兩株遊動放線菌及其在抗細菌中的應用的製作方法
2023-12-05 04:00:41
專利名稱：兩株遊動放線菌及其在抗細菌中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體地說，涉及兩株遊動放線菌及其在抗細菌中的應用。
背景技術：
最近的一項調查表明在47家美國醫院院內細菌感染中，65%的是由革蘭氏陽性細菌所引起的，其中最主要的是金黃色葡萄球菌和腸球菌。隨著抗菌藥物的廣泛應用，葡萄球菌屬尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢出率和耐藥率有逐年増加的趨勢。上世紀50年代發現的糖肽類抗生素萬古黴素由於其獨特的作用而被用作治療多重耐藥革蘭氏陽性菌感染的首選藥物，並曾一度被譽為「人類對付頑固性多重耐藥革蘭氏陽性菌感染的最後一道防線」。但自1986年萬古黴素耐藥腸球菌(VRE)菌株在英國倫敦Dulwich醫 院被首次發現並隨著該耐藥菌株又相繼在其它許多國家被發現後，這最後一道防線也面臨著崩潰的危險。因此，尋找新的作用靶點，研發新型抗細菌，包括耐藥菌的藥物已成為本世紀全球關注的研究熱點之一。微生物作為「綠色合成」中的重要資源，其代謝產物是創新藥物主要資源之一，據不完全統計，已分離和鑑定的微生物產物約50000個，其中具有各種生物活性的高達22000個，直接作為臨床藥物和農牧業用藥實體多達200多個，微生物藥物是臨床用藥中比例最大的藥物，也是近年來發展最為迅速的醫藥產品，在醫藥產品所佔比例逐年上升。至2002年，已發現的由細菌、放線菌和真菌產生的次級代謝產物中，平均不到100個新化合物中就有一個可以成藥或成先導化合物。微生物來源的天然產物還具有化學結構多祥性的特點，其結構有別於來源於動物、植物和海洋的天然產物，是自然界中天然產物庫的重要組成部分。微生物藥物是近年來發展最為迅速的醫藥產品，在醫藥產品所佔比例逐年上升。2005年我國生物藥品銷售總額達到了 157. 4億元，利潤總額為38. 7億元，預計2015年總產值可達1100億到1300億元，隨著生物技術的發展，由微生物發酵而來到生物藥品的經濟效益越來越大。在我國作為微生物藥物代表的抗生素仍將佔據藥品市場的主要地位，2005年我國抗生素產業達到300億美元，抗生素產業規模已經成為世界第一，銷售額達到640億元，佔全國藥品銷售總額的30%之多，並連續多年以超過17%的平均增長率增長，預計在今後較長時期內，該類藥物的市場需求仍將保持強勁的增長勢頭。但由於醫藥エ業生產的藥品約97%是仿製外國的品種，雖然我國可稱為醫藥生產的大國，但在醫藥科技上還是ー個弱國，使得醫藥產業總體經濟效益偏低。因此，研究開發創新微生物藥物具有重要的現實意義。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供兩株遊動放線菌Actinoplanessp. PDF-I 和 PDF-2 菌株。
為了實現本發明目的，本發明提供了兩株遊動放線菌。其中，所述的遊動放線菌Actinoplanes sp. F1DF-I,已經於2011年3月17日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院，郵政編碼為100101，保藏號為CGMCC No. 4692。其具有以下微生物學特性。好氧菌，革蘭氏陽性，無可溶性色素。孢囊呈亞球形至球形，直徑6 μ m孢囊孢子偏圓形。基絲豐富，無氣絲。在ISP2等大多數培養基上生長良好，基絲呈黃色至橙黃色。細胞壁含有meso-DAP，全細胞水解液含阿拉伯糖和木糖，DNA的G+Cmol%含量為71. 0%。硝酸鹽還原陰性，澱粉水解明性，明膠液化陽性，七葉苷分解陽性，尿素分解陽性，利用甘露糖、西蒙氏枸櫞酸鹽，不利用纖維ニ糖、丙ニ酸鹽、蜜ニ糖、酒石酸鹽、糊精、棉子糖、肌醇、苯丙氨酸、水楊素、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、醋酸鹽作為碳源生長。不能降解酪氨酸、彈性蛋白、腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。其中，所述的遊動放線菌Actinoplanes sp. PDF-2已經於2011年3月17日保藏·在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院，郵政編碼為100101，保藏號為CGMCC No. 4693。其具有以下微生物學特性。好氧菌，革蘭氏陽性，無可溶性色素。孢囊球形，直徑5 μ m,著生在孢囊梗上，孢囊孢子圓形，表面光滑，鞭毛周生。基絲豐富，無氣絲。在ISP2等大多數培養基上生長良好，基絲呈黃色至橙紅色。細胞壁含有meso-DAP，全細胞水解液含阿拉伯糖和木糖，DNA的G+Cmol %含量為70. 4%。澱粉水解陽性，明膠液化陽性，硝酸鹽還原陽性，七葉苷分解陽性，尿素分解陽性，利用丙ニ酸鹽做碳源生長，不利用酒石酸鹽，甘露糖，糊精，苯丙氨酸，棉子糖，水楊素，麥芽糖，乳糖，鼠李糖，肌醇，葡萄糖，醋酸鹽作為碳源生長。不能降解弾性蛋白、酪氨酸、腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。酪素降解陽性。本發明的另一目的提供了所述菌株在抗細菌中的應用，尤其是在抗革蘭氏陽性細菌中的應用。所述的革蘭氏陽性細菌優選耐藥的革蘭氏陽性細菌。其中耐藥的革蘭氏陽性細菌優選為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌。PDF-I和PDF-2菌株具體的分離稱取土壤樣品Ig(取自北京門頭溝山區的草叢中)，懸浮於9ml生理鹽水中混勻，用生理鹽水稀釋至10_2和10_3，分別取200微升塗在分離培養基上(M4(g/L):腐殖酸1，植物蛋白O. 5，MOPS IOMm,甜菜鹼I. 25，丙酮酸鈉I. 25，氯化鈉10，瓊脂12，pH 7. 2)。在28°C，培養10-20天，挑取單菌落至YM(ISP2，酵母膏4. 0g，麥芽汁10. 0g，葡萄糖4. 0g, I. 5% agar,H2O 1000ml, pH 7.0)斜面上。得到這兩株菌的純培養物。對這兩株遊動放線菌Actinoplanes sp. PDF-I和PDF-2菌株研究結果表明它們的發酵液粗提物可抑制多種細菌包括多種耐藥細菌的生長。因此，本發明提供的遊動放線菌Actinoplanes sp. PDF-I和H)F-2，在採用一定的發酵培養基和培養條件下，它們的發酵液粗提物具有抗細菌尤其是抗耐藥細菌的作用。本發明提供的菌種為可再生性微生物資源，可通過短期發酵，得到具有抗耐藥菌活性的產物，該菌種可大規模用於エ業化發酵生產，對環境汙染相對化學合成較小。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例I :菌株發酵產物的製備菌株的發酵產物製備過程如下分別將Actinoplanes sp. PDF-1和TOF-2純培養物接種到斜面培養基(酵母浸膏0.4%，麥芽浸膏1.0%，葡萄糖pH7. 3)上，28°C，培養10天。從斜面上挑取O. 5釐米見方的小塊培養物種入盛有50ml發酵培養基(葡萄糖0.5%，麥芽膏I %，棉子餅粉I %，可溶性澱粉2 %，酵母浸膏0.5%，K2HPO4O. 05 %，(NH4)2SO4O. 5%, NaClO. 1%, CaCO3O. 3%, ρΗ7· 2。)的 250ml 三角瓶中，28°C、190 轉 / 分旋轉搖床培養4天。取50ml發酵液用50ml的丙酮抽提，揮幹後，用5ml的DMSO溶解。實施例2 :抑菌活性的驗證瓊脂稀釋法測定發酵液丙酮粗提物的抗菌活性，所測菌株包括金黃色葡萄球菌的敏感菌株、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的敏感菌株、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌、糞腸球菌的敏感菌株、耐萬古黴素的糞腸球菌、屎腸球菌的敏感菌株、耐萬古黴素 的屎腸球菌、腸埃希氏菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌等20株菌。I、製備培養基培養基使用Mueller-Hinton(MH)瓊脂培養基，按商品說明書進行配製，pH7. 2 7. 4。2、檢定菌株的培養20株檢定菌株於37 °C過夜培養。3、含藥平板製備將Iml發酵液粗提物樣品分別加入14毫升溫度為45 50°C的MH瓊脂培養基中充分混勻後，全部傾倒入滅菌的平皿中。4、接種物製備與接種製備濃度相當於O. 5麥氏標準比濁管的菌懸液，再I : 10稀釋，以多點接種器吸取製備好的菌液(約I 2 μ I)接種於各瓊脂平板表面，每點菌數約為IO4CFU,形成直徑為5 8_的菌斑。接種後置37°C孵育16 20h。5、結果判斷與生長對照比較，「 + 」表示有可見抗菌活性，表示無抗菌活性。表ニ菌株發酵液丙酮粗提物的抗菌譜測定結果
權利要求
1.遊動放線菌(Actinoplanessp. )H)F-1，其保藏號為 CGMCCNo. 4692。
2.遊動放線菌(Actinoplanessp.) H)F-2，其保藏號為 CGMCCNo. 4693。
3.權利要求I或2所述菌株在抗細菌中的應用。
4.根據權利要求3所述應用，其特徵在於，所述的細菌為革蘭氏陽性細菌。
5.根據權利要求4所述應用，其特徵在於，所述的細菌為耐藥的革蘭氏陽性細菌。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的耐藥的革蘭氏陽性細菌為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌。
全文摘要
本發明提供了兩株遊動放線菌及其應用，該遊動放線菌Actinoplanes sp.PDF-1和PDF-2的保藏號分別為CGMCC No.4692和CGMCC No.4693。它們具有抗細菌尤其是抗耐藥細菌的作用。本發明提供的菌種為可再生性微生物資源，可通過短期發酵，得到具有抗耐藥菌活性的產物，該菌種可大規模用於工業化發酵生產，對環境汙染相對化學合成較小。
文檔編號A61P31/04GK102851221SQ201110175099
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月27日 優先權日2011年6月27日
發明者餘利巖, 張月琴, 董國霞, 李子強, 孫薇, 張玉琴, 李秋萍, 魏玉珍 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所