探針法qPCR檢測熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法與流程
2023-12-05 15:06:56 3
本發明涉及一種基於mgb探針的qpcr檢測熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法，涉及分子生物學領域。本發明檢測方法特異性好、靈敏度高、重複性好。
背景技術：
亞洲傳統醫學認為，熊膽汁有清熱解毒、平肝明目、殺蟲止血的功效。黑熊膽和棕熊膽是製作熊膽膠囊製品的主要原材料。在巨大的經濟利益刺激下，許多不法商販用其他動物源性的膽來冒充熊膽。所以，迫切需要一種高效準確的檢測方法。
傳統的熊膽膠囊製品分子檢測手段，首先提取熊膽膠囊製品中的dna，再利用引物擴增目的片段，最後通過測序比對的方法來鑑定熊膽膠囊的真偽。但是由於熊膽膠囊製品中dna降解和片段化較為嚴重，很難擴增出能夠滿足測序分析的長序列，同時當待測樣品為摻假樣品時，也很難有效的鑑定。
實時螢光定量pcr(quantitativereal-timepcr)是一種在dna擴增反應中，以螢光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應(pcr)循環後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定dna序列進行定性定量分析的方法。該方法通過螢光信號的分析，對pcr進程進行實時檢測。探針法是qpcr中的一種常見方法，在反應體系中加入化學修飾的寡聚核苷酸探針。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收，無法檢測到螢光信號。而當pcr擴增時，taqdna酶的5』-3』端外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，螢光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結構被破壞，從而螢光檢測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條dna鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與pcr產物的形成完全同步。mgb探針是在傳統taqman水解探針基礎上的改進，通過在探針的3』端加入mgb基團，從而提高探針的退火溫度，縮短探針的長度，提高探針的特異性和靈敏度。
本發明建立了一種對於熊膽膠囊製品的實時螢光定量pcr檢測方法，利用mgb探針，能夠高效、準確和更快速的檢測熊膽膠囊製品中是否含有黑熊和棕熊源性的成分，還可以對熊膽膠囊製品dna提取液中的熊源性成分進行定量分析。同時能對常用於在熊膽膠囊中摻假的牛、豬源性成分進行分析鑑定。coi基因是目前國內外廣泛認可的dna條碼，本發明針對coi基因設計引物和mgb探針。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是設計針對黑熊、棕熊以及常見摻偽物牛和豬的引物和探針。
本發明的第二個目的是為了克服現有分子生物學檢測技術的不足之處，建立一種使用方便、快捷、準確的熊膽膠囊中熊源性成分的檢測方法。
本發明的第三個目的是利用以上的引物探針和構建的檢測方法，對熊膽膠囊製品進行定性定量檢測。
為了達到上述目的，本發明採用以下方案：
1、dna的提取體系
樣品的dna提取參照axygen動物基因組提取試劑盒說明書進行，取半個熊膽膠囊內容物、20mg棕熊、黑熊、豬和牛等肌肉組織，放置於2ml離心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea，用剪刀溫和的剪碎組織30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即渦旋振蕩1min混合均勻。短暫離心後，將離心管至於56℃水浴中過夜消化處理。加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將dna製備管至於2ml離心管中，將離心後的混合液上清移至製備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重複一次去鹽過程。棄濾液後，空管離心一分鐘。將dna製備管轉移到新的1.5ml離心管中，加入65℃預熱的tris-hcl洗脫液100μl洗脫製備管中dna，-20℃冷凍備用。
2、引物和探針的設計
選取genbank上已發表的黑熊(ef667005)、棕熊(ap012593)、牛(ku891849)和豬(kt279758)的線粒體coi序列，利用blast進行比對後，選擇物種特異的dna序列，利用abiprimerexpress3.0設計引物與mgb探針，primer6.0分析引物二級結構，將所設計的引物和探針利用blast再次進行比對分析，確保引物與探針的特異性。
引物探針設計結果：
3、本發明中單重qpcr檢測方法的建立
在taq-hsprobeqpcrpremix的基礎上，建立20μl反應體系，其中上下遊引物和mgb探針的量從0.3μl到1.5μl，以0.1μl為梯度遞加。反應體系中加入模板2μl其餘用水補足。根據螢光定量pcr的結果，選擇最大的螢光增量和最好的曲線走勢作為判定標準，選擇引物和探針的最適量。
最優反應體系：
pcr反應程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個循環，循環在退火時收集螢光信號。
判圖原則：ct值小於等於30並有明顯擴增曲線判為陽性；ct值大於等於35判為陰性；ct值介於30～35之間判為可疑，dna模板加倍重複實驗，如果ct值小於等於30並擁有明顯擴增曲線判為陽性，否則判為陰性。
4、本發明中單重qpcr特異性實驗
利用四種單重引物和探針，分別加入棕熊、黑熊、牛、豬、豹、狐狸、狗、金絲猴、馬鹿、猞猁、駝鹿、小靈貓、豹貓、梅花鹿、雪豹、馬來熊、漠貓的dna模板進行單重螢光特異性的實驗，反應體系按照單重螢光定量pcr檢測方法所確定的最佳反應體系建立。
5、本發明中單重qpcr的靈敏度實驗
將黑熊和棕熊的dna提取液原液按照10倍的梯度倍比稀釋，得到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的dna原液。依次用相應的黑熊和棕熊引物和探針進行檢測。
6、本發明中雙重qpcr的特異性實驗
將黑熊、棕熊的引物探針，牛和豬的引物探針分別混合。各自分別加入黑熊、棕熊、牛、豬、豹、狐狸、狗、金絲猴、馬鹿、猞猁、駝鹿、小靈貓、豹貓、梅花鹿、雪豹、馬來熊、漠貓的dna模板。檢測雙重螢光體系的特異性情況。
7、混合dna樣品實驗
分別將黑熊和棕熊、黑熊和牛、棕熊和豬、牛和豬的dna樣品按照1：1、1：10、10：1的比例混合。利用與混合模板相對應的引物和探針進行螢光定量pcr檢測實驗，驗證混合樣品的檢測效果。
8、重複性實驗
將黑熊和棕熊的dna模板稀釋到1ng/μl，利用相應的引物和探針進行重複檢測，用於驗證濃度下的重複性。取黑熊、棕熊樣品各10個，分別用黑熊、棕熊相應的引物和探針進行檢測，檢測結果進行回判率分析。
9、定量分析
利用黑熊和棕熊的引物，對黑熊和棕熊dna模板進行pcr擴增，體系建立和pcr條件如下：
反應體系：
pcr反應程序：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個循環
對黑熊和棕熊pcr擴增產物切膠回收，利用微量紫外分光光度計進行濃度測定。對切膠回收的黑熊和棕熊pcr產物進行10倍的倍比稀釋，共設置5個濃度點。參照以上所述的qpcr反應體系和程序進行qpcr，每個濃度點設置三個重複樣，繪製標準曲線，利用標準曲線對未知樣品中的黑熊和棕熊dna模板濃度進行測定。
附圖說明
圖1黑熊引物探針特異性實驗結果
圖2棕熊引物探針特異性實驗結果
圖3牛引物探針特異性實驗結果
圖4豬引物探針特異性實驗結果
圖5黑熊的梯度靈敏度實驗
圖6棕熊的梯度靈敏度實驗
圖7黑熊、棕熊模板1：1混合檢測結果
圖8棕熊、黑熊模板10：1混合檢測結果
圖9棕熊、黑熊模板1：10混合檢測結果
圖10棕熊、豬模板10：1混合檢測結果
圖111ng/μl黑熊、棕熊模板檢測結果
圖1220個樣品回判率實驗結果
圖13黑熊標準曲線
圖14棕熊標準曲線
具體實施方式
實施例1
未知成分熊膽膠囊製品的檢測
1、dna的提取體系
樣品的提取參照axygen動物基因組提取試劑盒說明書進行，取半個熊膽膠囊內容物，放置於2ml離心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即渦旋振蕩1min混合均勻。短暫離心後，將離心管至於56℃水浴中過夜消化處理。加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將dna製備管至於2ml離心管中，將離心後的混合液上清移至製備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重複一次去鹽過程。棄濾液後，空管離心一分鐘。將dna製備管轉移到新的1.5ml離心管中，加入65℃預熱的tris-hcl洗脫液100μl洗脫製備管中dna，-20℃冷凍備用。
2、體系和程序
對於待測樣品，分別用20μl混合有棕熊和黑熊探針引物的反應體系和20μl混合有牛和豬探針引物的反應體系進行檢測分析。
20μl反應體系：
pcr反應程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個循環，循環在退火時收集螢光信號。
判圖原則：ct值小於等於30並有明顯擴增曲線判為陽性；ct值大於等於35判為陰性；ct值介於30～35之間判為可疑，dna模板加倍重複實驗，如果ct值小於等於30並擁有明顯擴增曲線判為陽性，否則判為陰性。
3、定量分析
利用黑熊和棕熊的引物，對黑熊和棕熊dna模板進行pcr擴增，體系建立和pcr條件如下：
反應體系：
pcr條件：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40個循環
對黑熊和棕熊pcr擴增產物切膠回收，利用微量紫外分光光度計進行濃度測定。對切膠回收的黑熊和棕熊pcr產物進行10倍的倍比稀釋，共設置5個濃度點。參照以上所述的qpcr反應體系和程序進行qpcr擴增，每個濃度點設置三個重複樣，繪製標準曲線，利用標準曲線對未知樣品中的黑熊或棕熊dna模板濃度進行測定。
4、檢測結果
結果表明，未知熊膽膠囊製品的dna提取液，經過qpcr擴增，出現明顯的黑熊擴增曲線且ct值小於30，說明為黑熊。通過黑熊標準曲線進行濃度測定，結果為23.7ng/μl。檢測結果顯示，本方法對於鑑定熊膽膠囊中的熊源性成分是準確、可靠、有效的。
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