Maldi-tof質譜雙內標及其定量檢測方法
2023-12-05 06:32:06
專利名稱：Maldi-tof質譜雙內標及其定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及核酸，蛋白，小分子多肽，及其它小分子樣品的定量檢測，是一種利用 MALDI-T0F-MS對小片段物質進行檢測時，引入已知濃度和比例的寡聚核苷酸作為標準樣品，建立標樣擬合曲線，用於校正實驗誤差的方法。
背景技術：
基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption lionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技術，是近年來飛速發展的蛋白質組學、基因組學技術之一，具有靈敏度高、準確度高及解析度高等特點，為生命科學研究與臨床重大疾病預警和輔助診斷等提供快速、高通量的分析測試手段，同時也是一種很好的篩選疾病的分子標記方法。MALDI-T0F-MS的原理是用雷射照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從雷射中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子， 而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比，檢測離子。儘管MALDI-T0F-MS的準確度高達0. 1°/Γθ. 01%，遠遠高於目前常規應用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術。但由於系統誤差等因素影響實驗結果的精確定量，因此在質譜檢測樣品時，引入已知濃度和比例的內標，建立標樣擬合曲線，可有效的校正質譜系統誤差和分子量偏移。目前曲線擬合的方法在國內外均有較為普遍的應用，Jiangyue Wu等(Anal. Chem. 1997，69，3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的擬合曲線法對環孢菌素進行了定量測試；Mazarin等(Anal. Chem. 2006, 78，2758-2764)結合脈衝梯度旋轉核磁共振和 MALDI-T0F-MS定量測定多聚物時，同樣採用了擬合曲線進行數據校正；2009年，呂爽等人利用擬合曲線，成功開發了一種磷酸化肽的MALDI-T0F-MS定量方法。
發明內容
本發明原理是為了在使用MALDI-T0F-MS檢測生物分子(如核酸、蛋白、多肽、有機小分子物質等)時，有效克服系統誤差，而引入兩種已知濃度的寡聚核苷酸作為實驗雙內標的定量檢測方法。基於該原理，本發明還發明了用於該方法的三組寡核苷酸對。本發明的第一個目的是提供用作質譜檢測的雙內標誌物(簡稱雙內標)的寡聚核苷酸對，其選自 LbC/LbT、MbC/MbT 或 HbA/HbG。在一個實施方案中，上述寡核苷酸對分別選自
檢測低分子量待檢物的 LbC(CTCATCATGCTGCCCC)和 LbT(CTCATCATGCTGCCCT)；或檢測中分子量待檢物的MbC (CCCCATCTAAGCGCATCAAAC)禾口 MbT (CCCCATCTAAGCGCATCAAAT)；或
檢測高分子量待檢物的 HbA(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA)和 HbG(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAG)。在一個具體實施方案中，上述LbC/LbT的分子量分別為4753. 04,4768. 05道爾頓， 上述MbC/MbT的分子量分別為6304. 08,6319. 09道爾頓，上述HbA/HbG的分子量分別為 7913. 12,7929. 12 道爾頓。本發明的第二個目的是提供一種使用上述寡核苷酸對以用於建立質譜檢測的內標標準擬合曲線的方法。在一個實施方案中，所述的方法包括
1)合成上述寡聚核苷酸對作為雙內標標準品，備用；
2)對寡聚核苷酸進行稀釋；
3)將寡聚核苷酸稀釋到不同濃度範圍，通過質譜檢測得到合適的起始濃度；
4)按不同比例將寡聚核苷酸配成混液，質譜檢測，對所得到的數據進行分析，建立內標擬合曲線。在一個實施方案中，步驟2的寡聚核苷酸稀釋方法既可用常規方法進行稀釋，也可使用本發明摸索確定的方法。其中，優選是選取相當於IOD26tl的寡核苷酸乾粉加500μ 1 水進行稀釋，充分振蕩溶解，其中所選取寡核苷酸乾粉的量的計算方法為
寡核苷酸乾粉量的摩爾數=1單位寡核苷酸質量/MW ；
麗=仏鹼基數1312)+ (C鹼基數x288)+ (G鹼基數(Τ鹼基數χ303)-61 ；且 10D260=33 μ g寡核苷酸
在一個具體實施方案中，其中步驟2中，為了儘可能減少稀釋時帶入的誤差；用起始 10 μ 1的體積配標樣混液(用10 μ 1移液器)。在另一實施方案中，步驟3中適於質譜檢測的三組寡聚核苷酸對的起始濃度為 0. 05-0. 6 μ Μ，且各組寡核苷酸對中的HbA/HbG、LbC/LbT、MbC/MbT的濃度比分別為1 :6。在一個具體實施方案中，HbAG (即HbA/HbG)寡聚核苷酸對的合適起始濃度為0. 3 μ M。在另一具體實施方案中，LbCT (即LbC/LbT)寡聚核苷酸對的合適起始濃度為0.4 μ Μ。在其他具體實施方案中，MbCT (即MbC/MbT)寡聚核苷酸對的合適起始濃度為0. 05 μ Μ。還在一個實施方案，其中步驟4中根據摸索上述的寡聚核苷酸對梯度稀釋的起始濃度，在1 6的區間內，依0. 5遞增，共設置11個梯度，做標樣擬合曲線。在一個具體實施方案中，其中每種寡聚核苷酸對標準品比例設置3次重複。在其他的實施方案中，前述任一方法中所述質譜為基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜。本發明第三個目的是使用上述寡核苷酸對以用於質譜檢測生物分子的方法，包括
前述任一方法中的步驟(1)-(4)；
步驟(5)根據所建立的內標擬合曲線，用於質譜檢測生物分子。
圖1為3種不同分子量的寡聚核苷酸質譜檢測結果，橫坐標為分子量，縱坐標為信號強度；圖2A-2C為1 :6配比的3對寡聚核苷酸質譜檢測結果，橫坐標為分子量，縱坐標為信號強度。圖3為內標擬合曲線，橫坐標為實際比例，縱坐標為理論比例；斜線為實際比例和理論比例的相似程度。技術效果
1.本發明的創新點在於摸索出了適合質譜檢測的寡聚核苷酸對HbA/HbG、LbC/LbT、 MbC/MbT濃度(0. 05-0. 6 μ Μ,其中具體分別為0.4,0.3,0. 05 μ Μ),並建立了擬合曲線，可作為內標用於質譜檢測，有效校正系統誤差，實現定量檢測。2.本發明具有成本低(合成普通寡聚核苷酸)、靈敏度高，檢測周期短等優點。
具體實施例方式現在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進一步描述本發明。但是應當理解， 下面的實施例僅僅是作為例證的，不應以任何方式當作對上述本發明總體的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例本例中，將寡聚核苷酸乾粉經加水稀釋後，配置成不同的濃度和比例，進行質譜檢測。目的是在MALDI-T0F-MS採集數據時，用內標校正，使得各個峰值更加準確。由於內標分子量已知，軟體分析系統利用已知的分子量對其他峰值進行自動校正。實驗材料
(1)寡聚核苷酸乾粉由寡聚核苷酸合成公司合成
(2)384 孔板(AXYGEN)
(3)槍頭(AXYGEN)
(4)EP 管(Eppendorf)
(5)晶片(Sequenom) 儀器設備
(1)離心機(Bioyong)
(2)移液器(Eppendorf)
(3)微量紫外分光光度計SMA1000
(4)點樣機械臂NanodispenserRSlOOO
(5)質譜儀MassARRAYAnalyzer Compact ( Bruker Autoflex)
(6)相關軟體數據採集SpectroACQUIRE；分析軟體Typer4. O ； 實驗步驟
一、寡聚核苷酸選取及稀釋
1、根據質檢寡聚核苷酸時線性稀釋公式，推出寡聚核苷酸質譜檢測時的終濃度與質譜檢測的峰信號值-intensity的關係。本發明中，質譜檢測時的標樣終濃度在0. 05-0. 6 μ M。發明人經過摸索，發現如果
56倍濃度的質譜峰信號值超出了質譜檢測範圍，則質譜無法準確檢測峰值的信號強度。因此需考慮標樣起始濃度及其6倍濃度的質譜峰信號值均在可信區間內檢測。因此，本發明中的所用雙內標的起始濃度均是0. 05 μ M，按1 6的比例混合的兩個標準寡聚核苷酸，在 0. 05-0. 6 μ M區間共設置7種濃度(即0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5、0· 6μΜ)，以摸索各種不同分子量的雙內標的最適濃度。 實驗選取3類分子量的寡聚核苷酸低分子量、中分子量、高分子量，見表1 ；
權利要求
1.一種用作質譜檢測的雙內標誌物(簡稱雙內標)的寡聚核苷酸對，其分別選自 檢測低分子量待檢物的 LbC(CTCATCATGCTGCCCC)和 LbT(CTCATCATGCTGCCCT)； 檢測中分子量待檢物的MbC (CCCCATCTAAGCGCATCAAAC)和MbT(CCCCATCTAAGCGCATCAAAT)；和檢測高分子量待檢物的 HbA(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA)和 HbG(GTTCTCACTCAATTG TAAATGCACAG)。
2.權利要求1的寡核苷酸對，用於建立質譜檢測的內標標準擬合曲線的方法。
3.權利要求2的方法，其中步驟包括1)合成上述寡聚核苷酸對作為雙內標標準品，備用；2)對寡聚核苷酸進行稀釋；3)將寡聚核苷酸稀釋到不同濃度範圍，通過質譜檢測得到合適的起始濃度；4)按不同比例將寡聚核苷酸配成混液，質譜檢測，對所得到的數據進行分析，建立內標擬合曲線。
4.權利要求3的方法，其中步驟2是選取相當於IOD26tl的寡核苷酸乾粉加500μ 1水進行稀釋，充分振蕩溶解，其中所選取寡核苷酸乾粉的量的計算方法為寡核苷酸乾粉量的摩爾數=1單位寡核苷酸質量/MW ；MW=(A鹼基數χ312)+ (C鹼基數x288)+ (G鹼基數(Τ鹼基數x303)-61 ；且 10Α6(1=33μβ寡核苷酸。
5.權利要求3或4的方法，其中步驟3中適於質譜檢測的三組寡聚核苷酸對的起始濃度為0. 05-0. 6 μ Μ，且各組寡核苷酸對中的HbA/HbG、LbC/LbT、MbC/MbT的濃度比分別為1 6。
6.權利要求5的方法，其中HbAG(即HbA/HbG)寡聚核苷酸對的合適起始濃度為0.3 μ M。
7.權利要求5的方法，其中LbCT(即LbC/LbT)寡聚核苷酸對的合適起始濃度為0.4 μ M。
8.權利要求5的方法，其中MbCT(即MbC/MbT)寡聚核苷酸對的合適起始濃度為 0. 05 μ Mo
9.權要求2-8中任一項的方法，其中步驟4中根據摸索上述的寡聚核苷酸對梯度稀釋的起始濃度，在1 :6的區間內，依0. 5遞增，共設置11個梯度，做標樣擬合曲線。
10.權利要求1的寡核苷酸對，用於質譜檢測生物分子的方法，包括 權利要求2-9任一項中的步驟(1)-(4)；步驟(5)根據所建立的內標擬合曲線，用於質譜檢測生物分子。
全文摘要
本發明提供了一種用作質譜檢測的雙內標誌物的寡聚核苷酸對，是利用質譜檢測核酸、蛋白、小分子多肽及其它小分子樣品時，引入標準樣品，即用已知濃度的寡聚核苷酸雙內標校正。本發明還提供該雙內標質譜定量方法，其中兩條寡聚核苷酸比例在1:1至1:6的區間內，其濃度比例依0.5遞增，共設置11個梯度，並利用建立標準曲線的方法，分析MALDI-TOF-MS檢測的樣品出峰情況。本發明的產品和方法可以校準和消除由於操作條件的波動而對分析結果產生的影響，提高分析結果的準確性。使得質譜檢測時各個峰值更加準確，避免分子量的漂移和物質的量測量誤差。
文檔編號C12N15/11GK102337341SQ201110321059
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者張海燕, 邢雙豔, 馬慶偉 申請人:馬慶偉