，以將草藥測試中的細胞變異性減至最小。
範圍該細胞庫系統可用於微陣列研究中的所有類型的細胞。
儀器CO2氣體夾套恆溫箱(NUAIRETMDH autoflow)離心機(KUBOTA 2100)冰凍瓶(Corning Costar，Cat.#430659)組織培養燒瓶750ml(Falcon，Cat.#3045)組織培養皿150×25mm(Falcon，Cat.#3025)細胞Jurkat T細胞，購自Dr.Alexandra Ho試劑RPMI培養基1640(GIBCO BRL，Cat.#31800-014)二甲亞碸(DMSO)(Sigma，Cat.#D-2650)胎牛血清(HyClone，Cat.#SH30070.03，Lot#AGL7258)2-巰基乙醇(GIBCO BRL，Cat.#21985-023，5×10-2M)培養基I.培養用培養基90％ RPMI+10％肽牛血清+2-巰基乙醇(5×10-5M)II.冷凍培養基90％ RPMI 1640+10％ DMSO步驟A.主細胞庫1.進行標準無菌細胞培養操作。
2.將Jurkat T細胞種植在37℃、5％ CO2恆溫箱中的燒瓶中的培養基中。
3.培養2天後，對細胞計數並將細胞展開到兩個燒瓶中。注意細胞密度保持約5×104-2×106/ml。
4.細胞培養並計數，直到細胞數達到2×107。
5.將細胞收集到50ml離心管中並以1300rpm(300×g)旋轉5分鐘。
6.棄去上清液，細胞顆粒再懸浮於冷凍培養基。每瓶中的細胞數約為1×106/ml。
7.按照以下溫度變化方式將細胞緩慢冷凍-20℃持續2小時，-80℃持續24小時，然後將細胞置於液氮貯運器中。MCB中儲存共20個冷凍瓶。
B.工作細胞庫1.從在液氮箱中的MCB中取出一瓶細胞並在37℃水浴中快速融解。
2.將細胞轉移到10ml溫培養基中。
3.細胞以1300rpm(300×g)旋轉5分鐘。棄去上清液。細胞在燒瓶中用20ml培養基培養。
4.將細胞傳代培養到2個燒瓶中。
5.將在500ml培養基中的5×107個細胞種植到每個燒瓶中，同時攪拌，共2個燒瓶。細胞培養2天。
6.培養直到細胞密度達到1×106/ml，總體積為1L。
7.加入100ml胎牛血清和10ml DMSO製備冷凍培養基。
8.離心，棄去上清液，將細胞再懸浮於110ml冷凍培養基。
9.向每個冷凍瓶中分配1ml(1千萬個細胞/瓶)，共100瓶。按照上述溫度變化方式將細胞緩慢冷凍。
2.測定細胞培養物中草藥提取物的生長抑制濃度目的大多數藥物對細胞是有毒的。設計該實驗來檢驗草藥提取物在Jurkat T細胞中的毒性，並測定保持細胞存活的草藥提取物的生長抑制濃度。
範圍該測定可用於各種草藥提取物來檢驗毒性。
儀器CO2氣體夾套恆溫箱(NUAIRETMDH autoflow)計數室(Hemacytometer，Reichert，USA)顯微鏡(Zeiss，Axiovert 100)細胞Jurkat T細胞試劑RPMI培養基1640(GIBCO BRL，Cat.#31800-014)胎牛血清(HyClone，Cat.#SH30070.03，Lot #AGL7258)
2-巰基乙醇(GIBCO BRL，Cat.#21985-023，5×10-2M)培養基90％ RPMI+10％胎牛血清+2-巰基乙醇(5×10-5M)一次性無菌注射濾器(0.2μm，Corning，Cat.#21052-25)草藥提取物1.冬蟲夏草菌絲體2.ST 0243.ST 0444.ST 0515.ST 0936.ST 1177.ST 1238.ST 1289.ST 13410.ST 23711.PHY906-303503由4，6，7，10組成的複雜混合物12.PHY906-284003由4，6，7，10組成的複雜混合物步驟A.草藥提取物製劑1.將1克草藥粉末溶於聚丙烯試管中的10ml 80℃去離子水(中性pH)中。
2.試管在80℃水浴中培養30分鐘，同時輕微振搖，然後以4000rpm(1500×g)離心5分鐘，得到上清液。
3.以11000rpm(14000×g)離心10分鐘，收集上清液。
4.使用一次性無菌注射濾器過濾上清液。
B.細胞存活試驗t1.如上所述培養Jurkat T細胞。
2.以每孔1ml 5×105/ml細胞將細胞分配到24孔培養板中。
3.製備12種草藥提取溶液。這些提取溶液必須是新製備的且立即使用。
4.將100，50，20，10，5μl各草藥提取溶液加入到24孔培養板中，得到5種不同濃度10，5，2，1，0.5mg/ml。
5.細胞在充滿5％ CO2的恆溫箱中在37℃下培養24小時。
6.對每孔中的細胞計數。將10μl細胞溶液與10μl臺盼藍染料混合併裝載到細胞計數室中。
7.對四個主要正方面積計數，以計算細胞數。(4個面積中的細胞數)/4×104×稀釋因子＝每ml中的細胞數3.描繪用草藥提取物處理的Jurkat T細胞的基因表達型目的描繪用草藥提取物處理的Jurkat T細胞的基因表達型。使用帶有比色檢測系統的高密度核酸微陣列。
儀器熱滑塊(Boekel，Model 110002)分光光度計(Beckman，DV640)離心機(KUBOTA 1910)水浴(SLM AMINCO，Model 800)雜交恆溫箱(YIH DER OH-800)熱封機(TISH-300，TEW)試劑RNAzolTMB(Tel-Test，Cat.#CS-104)Oligotex mRNA Midi試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)雜交袋(GIBCO BRL，Cat.#18278-010)EasiSeal(Hybaid，Cat.#HBOSSSEZ1E)玻璃載物片(Matsunami，S2214，Japan)氣溶膠抗性吸頭(ART吸頭)(分子BIO-Products，Cat.
#2139)無規則六聚體引物(GIBCO BRL，Cat.#48190-011)逆轉錄酶和5×緩衝液(GIBC0 BRL，Cat.#18064-014)核糖核酸酶抑制劑(GIBCO BRL，Cat.#10777-019)生物素-16-dUTP(Boehringer Mannheim，Cat.#1093070)Dig-11-dUTP(Boehringer Mannheim，Cat.#1558706，)用於雜交的封閉粉末(Boehringer Mannheim，Cat.
#1096176)牛血清白蛋白(Sigma，Cat.#A2153)20X SSC(Amresco，Cat.#0918S-2-20XPTM5L)SDS(Merck，Cat.#113760)硫酸葡聚糖(Sigma，Cat.#D6001)
鏈黴抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶(GIBCO BRL，Cat.
#19536-010)抗-地高辛配基-AP Fab片段(Boehringer Mannheim，Cat.#1093274，)X-gal(GIBCO BRL，Cat.#15520-018)馬來酸(Sigma，Cat.#M1125)N-月桂醯肌氨酸(Sigma，Cat.#L5777)堅牢紅TR/AS-MX底物試劑盒(PIERCE，Cat.#34034)聚乙二醇(Sigma，Cat.#P2139)試劑製備1×雜交緩衝液(4X SSC，0.1％ N-月桂醯肌氨酸，0.02％ SDS，1％BM封閉試劑)20×SSC 16m1％ N-月桂醯肌氨酸8ml10％ SDS 160μlBM封閉粉末0.8gH2O 51ml共計 80ml加熱至65℃使粉末溶解，然後儲存在-20℃下。
50％ PEG-8000(聚乙二醇)PEG-8000 10gH2O加至 20ml加熱至65℃使溶解，然後高壓滅菌。等分試樣並儲存在-20℃下。
10×TBS(100mM Tris，1.5M NaCl，pH7.4)Tris鹼 12.1gNaCl 87.6gH2O 加至 1000ml
120mM X-galX-gal 100mgDMF2ml-20℃下儲存。
X-gal底物緩衝液(1mM MgCl2，3mM K3Fe(CN)6，3mM K4Fe(CN)6溶於1X TBS緩衝液中)500ml10X TBS/pH7.4 50ml亞鐵氰化鉀 633.5mg高鐵氰化鉀 493.9mgMgCl2101.6mg過濾並在-20℃下儲存。
BM封閉稀釋緩衝液/pH7.5(0.1M馬來酸，0.15M NaCl)1M馬來酸 100ml5M NaCl30ml固體NaOH 7.5gH2O 加至 1000ml10％封閉試劑 10ml封閉粉末 10g封閉稀釋緩衝液(沒有吐溫20) 100ml加熱至70℃後高壓滅菌。4℃下儲存。
20％硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖 2gH2O加至 8ml高壓滅菌後儲存在-20℃下。
DEPC-處理過的水800ml二碳酸二乙酯(4℃下儲存)400μlH2O 800ml
置於37℃搖動水浴中4小時，然後在37℃溫室中過夜。溶液高壓滅菌兩次，各45分鐘或25分鐘。
步驟A.Jurkat T細胞的製備1.融解1瓶Jurkat T細胞。轉移到10ml生長培養基中。融解的瓶數取決於要進行的試驗數。一般說來，2個草藥提取物試驗需要1瓶細胞。
2.將細胞再懸浮於50ml培養基中。
3.細胞培養1天。加入150ml培養基並分到兩個燒瓶中，每瓶100ml。
4.細胞培養3天。
5.更換培養基並分到4個燒瓶中，每瓶100ml培養基。
6.細胞培養2天。
7.對細胞計數。收集細胞並旋轉沉澱。將帶有培養基的細胞顆粒再懸浮至5×105細胞/ml，每瓶100ml。
8.細胞培養3小時，然後加入草藥提取物。
B.草藥提取物處理1.製備草藥提取物(參見草藥提取物的製備)。
2.按照利用細胞存活實驗確定的草藥提取物的生長抑制濃度，計算每個草藥提取物的50％生長抑制濃度。
3.定義50％生長抑制濃度為H。用以下濃度的草藥提取物的系列稀釋液處理細胞H，H/2.5，H/5，H/10，H/20。
4.細胞培養24小時。
5.收集細胞並對細胞計數。離心得到細胞顆粒。
6.細胞顆粒用1×PBS洗滌一次。
7.棄去上清液。細胞顆粒準備用於總RNA分離。
C.總RNA的分離1.每107個細胞加入1ml RNAzolTMB。將細胞顆粒勻化但不渦旋。
2.每毫升勻漿加入0.1ml氯仿，緊緊地蓋住樣品，用力搖動1分鐘(不渦旋)。置於冰上15分鐘。
3.在4℃下以12000rpm(13500×g)離心15分鐘。
4.離心後，勻漿分成兩相下層是藍色苯酚-氯仿相，上層是無色水相。DNA和蛋白質在中間相和有機相中。將水相轉移到新的試管中，加入等體積的異丙醇，該樣品在-80℃下儲存。注意。加入的異丙醇的範圍是0.7至1體積的水相溶液。
5.樣品保持在-80℃下直至使用。離心前使樣品完全融解，並通過反轉試管混合2-3次。樣品以13000rpm(15000×g)離心15分鐘。
6.除去上清液，RNA顆粒用1ml 75％乙醇洗滌1次。以13000rpm(15000×g)在4℃下離心3分鐘。
7.棄去上清液。顆粒在真空下乾燥1分鐘。注意。不要讓RNA顆粒完全乾燥。這將大大降低其溶解度。
8.通過移液管將RNA顆粒溶於50-100μl二碳酸二乙酯(DEPC)-處理過的水。注意。如果顆粒難以溶解，將這些顆粒在60℃下溫育10-15分鐘會有幫助。
9.用分光光度計測量260nm(A260)和280nm(A280)下的吸光度。濃度分析OD260×40ng/μl×稀釋因子＝總RNA(ng/μl)。
D.從總RNA分離聚腺苷酸+mRNA1.按照表17確定起始RNA的量以及緩衝液OBB和要加入到RNA溶液中的Oligotex懸浮溶液的適宜體積。
表17.用於Oligotex mRNA旋轉-柱方案的緩衝液量
以下步驟是基於使用500μg總RNA為例。
2.向總RNA樣品中加入500μl 2×結合緩衝液和30μl Oligotex懸液。通過翻轉試管使內容物充分混合。
3.樣品在70℃下培養10分鐘。
4.室溫下培養20分鐘。
5.以最大速度(14000-18000×g)離心2分鐘並吸出上清液。
6.將顆粒再懸浮於400μl洗滌緩衝液OW2並轉移到旋轉柱上，該旋轉柱離心1分鐘。
7.用400μl OW2洗滌並如上所述離心。
8.將20μl預熱(70℃)的洗脫緩衝液加到柱上並將樹脂再懸浮。蓋上微量離心管。
9.帶有1.5ml微量離心管的旋轉柱在70℃下放置3分鐘。
10.柱子在室溫下以最大速度離心2分鐘。
11.再次洗脫。(重複步驟8-10以獲得更好的收率)E. cDNA標記1. 將2μg mRNA、1μl用於單色標記的對照植物mRNA(Hat221×109，Rbcl5×108，Ga41×108，Rca5×107，Asal1×107，Atps5×106個分子/μl)、6μl 50mM無規則六聚體和DEPC-H2O混合至28.88μl終體積。對於雙色模式，在生物素或Dig標記中各自使用2μg mRNA並單獨加入對照植物mRNA1.生物素標記Hat221×108，Rbcl5×107，Ga42×107，Rca1×107，Asal1×107，Atps1×107，Hat41×107/μl。2.Dig標記Hat221×107，Rbcl1×107，Ga41×107，Rca1×107，Asal1×108，Atps5×107，Hat42×107/μl。
2. 70℃下改性10分鐘，然後在冰中快速冷凍5分鐘。
3. 加入10μl 5×第一鏈緩衝液、5μl 0.1M DTT、1μl 25mMdATP、dCTP、dGTP混合物、1μl 2mM dTTP、2μl 1mM生物素-16-dUTP、或Dig-11-dUTP(1mM)、0.63μl 40U/μl RNAsin和1.5μl Superscript II(逆轉錄酶，GIBCO BRL)(200U/μl)。
4. 充分混合併在25℃下培養10分鐘，然後在42℃下培養90分鐘。
5. 94℃下停止反應5分鐘。
6. 50℃下加入5.5μl 3M NaOH持續30分鐘。
7. 50℃下加入5.5μl 3M CH3COOH保持30分鐘。
8. 通過加入34μl水、50μl 7.5M醋酸銨、10μg線性聚丙烯醯胺載體和380μl無水乙醇使標記的cDNA沉澱。
9. 樣品在-80℃下培養30分鐘。以13000rpm離心15分鐘。
10. 顆粒用1ml 70％乙醇洗滌並以13000rpm離心5分鐘。
11. 將顆粒溶於36μl高壓滅菌過的水中。對於雙色，將兩種標記的cDNA結合在一起。
F.陣列雜交1. 帶有9600 EST PCR產物的濾膜在5ml 1×雜交緩衝液(4XSSC，0.1％ N-月桂醯肌氨酸，0.02％ SDS，1％ BM封閉試劑(Boehringer Mannheim))和50μg/ml鮭精DNA(GIBCO BRL)中在63℃下預雜交1.5小時。注意。可以製備80ml 1×雜交緩衝液並將其儲存在-20℃下。使用前在60℃下將緩衝液融解。
2. 將粘著的EasiSeal_方塊的一面粘在乾淨的玻片上，並將預雜交的膜置於該方塊的中心，斑點朝上。
3. 將探針與2μl聚-d(A)10(10μg/μl)和2μl人Cot-1 DNA(10μg/μl)(GIBCO BRL)和40μl 2×雜交緩衝液混合至終體積80μl。
4. 探針混合物在95℃下變性5分鐘，然後在冰上冷卻。
5. 濾膜在雜交袋中用探針溶液封閉。
6. 在95℃下培養5分鐘，然後在63℃下培養12-16小時(過夜)。
7. 濾膜在室溫下用5ml 2×SSC，0.1％ SDS洗滌2次，持續5分鐘。
8. 63℃下用5ml 0.1×SSC，0.1％ SDS洗滌三次，每次15分鐘。
9. 濾膜在室溫下用含有2％硫酸葡聚糖的5ml 1％BM封閉試劑封閉1小時。
10. 用5ml含有700×稀釋鏈黴抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶(1.38U/ml，酶活性)(GIBCO BRL)、10000×稀釋抗-地高辛配基-鹼性磷酸酶(0.075U/ml，酶活性)(Boehringer Mannheim)、4％聚乙二醇8000(Sigma)和在1×TBS緩衝液中的0.3％ BSA的混合物在室溫下培養2小時。注意。該配方是用於雙色模式。對於單色模式，不需要抗-Dig-AP，且培養時間可減至1小時。
11. 用1×TBS緩衝液洗滌3次，每次5分鐘。
12. 通過將50μl 120mM X-Gal和5ml X-Gal底物緩衝液混合來製備新鮮的X-gal底物溶液(1.2mM X-gal，1mM MgCl2，3mMK3Fe(CN)6，3mM K4Fe(CN)6在1×TBS緩衝液中)。將濾膜在37℃下浸入X-gal底物溶液中45分鐘，同時輕微搖動。
13. 用1×TBS洗滌。
14. 雙色顯色膜用5ml堅牢紅TR/萘酚AS-MX底物(Pierce，Rockford，IL)在室溫下著色30分鐘，同時輕微搖動。
15. 用去離子水洗滌。用含有20mM EDTA的1×PBS終止反應20分鐘。
16. 將濾膜空氣乾燥。
結果1.測定細胞培養物中的草藥提取物的生長抑制濃度。
每種草藥提取物具有不同的細胞毒性，因此需要在用每種草藥處理細胞之前先測定它的生長抑制濃度。將草藥提取物的5個系列稀釋液(10，5，2，1，0.5mg/ml)加入到5×105/ml培養細胞中，並在37℃、5％ CO2下在恆溫箱中培養24小時。表18中顯示了不同濃度的草藥提取物下存活細胞的數目。
表18.不同濃度的草藥提取物下的存活細胞數
注意起始細胞數是5×105/ml。培養24小時後數量增加至10×105/ml。「-」指示所有細胞死亡。
沒有加入草藥提取物時的細胞數在培養24小時後加倍。另一方面，用不同的草藥處理，存活的細胞數也不同。我們選擇50％生長抑制濃度(IC50)作為高濃度，其十分之一作為低濃度。為了保持JurkatT細胞系的一致性，建立細胞庫系統。在細胞庫中，共將100瓶細胞(1千萬個細胞/瓶)冷凍在-150°冷凍庫中。
2.通過核酸微陣列分析對草藥進行分子分類對3種單一組分草藥的分析。將三種單一組分草藥冬蟲夏草(CSM)、ST024和ST117用於如方法部分中所述處理細胞培養物。基因表達測量通過使用各自呈現不同人轉錄物的13824個cDNA片段的微陣列進行。至於數據分析，選擇高數據質量的基因斑點。選擇是在信號與背景的比值大於2.5或斑點面積的變異係數(CV)小於10％的基礎上進行。所有數據集用沒有接受草藥處理的對照細胞規格化。對於那些小於10的斑點強度都四捨五入到最多為10。在選擇標準的基礎上，共選擇了492個具有大於1.5的差別表達率的基因用於簇分析。這些數據的預處理操作利用內部開發的程序「DataExtract」和「Ratio2」進行。
這492個基因利用平均連接法進行簇分析。基因間的距離用作線性相關係數或相似係數。簇分析程序Cluster和TreeView是基於分級聚簇法，是由史丹福大學的Dr.Michael Eisen編寫的(Eisen，1999，Eisen等，1998)。結果顯示在圖12中。從圖12C可以清楚地看出高和低濃度的三種不同草藥各自聚集在一起。例如，在聚簇樹中CSM-L更接近CSM-H而與ST024或ST117不怎麼類似。基於非分級法的另一種不同的簇算法-自組織圖型算法得到的結果相同(數據未顯示)。從圖12A和13A中顯示的聚簇結果來看，有些特徵是顯著的。(1)4個基因被ST117處理上調，但卻被其他草藥處理下調(圖12B)。(2)34個基因被CSM處理下調，但卻被其他草藥處理上調(圖13B)。(3)2個基因被所有三種草藥處理上調，一個是蘋果酸酶2，另一個是無名基因(克隆ID328351)(圖13C)。(4)12個基因大大受到所有三種草藥的高濃度處理的誘導，但幾乎未受低濃度處理的誘導(圖13D)。
對2種多組分草藥製劑的分析。將各自有低濃度和高濃度的兩批黃芩湯PHY906-303503(#11)和PHY906-284003(#12)用於三個獨立的實驗中來處理細胞培養物。用9600個非豐餘cDNA的微陣列獲得基因表達圖形。如上所述完成了數據的預處理步驟後，選出了約5000個基因用於隨後的數據分析。每種草藥處理重複3次。對於數據分析，我們使用在Slonim等報導的一種方法(Slonim，1999)上的改進方法。以下算法就是設計用來尋找在三次重複實驗中具有高的差別表達率但偏差小的候選標誌基因。我們指定P(i)值來說明具有上述特徵的基因i。
P(i)＝(∑(μm-μc)2)/(σc+∑σm)的平方根μ草藥處理的細胞(μm)或未經處理的對照細胞(μc)在三次重複實驗中的平均表達水平。
σ草藥處理的細胞(σm)或未經處理的對照細胞(σc)在三次重複實驗中的表達水平的標準偏差。
我們計算了每種基因的P(i)值並選出500個得分最高的基因作為用於簇分析的候選基因(圖14)。每個基因的值都是三次重複實驗的平均值。如圖14B中所示，兩個不同濃度的#12聚集在一起(12-H和12-L)。較高濃度的#11製劑比較低濃度的#11製劑更接近#12製劑聚簇。但是，與圖12中顯示的樹相比，所有這些聚簇都有類似的相似係數(聚簇間的距離)。這些結果提示#11和#12黃芩湯製劑的基因表達圖形是類似的。這兩種製劑是基於相同的草藥混合物，因此結果是合乎情理的。
在圖14A和圖15所示的表達圖形中有一些特徵是顯著的。圖15A中顯示了平均基因表達水平。方框1中包括在#11-L處理的細胞中被下調但在其他細胞中被上調的基因，這些基因包括2個tRNA合成酶(異亮氨酸和甲硫氨酸(methion))、RNA聚合酶II多肽B(克隆ID42020)、KIAA0212基因(克隆ID 310497，含有ATP/GTP-結合位點基元A)和KIAA0577(克隆ID 29263，ATP-依賴性RNA解旋酶)。我們感興趣地注意到6個基因中有3個涉及RNA複製。方框2中包括被所有的草藥處理上調的基因。方框3中包括對#11-L處理顯示沒有應答但被其他物質下調的基因。方框4中包括被低濃度的草藥處理大大抑制但在高濃度的草藥處理下只顯示輕微抑制的基因。最後，在方框1和方框3中，#11處理細胞的表達圖形不同於用其他3種處理產生的圖形。該結果與圖14B中顯示的一致。
將3種單組分草藥和2種多組分草藥製劑的基因表達圖形的數據集結合在一起，根據顯示有數個特徵是顯著的。KIAA0212基因(克隆ID 310497，含有ATP/GTP-結合位點基元A)受到所有高濃度草藥處理的高度誘導，只除了受到#11-L和CSM處理的中度誘導。有兩個基因，無名基因(克隆ID 510908)和蛋白酶體鏈7前體(克隆ID70088)，被所有的處理高度上調，但被CSM處理下調。
接下來我們的關鍵是對5種不同類型的草藥處理的基因表達圖形進行簇分析。數據的預處理步驟如上所述進行，並選擇了500個基因用於簇分析。分級聚簇利用上述程序「Cluster」進行。從聚簇間的距離範圍最大處將分級樹切開(Romesburg，1989)，結果顯示在圖16A中。三種單一組分草藥CSM、ST024和ST117聚集在一起。2批不同的多組分草藥中，#12-H、#12-L和#11H聚集在一起，而#11-L獨立。結果提示與CSM、ST024和ST117之間的類似性相比，#11和#12之間存在更高的類似性。為了更好地將不同草藥分類，將所有數據集標準化，使不同數據集中每種基因的表達水平具有零-均值和單位-變異，由此改進數據分析算法(Tavazoie等，1999；Chen等，1999)。這得到了轉換變量χi＝(xI-μx)/σxμx數據集中的平均表達水平σx數據集中表達水平的標準偏差xi未轉換的基因表達水平χi已轉換的基因表達水平將數據集標準化後，如圖16B中所示，#11和#12聚集在一起。ST024和ST117聚集在一起，而CSM在一個獨立的聚簇中。另外，聚簇還提示CSM與#11和#12的類似性大於與ST024和ST117的類似性。用相同的標準化數據集進行另一種簇算法-自組織圖型算法，得到了與分級簇算法相同的結果。(圖16C)。
用於區別#11和#12草藥處理表達圖形的類別預示變量。對#11和#12的上述簇分析顯示它們是類似的，用含有500個最高P(i)值的基因的數據集進行的分級聚簇或自組織圖型方法難以作進一步的分類。於是我們對算法作了改進，選出#11和#12草藥處理細胞之間的表達率差別較大、但在這兩種草藥處理細胞中具有較小的變異的基因。定義T(i)值來對這種特徵計分，如下所示T(i)＝log(μ11)-log(μ12)/(σ11+σ12)μ#11處理細胞(μ11)或#12處理細胞(μ12)在三次實驗中的平均表達率σ#11處理細胞(σ11)或#12處理細胞(σ11)的表達率的標準偏差我們計算了每種基因的T(i)值，並選出50個具有最高得分的基因作為類別預示變量(圖17)。18個基因受#11處理而上調，但受#12處理卻下調。其餘基因受#12處理而上調，但受#11處理而下調。於是我們使用這些類別預示變量在Golub等，1999所述的改進方法的基礎上對這兩種測試草藥製劑進行分類。
不同的兩批黃芩湯製劑PHY010401(#16)和PHY010402(#17)從Sun Ten製藥公司獲得，並用於類別預測試驗。#16和#17製劑的基因表達圖形用未經處理的對照細胞的表達圖形規格化並用類別預示變量標準化。每個預示變量gi根據其表達水平xi是否更接近#11或#12而贊成#11或#12草藥製劑。贊成每種基因由vi＝|xI-(μm+μc)/2|給出，其中μ#11(μ11)或#12草藥處理細胞(μ12)在三次重複實驗中的平均表達率分別從與關於#11和#12的預示變量相關的預示變量基因收集平均得票數V11和V12。預測強度(PS)反映了勝利的界限，它定義為PS＝(V11-V12)/(V11+V12)。如果PS大於0，指示草藥製劑更類似於#11而與#12不太類似。從對#16和#17進行的分析得到的結果指示#16-H與#11(PS＝0.1)類似，而#16-L、#17-H和#17-L與#12類似(分別是PS＝-0.29、-0.21和-0.2)。在#16和#17製劑的信息的基礎上，該試驗未能準確地鑑別出#16-L更類似於#11。
討論草藥處理細胞的特徵基因表達圖形。從兩種草藥處理細胞中的不同表達的基因選擇預示變量基因。這些基因呈現了對草藥處理的細胞應答。在該研究中，我們已在它們對不同草藥處理的應答的基礎上鑑別了一些令人感興趣的基因(圖13、15和17)。這些基因在研究細胞響應草藥刺激的信號路徑和在解釋草藥的分子藥理學機理方面是有價值的。
利用核酸微陣列分析對草藥分類。概括地說，我們提出了一種兩步分類方法。一開始進行的是在標準化數據集和簇算法基礎上的分類步驟，接著是用類別預示變量進行的最終分類步驟。所有步驟都可綜合在電腦程式中。在這些初步研究中，所有基因對分類都有相同的貢獻。當數據集足夠大時，可以從線性相關係數獲得每種基因(或預示變量)的重量(Golub等，1999，Chen等，1999)。
#11-L未能通過顯著關聯與#11-H聚集在一起。#11的類似製劑#16製劑產生了相同的結果。令人感興趣的是，我們發現無論使用的簇算法是什麼，#11和#16製劑都沒有產生預期的結果。即使用獨立的實驗，結果仍然相同。失敗的原因將用#11和#16製劑的詳細信息進行研究。
微陣列系統中的質量控制和分析。所獲得的微陣列數據的質量和統計學分析方法的選擇都是得到有意義的結果的重要因素。我們已認識到陣列中的變異會引起基因表達水平的測量中的誤差。在該報告中的資料的基礎上，我們已發現對於每種草藥製劑，高濃度處理的表達圖形總是與其較低濃度的相應物聚簇在一起(圖16B和16C)，我們可以用兩種不同的聚簇方法將ST117、ST024、CSM和黃芩湯分類。在過去的三個月裡，陣列質量已提高到小於7％ CV。我們還設定了用於評定在實驗室中建立的每批陣列的質量的標準方法。所有這些實驗結果和微陣列技術的改善都提示利用微陣列系統分類和表徵中藥是可行的。
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採用帶有雙色檢測法的核酸微陣列來測量表達圖形。從草藥處理細胞提取的mRNA用地高辛配基標記，而從未經處理的細胞提取的mRNA用生物素標記。採用9600個特徵的陣列，並將Chen等描述的方法(基因組學51，313-324，1998)用於這些實驗。對於數據的預處理，只選擇高數據質量的陣列斑點。選擇是基於信號與背景的比大於2.5和1.5X的差別表達率。利用這些標準，選出了1081個基因用於進一步的統計學分析。用非分級簇分析程序諸如在麻省理工學院開發的Genecluster程序(Tamayo等，1999)來將表達圖形分類。Genecluster程序是基於自組織圖型(SOM)原理。圖18A中顯示了表達圖形的6X4 SOM聚簇。圖18B中顯示了選定的聚簇的基因表達圖形的詳細情況。在這些聚簇中，聚簇3和20(標記的c3和c20)被選出來，因為它們的基因表達水平在較高的草藥濃度下增加。類似地，聚簇5和9被選出來，因為它們的基因表達水平在較高的草藥濃度下降低。聚簇23收集了表達水平與在未經處理的細胞中的相比被上調的基因，聚簇0收集了被下調的基因。這些表達圖形聚簇進一步集中成主要兩組，A和B。A組收集了被草藥處理上調的基因，而B組收集了被草藥處理下調的基因。A組和B組中的表達圖形構成了草藥製劑的特徵表達數據集的基礎。對於不同的5批黃芩湯重複相同的步驟，選出了952個基因來建立黃芩湯的特徵表達圖形資料庫。
如圖19中所示，利用前述方法，可以將基因分為A組、B組或無(非A和非B)，且其表達圖形分別可由1、-1和0表示。A組中批次#1和批次#2之間的不同基因表達圖形數是3(基因6、7和8)，B組中是2(基因15和16)。利用同一原理，A和B組中批次#1和#3之間的不同表達圖形數是10，批次#2和批次#3之間是11。這些數指示批次#1和#2比批次#3更相似。用該原理將5批不同的草藥製劑分類。用以下算法來計算一對草藥製劑批次I和j之間的距離。
dij＝∑δ(Xi，Xj)(Hamming間距)i批製劑中的基因X被分配到A、B或「無」組若XiXj，δ(Xi，Xj)＝1若Xi＝Xj，δ(Xi，Xj)＝0.
我們計算了每對草藥製劑之間的所有dij值用於簇分析。分析程序KitschCluster是基於分級聚簇原理，由華盛頓大學的Dr.Joseph Felsenstein編寫(http//evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)。從Hamming間距表(圖20)，可以清楚地鑑別出最短的間距位於批次#17和批次#18之間，批次#17與#18類似。批次#16也與批次#17和#18類似，但批次#19與其餘批次不同。結果得到了如下所述的HPLC分析的證實。
利用HPLC分析了5批草藥製劑的化學組成。選擇了色譜圖中的四個主峰(BG，B，Gly和Pf)用於統計學分析。在標繪圖21中所示的6-坐標雷達圖時包括另兩個參數BG+B和BG/B。每個坐標上的距離是該特定化學成分在色譜圖中的綜合強度。總的來說，#16、#17和#18在它們的黃芩的成分含量(黃芩甙和黃芩甙元)方面是類似的，均在33.55-36.08之間；而在#19和#20中相同成分的量更高(分別是42.49和44.96)。#16、#17和#18的類似可以從圖21B中的一致性雷達圖中看出。
為了在如上所述建立的特徵表達圖形資料庫的基礎上鑑別未知的草藥，Jurkat T細胞用5種濃度的試驗樣品#17處理，以建立試驗品的特徵表達數據集。計算試驗品和特徵表達資料庫中的每個數據集(#16，#17，#18，#19和#20)之間的Hamming間距，得分為#16502，#17405，#18402，#19699和#20531。這些數據顯示試驗品與#17最相似，具有最低的Hamming間距得分405。該實施例證明，本發明提出了一種在利用哺乳動物細胞中由草藥誘導的基因表達圖形的基礎上鑑別未知草藥的方法。未知草藥的鑑別可通過將特徵表達圖形與HBR陣列中草藥的特徵表達圖形集對準來推斷。
在特徵表達資料庫的基礎上，可以推出草藥的標誌基因和標記表達圖形，以用於研究其藥理學機理和用於優化複方草藥製劑的配製。對於這種實例，從Sun Ten製藥公司購得5批不同的黃芩湯製劑(#16，#17，#18，#19和#20)，在上述方法的基礎上構建特徵表達圖形資料庫。對於每個基因，利用變異係數(CV值)對資料庫中的表達圖形的一致性打分CV＝σ/(∑μi/n)μi#I處理細胞的平均表達率n數據集的數目，在本例中n＝5σ#16，#17，#18，#19和#20的表達率的標準偏差由於CV反映數據的變異，因此草藥的標誌基因在CV得分的基礎上進行選擇。選出具有最小CV得分的頭50個基因。圖22顯示了黃芩湯的具有上調的標記圖形的25個標誌基因，和具有下調的標記圖形的25個標誌基因。
特徵表達圖形資料庫可以用於推斷與草藥同樣複雜的混合物中的單個化學成分的表達圖形，只要化學成分的量能被半定量地確定。在這樣的例子中，草藥的化學組成利用高效液相色譜法測定。5批黃芩湯製劑中4種化學成分的綜合強度通過HPLC分析定量測定。每批草藥製劑的基因表達率通過取由5種濃度的草藥製劑誘導的表達率的中值來計算。成分與基因表達圖形之間的相互關係利用Pearson相關係數來定量。基因x和成分y的Pearson相關係數是R＝(1/n)∑(xi-μx)(yi-μy)/σxσy，i＝1-nn草藥製劑的數，本例中n＝5μx5批草藥製劑中基因x的平均表達率μy5批草藥製劑中成分y的平均綜合強度xi#I草藥製劑中基因x的基因表達率
yi#I草藥製劑中成分y的綜合強度σ5批草藥製劑的表達率(σx)或綜合強度(σy)的標準偏差對於每種成分，鑑定了表達水平與黃芩湯中的化學成分的量高度相關(|R|＞0.99)的若干基因。例如，基因(克隆ID67185)和甘草甜素之間的R值為0.998(圖23A)。另一方面，表達水平隨漢黃芩黃素(WG)的減少而增加的基因(克隆ID344720)具有-0.997的R值(圖23B)。除了上面兩個例子以外，191和170基因與單個成分高度相關，R值分別＞0.9和＜-0.9。例如，17和18基因分別與白花素(Af)正相關和負相關(圖24)。這個實施例教導了不將混合物分離而描繪其中的單個成分的基因表達的方法，從而對每個成分進行表達分析。
實施例16的參考文獻美國專利文件Stoughton-Roland和Friend-SH.USP# 5965352鑑別藥物作用路徑的方法Brown-PO和Shalon-TD USP#5807522建造生物樣品微陣列的方法Lockhart-DJ，Brown-EL，Wong-GG，Chee-MS和Gingeras-TR.USP#6040138利用與高密度寡核苷酸陣列的雜交進行表達監控Ladunga-I.USP#5987390用於蛋白質類別鑑定的方法和系統Mahant-S，Shivaling-S，Vivek-G.USP#5951711用於測定兩個多比特數字字之間的hamming間距的方法和設備外國專利文件Brown-PO和Shalon-TD EP#913485A1用於製造生物樣品微陣列的方法和裝置其他出版物Bertucci-F；Bernard-K；Loriod-B；Chang-YC；Granjeaud-S；Birnbaum-D；Nguyen-C；Peck-K；Jordan-BR(1999)基於DNA陣列的表達測量和實施小樣品的尼龍微陣列中的靈敏度問題，人類分子遺傳學8(9)1715-1722。
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為了鑑別由PHY906特異性誘導的基因(PHY906的標記基因)，利用Tamayo等1999開發的非分級簇分析程序「GeneCluster」將表達圖形分類。該電腦程式是基於自組織圖(SOM)原理，表達圖形的聚簇顯示在圖26中。X軸表示從低到高的草藥濃度，Y軸是基因表達率。從顯示對PHY906#2的劑量應答的表達圖形中選出標記基因。分別從聚簇3和4以及聚簇18和19中選出誘導和抑制的基因。為了鑑別PHY906的標記基因，具有相同配方和製造方法的另一批黃芩湯PHY906#3進行如對PHY906#2所述的相同操作。這兩批中常見的誘導和抑制基因顯示在圖27中。
利用自組織圖(SOM)對生物應答的類似性打分為了區分類似組成的草藥，開發了一種計分方法，得分S表示生物系統對兩種不同的草藥組合物的生物應答的差異。
S＝∑PijWij，其中Pij均是由聚簇i和聚簇j中的草藥製劑A和草藥製劑B誘導的常見基因的數目。例如，對兩批PHY906的表達圖形的SOM簇分析結果顯示在圖28A中。在聚簇C13和C14中，17和25基因分別享有兩批PHY906的相同表達圖形。此外，表達圖形由PHY906#2誘導的10個基因聚集在C13中，但由PHY906#3誘導的聚集在C14中。因此，P1313＝17，P1414＝25和P1314＝10。稱量因子Wij描述了聚簇i和j之間的距離，以指示兩個表達圖形聚簇的類似性。在C13和C14的情況下，這10個基因對PHY906#2和PHY906#3有類似的應答(圖28B)。稱量因子定義為Wij＝1-Eij/Max(Eij)，其中Eij是聚簇i和聚簇j之間的歐幾裡距離，該值通過Eij/Max(Eij)規格化。當i＝j時，Wij為1。當聚簇i和聚簇j變得更不同時，該數值減小(圖28C)。
對5批草藥的分類為了測試如何很好地在將5批類似的草藥製劑分類時運用上述方法，Jurkat T細胞用5種濃度(IC50的1，1/2.5，1/5，1/10和1/20)的5批黃芩湯處理(PHY01040；#16，PHY010402；#17，PHY03061；#18，PHY03062；#19和PHY02231；#20，從Sun Ten製藥公司獲得)。在簇分析中計算每對草藥製劑之間的Sij分數(圖29)。分析程序Kitsch Cluster是基於分級聚簇原理，由華盛頓大學的Dr.Joseph Felsenstein編寫(http//evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)。將S得分(距離)制表(圖29A)，從中可清楚地鑑別出最短的距離位於批次#17和#18之間，批次#17與#18類似。批次#16也與批次#17和#18類似，但批次#19與其餘批次都不同。結果利用HPLC分析證實。
在表達圖形的基礎上表徵未知草藥為了在如上所述建立的特徵表達圖形資料庫的基礎上鑑別未知的草藥，Jurkat T細胞用5種濃度的試驗樣品#17處理，以建立試驗品的特徵表達數據集。計算試驗品和特徵表達資料庫中的每個數據集(#16，#17，#18，#19和#20)之間的S分數，S得分是#160.78，#170.85，#180.84，#190.77和#200.79。這些數據顯示試驗品與#17最相似，具有較高的S得分0.84。該實施例證明，可以採用該方法在利用哺乳動物細胞中由草藥誘導的基因表達圖形的基礎上鑑別未知草藥。未知草藥的鑑別可通過將特徵表達圖形與HBR陣列中草藥的特徵表達圖形集對準來推斷。
草藥的性能可以用四性五味來描述(見中藥學，顏正華主編，人民衛生出版社，北京，中國，1997；本草綱目，李時珍，明朝，中國)。PHY906中的四種草藥各自可涉及具有類似性能的另一組草藥(參見表19)。或者具有類似性能的草藥可顯示相似的生物應答。HBR陣列可用於測定或測量草藥性能的關聯。這些信息可以用於創製新的草藥配方。
表19具有PHY906性能的草藥
性能四氣-寒、熱、溫、涼五味-辛、苦、甘、酸、淡實施例18.利用HBR陣列評估草藥如實施例16中所述，黃芩湯的藥物組成是黃芩、芍藥、甘草和大棗。表徵了哺乳動物細胞中由5批黃芩湯誘導的基因表達圖形。黃芩湯的標準製劑可以用動物研究或臨床研究來定義和表徵。例如，在質量控制和由Sun Ten製藥公司建立的其他標準的基礎上，將#17用作黃芩湯標準製劑。用#17的生物應答來建立黃芩湯的HBR陣列。選擇HBR陣列中的標誌基因來評估其他黃芩湯組合物製劑。黃芩湯試驗品可含有相同的草藥組合物，但草藥組分可以是在不同的環境特徵下生長的。對於試驗品與標準化HBR陣列中的標誌基因的生物應答，評估試驗品的生物活性。
另外，選出表達水平與黃芩湯中的草藥組分的劑量高度相關(|R|＞0.99)的標誌基因(如實施例16和圖25中所述)用於評估目的。黃芩湯試驗品可以通過對比選定的那組標誌基因的特定生物應答或表達水平與HBR陣列來進行評估。如果選定的標誌基因的表達水平或生物應答超過了可接受的變異區，就調節或修飾草藥組分的量或特性，以便滿足可接受的變異要求。重複該過程，直到由校正後的草藥組合物誘導的生物應答通過與標準HBR陣列對比在可接受的變異範圍內。
實施例19.預測草藥組合物的生物活性和治療應用按照已鑑別出的PHY 906的標誌基因(圖27)，這些基因可用於預測草藥組合物的生物活性。例如，據報導下列加下劃線的PHY906的標誌基因涉及以下生物活性和治療作用。唯一有效的對抗ALL的藥物該能抑制因細胞凋亡增加而導致的天冬醯胺合成酶(Nandy等，1998)。長效藥物促生長素抑制素類似物因有腫瘤生長抑制作用而被用於治療神經纖維瘤，因為它們可誘導由G6PD、轉酮醇酶、或二者的抑制介導的抗增殖作用(Boros等，1998)。Ephrin-A1是一種新的黑瘤生長因子，在黑瘤進展過程中高度表達(Easty等，1999)。促分裂原活化蛋白邀酶(MAPK)家族成員最近報導對細胞凋亡有相反作用(Dabrowski等，2000)。天冬醯胺合成酶、轉酮醇酶、ephrin-A1和MAPK的表達受到較高濃度的PHY906處理的抑制。這些基因的下調牽涉到細胞凋亡。精氨基琥珀酸合成酶、組織蛋白酶G和趨化因子RANTES的表達在炎症歷程中被高度誘導。通過用PHY906處理，與炎症相關的基因被抑制了。這些文獻報導為預測草藥組合物的生物活性或治療作用提供了基礎。
實施例19的參考文獻Nandy-P；Periclou-AP；Avramis-VI(1998)在人白血病細胞系(CCRF/CEM/O和CCRF/CEM/ara-C/7A)中6-巰基嘌呤加上阿糖胞苷再加上PEG-天冬醯胺酶的協同是由細胞凋亡增加引起的。抗癌劑研究18727-737Boros-LG；Brandes-JL；Yusuf-FI；Cascante-M；Williams-RD；Schirmer-WJ(1998)促生長素抑制素對氧化和非氧化戊糖磷酸途徑的抑制可能的抗腫瘤作用機理。醫學假說50501-506Easty-DJ；Hill-SP；Hsu-MY；Fallowfield-ME；Florenes-VA；Herlyn-M；Benett-DC(1999)黑瘤進展過程中ephrin-A1的上調。國際癌雜誌84494-501Dabrowski-A；Tribillo-I；Dabrowska MI；Wereszczynska-SU；Gabryelewicz-A(2000)促分裂原活化蛋白激酶在不同胰腺腺泡細胞損害模型中的活化。Z-Gastroenterol.38469-481給出上面詳細的描述只是為了使理解清楚，而沒有不必要的限制，從這些描述，進行一些修飾對本領域技術人員來說將是顯而易見的。
雖然本發明已結合具體實施方案進行了描述，但應當理解它能作進一步的修飾，且按照總的本發明的原理，這種應用打算覆蓋本發明的任何變種、使用或適應性應用，包括雖背離了本文的公開，但仍是本發明所涉及的領域內的已知或慣常實踐，並且可以用於上文中列出的和如下所述在所附的權利要求書的範圍內的本質特徵。
權利要求
1.一種建立草藥組合物的標準化草藥生物應答陣列(HBR陣列)的方法，該方法包括d)選出特徵化的草藥組合物；e)使生物系統與一批特徵化的草藥組合物接觸並收集關於兩種或多種標誌的數據，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的iv)生成一個細胞庫系統；v)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；vi)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；f)將步驟b)的標誌數據儲存起來作為標準化HBR陣列。
2.權利要求1的方法，它進一步包括g)使用兩種或多種與在步驟b)中用的相同或不同的標誌對更多批次的草藥組合物重複步驟b)和c)；h)將在步驟c)和d)中得到的HBR陣列結合在一起；和i)分析步驟e)的合併後的HBR陣列，生成特徵化草藥組合物的標準化HBR陣列。
3.權利要求1或2的方法，其中特徵化草藥組合物具有至少一種已知的生物應答。
4.權利要求1或2的方法，其中對於特徵化草藥組合物已知下列一項或多項化學測試、所用的植物部分、該特徵化草藥組合物中的一種或多種單個草藥的生長條件、該特徵化草藥組合物中的一種或多種單個草藥的收穫前處理情況、該特徵化草藥組合物中的一種或多種單個草藥的收穫後處理情況、該特徵化草藥組合物的收穫後處理情況、以及該草藥組合物中單個草藥的相對比例。
5.權利要求1或2的方法，其中細胞庫系統包括一個主細胞庫和一個工作細胞庫。
6.權利要求5的方法，其中工作細胞庫的細胞從主細胞庫得到。
7.權利要求5的方法，其中使用來自工作細胞庫的細胞對來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形加以描繪。
8.權利要求1或2的方法，其中基因表達的變化用核酸微陣列測定。
9.權利要求8的方法，其中所述表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的基因在以下標準的基礎上進行選擇在核酸微陣列中的信噪比約為2.5或更高，和差別表達率的變化約為1.5或更高。
10.權利要求8的方法，其中儲存有關表達水平發生了變化的約10至約20000個基因的數據作為HBR陣列的一部分。
11.權利要求10的方法，其中儲存有關表達水平發生了變化的約10至約1500個基因的數據作為HBR陣列的一部分。
12.一種評估草藥組合物的方法，該方法包括a)使生物系統與一批草藥組合物接觸並收集關於兩種或多種標誌的數據，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；b)將收集的標誌數據與標準化HBR陣列對比，比較與批量草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物，其中標準化HBR陣列含有關於基因表達的標誌數據之一。
13.確定草藥組合物是否滿足標準規範的方法，該方法包括a)使生物系統與一批草藥組合物接觸並收集關於兩種或多種標誌的數據，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；b)將收集的標誌數據與標準化HBR陣列對比，比較與批量草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物，其中標準化HBR陣列含有關於基因表達的標誌數據之一；和c)確定在可接受的水平內具有與標準化HBR陣列類似的標誌數據的草藥組合物。
14.權利要求13的方法，其中所述確定在可接受的水平內具有與標準化HBR陣列類似的標誌數據的草藥組合物的步驟是定量或定性的測定。
15.權利要求13或14的方法，其中標準化HBR陣列包括每種標誌的可接受的變異範圍。
16.調節草藥組合物的組分使其符合相同或基本相同的草藥組合物的標準規範的方法，該方法包括a)使生物系統與一批草藥組合物接觸並收集關於兩種或多種標誌的數據，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；b)將收集的標誌數據與標準化HBR陣列對比，比較與批量草藥組合物相同或基本相同的草藥組合物，其中標準化HBR陣列含有關於基因表達的標誌數據之一，且其中標準化HBR陣列還包括每種標誌的可接受的變異範圍；c)確定該草藥組合物是否具有在標準化HBR陣列的可接受的變異水平內的標誌數據；和d)如果標誌數據不在標準化HBR陣列的可接受的變異水平內，則調節該草藥組合物的組分。
17.權利要求16的方法，其中重複步驟(a)-(d)，直到草藥組合物的標誌數據在標準化HBR陣列的可接受的變異水平內。
18.改變草藥組合物的組分使其滿足另一種草藥組合物的標準規範的方法，該方法包括a)使生物系統與一批草藥組合物接觸並收集關於兩種或多種標誌的數據，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；b)將收集的標誌數據與標準化HBR陣列對比，比較另一種草藥組合物與批量草藥組合物，其中標準化HBR陣列含有關於基因表達的標誌數據之一，且其中標準化HBR陣列還包括每種標誌的可接受的變異範圍；c)確定該草藥組合物是否具有在標準化HBR陣列的可接受的變異水平內的標誌數據；和d)如果標誌數據不在標準化HBR陣列的可接受的變異水平內，則改變該草藥組合物的組分。
19.權利要求18的方法，其中重複步驟(a)-(d)，直到草藥組合物的標誌數據在標準化HBR陣列的可接受的變異水平內。
20.預測草藥組合物的生物活性的方法，該方法包括a)使生物系統與一批草藥組合物接觸並測量兩種或多種標誌的不同應答，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；其中那組不同應答的測量結果構成草藥生物應答陣列(HBR陣列)數據集；b)將批量草藥組合物的HBR陣列與特徵化草藥組合物的至少一種先前得到的HBR陣列對比，其中先前得到的HBR陣列含有關於基因表達的標誌數據之一；和c)在步驟b)中進行的HBR陣列比較的基礎上預測批量草藥組合物的生物活性。
21.測量草藥組合物與特徵化草藥組合物的關聯性的方法，該方法包括a)使生物系統與一批草藥組合物接觸並測量兩種或多種標誌的不同應答，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；其中那組不同應答的測量結果構成草藥生物應答陣列(HBR陣列)數據集；b)將批量草藥組合物的HBR陣列與特徵化草藥組合物的至少一種先前得到的HBR陣列對比，其中先前得到的HBR陣列含有關於基因表達的標誌數據之一；和c)在步驟b)中進行的HBR陣列比較的基礎上確定草藥組合物與特徵化草藥組合物的關聯性。
22.預測草藥的新的治療應用的方法，該方法包括a)使生物系統與一批草藥組合物接觸並測量兩種或多種標誌的不同應答，其中標誌之一是通過使用核酸微陣列確定的基因表達的變化，是通過下列步驟產生的i)生成一個細胞庫系統；ii)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；iii)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；其中那組不同應答的測量結果構成草藥生物應答陣列(HBR陣列)數據集；b)在預測的HBR陣列中的標誌的生物活性的基礎上預測新的治療應用。
23.確定由草藥組合物中的單個化學物質誘導的基因表達圖形的方法，該方法包括a)生成一個細胞庫系統；b)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；c)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌並將它們放到HBR陣列中；d)比較在步驟(c)中生成的HBR陣列與標準化HBR陣列，找出類似或改進的草藥組合物；e)確定草藥組合物的單個化學物質的相對量；和f)比較單個化學物質的量與步驟(b)的結果，以鑑別表達水平因草藥組合物中單個化學物質的量改變而發生變化的那些基因。
24.不從複雜混合物諸如草藥組合物中提取化學物質而確定由複雜混合物中的單個化學物質誘導的基因表達圖形的方法，該方法包括a)生成一個細胞庫系統；b)描繪來自與草藥組合物接觸前後的細胞庫系統的細胞的基因表達圖形；c)選出表達水平因與草藥組合物接觸而發生變化的那些基因作為標誌；d)比較所收集的標誌數據與標準化HBR陣列，找出基本相同或改進的草藥組合物；e)表徵所述草藥組合物的化學成分；f)比較鑑別出的化學組成，以鑑定草藥組合物中單個化學成分的不同濃度；g)將不同的化學成分量與HBR陣列中的不同生物應答聯繫起來，以確定每種化學物質的特徵生物應答。
全文摘要
本發明提供了指導草藥組合物的標準化所必需的工具和方法,以確定草藥組合物的引起任何特定生物活性的具體組分,預測特定草藥組合物的生物活性,確定各草藥組合物的關聯性,以及開發改善的草藥療法。本發明提供了用於生成、保持、改善和利用草藥生物應答陣列(HBR陣列)的工具和方法,其中HBR陣列構成了與特定草藥組合物相聯的數據集。本發明的HBR陣列含有基因表達圖形,還可包括有關草藥構成物的與植物相關的參數的信息、生物系統接觸草藥組合物後所收集到的標誌信息、以及生物系統接觸草藥組合物後所收集到的生物應答信息。
文檔編號C12N15/09GK1386135SQ01802006
公開日2002年12月18日 申請日期2001年3月9日 優先權日2000年3月9日
發明者龔忠恕, 白果能, 李御賢, 佘玉萍, 鄭永齊 申請人:耶魯大學