小鼠ECM的製備方法及得到的不同來源的小鼠ECM和小鼠卵巢體內再生的方法與流程
2023-12-01 22:45:51 3
本發明涉及組織工程及醫學再生領域，尤其是小鼠ECM的製備方法及得到不同來源的小鼠ECM和小鼠卵巢體內再生的方法。
背景技術：
卵巢疾病是目前困擾女性的一大難題，但目前的治療都會對卵巢造成一定的損傷。2008年，心臟移植的成功再生開啟了ECM支架的研究熱潮。研究表明生物支架在物種間具有良好的保守性，並能很好的被異種宿主接受，在一定程度上降低了免疫排斥反應。此外，天然的三維支架也能夠影響細胞的有絲分裂、細胞的分化，同時也含有利於細胞募集、增殖和分化的生長因子，促進組織結構的修復和重建。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是，提供一種小鼠ECM的製備方法及得到不同來源的小鼠ECM和小鼠卵巢體內再生的方法。
為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是：一種小鼠ECM的製備方法，包括以下步驟：
(1)取出小鼠的不同組織，將其置於不同濃度的洗滌劑中，處理不同的時間，然後使用滅菌水和PBS清洗洗滌劑，保證ECM中不含有洗滌劑；
(2)對製備的ECM進行組織學分析和生化分析，優選出最好的小鼠ECM。
所述步驟(1)中洗滌劑為SDS和Triton中的一種或兩種組合。
優選,所述組織為小鼠卵巢組織。
所述步驟(2)包括對ECM的組織切片進行H&E和DAPI染色，並對ECM的彈性蛋白、膠原和sGAG三種成分含量的測定以及殘留DNA量對比分析。
上述的小鼠ECM的製備方法製得不同來源的小鼠ECM。
一種小鼠卵巢體內再生的方法，將獲得的小鼠ECM，移植回小鼠卵巢原位，不同時間點取出ECM，觀察其再生情況，並且對再生卵巢從再生效率、組織學分析、免疫組織化學分析、基因表達情況和生殖能力檢測五方面進行分析鑑定。
所述小鼠ECM移植回小鼠卵巢原位的方法：腹腔注射麻醉受體小鼠，用手術剪刀在背中線中部開口，用鑷子在背側將肌肉層扎破並伸入到體腔內，夾出與卵巢相連的脂肪組織，撕破卵巢包膜，夾取出卵巢，將製備好的ECM重新放回到卵巢包膜中，將其放回到體內，縫合傷口，做好標記。
所述再生效率＝回收再生卵巢數量/移植小鼠卵巢數量×100％，計算再生效率；所述的組織學分析使用常規H&E染色的方法。
所述免疫組織化學分析包括使用脫蠟、脫水、微波加熱抗原修復、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、AP顯色、復染、脫水、透明、封片、鏡檢。
所述基因表達情況採用PCR和qPCR兩種實驗方法驗證不同基因的表達情況；所述生殖能力檢測包括雌雄小鼠比例為2：1合籠，檢查陰栓，觀察其生仔情況。
本發明的有益效果是：首次成功的再生出小鼠卵巢，並且在移植四周後配對能夠成功的產生後代，進一步為解決女性因卵巢功能停止造成的不孕症提供了新的方法，為人類生殖做出新的貢獻。同時，脫細胞處理後的組織也在再生醫學的領域中具有更廣闊的應用前景。本發明的方法簡便，成本低廉，實驗條件要求低，可操作性強。
附圖說明
圖1為本發明處理後的ECM與再生的卵巢形態學和組織學對比照片。
圖2為不同基因的免疫組織化學表達情況照片。
圖3為不同基因在移植後不同時間的表達情況圖。
具體實施方式
以下是對本發明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
本發明是通過以下的技術方案實現的，
本發明提供小鼠ECM的製備方法，包括如下步驟：
步驟一：收集小鼠卵巢或其他組織器官，分別採用不同的洗滌劑，用不同的濃度處理不同的時間，製備小鼠ECM。
步驟二：使用無菌水和1xPBS清洗殘留的洗滌劑，兩種清洗液各洗八次，每兩小時換一次液，最後在PBS中加入雙抗，4℃備用。
步驟三：對製備的ECM進行組織學分析和生化分析確定最佳處理條件。
所述洗滌劑為SDS和Triton中的一種或兩種組合。
所述不同的濃度洗滌劑和不同的處理時間是根據不同的組織來確定最佳的處理條件，例如卵巢組織的ECM使用的洗滌劑為(質量體積百分比，克每毫升)1％、0.5％、0.2％的SDS，處理時間分別為6h、12h、20h。
所述的ECM的組織學分析是固定不同濃度、不同時間處理的ECM，製作石蠟組織切片，分別用H&E和DAPI染色方法對組織切片進行染色，根據染色結果初步鑑定ECM內的細胞是否去除乾淨。
所述的ECM的生化分析包括測量ECM的彈性蛋白、膠原和sGAG三種成分在ECM中的含量以及殘留DNA的量。
所述的SDS是購買於Sigma公司。
將上述步驟二得到的小鼠ECM採用背部開口移植卵巢的方法，把支架移植到小鼠體內，一個月後觀察小鼠卵巢再生情況。
所述的背部開口移植卵巢的方法，包括如下步驟：腹腔注射麻醉劑，麻醉小鼠5分鐘後，使用消毒後的手術剪刀在小鼠背部開口，扎破肌肉層，夾出與卵巢相連的脂肪組織。在卵巢包膜撕破一個小口，把卵巢剝離出來並取出來。最後挑取處理好的ECM，將其重新塞回到卵巢生長的原部位，將所有組織重新夾回到體腔內側，縫合傷口、做好標記，觀察其術後情況。
所述的麻醉劑是購買於Alfar的2.2.2-Tribromoethanol和Sigma的Tert-amylalcohol，儲液具體配置方法為在5g包裝的2.2.2-Tribromoethanol瓶中加入5ml Tert-amylalcohol，振搖至全部溶解。工作液為在35ml的生理鹽水中加入0.625ml儲液，充分混勻後用0.22um濾器過濾，貼好標籤避光儲存於4℃。
所述的實驗所需的小鼠均來自北京維通利華有限公司。
所述的觀察小鼠卵巢的再生情況包括，在移植手術5天、10天、15天、20天、25天、30天這六個時間點取出小鼠移植後的ECM，並且進一步用組織學、免疫組織化學、PCR等方法對再生卵巢組織進行了驗證。
所述的再生效率分析採用的分析公式為：再生效率＝回收再生卵巢數量/移植小鼠卵巢數量×100％。
所述的組織學分析取上述六個時間點移植後的小鼠再生的卵巢組織，固定之後製作石蠟組織切片，同樣採用H&E染色方法，與正常的卵巢組織切片對比，觀察不同時間點的卵巢組織形態學再生、發育情況。
所述的免疫組織化學分析是利用不同時間點製作好的石蠟組織切片，經過脫蠟復水、抗原熱修復、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、AP顯色、核固紅復染、脫水透明、封片然後鏡檢，觀察不同抗體的表達情況。
所述的不同抗體的表達情況，抗體為blimp-1、stella、inhibinα、dazl、vasa、scp3、zp3、gdf9。上述抗體都購買於santa公司。
所述的檢測基因的表達情況是採用PCR技術檢測回收的再生卵巢在不同時間點是否有blimp-1、stella、inhibinα、dazl、scp3、zp3、gdf9、oct4、ddx4等基因的表達，同時還採用qPCR技術檢測上述基因的相對表達情況。
所述的產生後代的情況是成功產子兩代，共16隻F1代小鼠。
本發明通過製作小鼠ECM以及小鼠卵巢原位移植技術，成功回收到不同時間點的小鼠再生卵巢，並且配對後成功產生後代，證明移植後的小鼠ECM可以再生出卵巢。
具體實施例如下：
實施例一
1.小鼠卵巢支架的製備與分析
步驟一，小鼠卵巢支架的製備
將4周齡雌性小鼠頸椎處死後，在體式解剖鏡下用75％的乙醇擦拭小鼠腹部，然後剪開腹部，沿雙角子宮及輸卵管找到卵巢。輕輕將卵巢包膜撕開，用鑷子從脂肪與卵巢連接的根部輕輕取下卵巢，放置於無菌的PBS中清洗一下，然後在50ml無菌的離心管中預先配置好(質量體積百分比，克每毫升)1％、0.5％、0.2％的SDS，將取到的卵巢放於離心管中。在搖床中迴旋轉動清洗小鼠卵巢，清洗時間分別為6h、12h、20h。SDS清洗完畢後，在超淨工作檯內把離心管中的SDS倒掉，倒入無菌水，清洗殘留在卵巢支架內的SDS。每隔兩個小時換一次無菌水，總共換無菌水8次。為了使支架移植到體內後與體內的滲透壓保持一致，接著使用無菌PBS以同樣的方法也換8次液，結束時加入2000U/ml的雙抗，4℃備用。
步驟二，小鼠卵巢支架的蠟塊製備
將製備好的小鼠卵巢支架放置於10％的中性甲醛中固定24小時後，先用水衝洗組織12h，放到50％的酒精中過夜，然後使用自動脫水透明浸蠟機器，脫水、透明和浸蠟。其中脫水過程為75％乙醇1h——85％乙醇1h——95％乙醇40min——95％乙醇40min——100％乙醇40min——100％乙醇40min。透明過程為二甲苯Ⅰ(乙醇：二甲苯為1：1)40min——二甲苯Ⅱ40min——二甲苯Ⅲ40min。浸蠟過程為：石蠟Ⅰ(石蠟：二甲苯為1:1)1h——石蠟Ⅱ1h——石蠟Ⅲ1h。然後使用包埋機將支架包埋成蠟塊。
步驟三，小鼠卵巢支架的切片分析
(1)將製作好的支架蠟塊，使用石蠟切片機切成5mm的組織切片，52℃烘箱拷片過夜。進行H&E染色，具體操作步驟為：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無水乙醇2min——無水乙醇2min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——蘇木素染色液5min——蒸餾水水洗10min——伊紅染色液1min30s——無水乙醇1min——二甲苯Ⅰ3min——二甲苯Ⅱ3min——封片——鏡檢。根據鏡檢結果判斷是否有細胞殘留在卵巢支架中。
(2)DAPI染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min，無水乙醇2min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——PBS中浸泡3min——滴加DAPI染液100ul——暗室作用15min吸去多餘染色液——PBS洗2次，每次5min——封片——鏡檢。
(3)彈性蛋白染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無水乙醇2min——95％乙醇2min——85％乙醇2min——75％乙醇2min——70％乙醇2min——蒸餾水水洗3min——地衣紅室溫染色3h——70％酒精分化2min——85％、95％酒精各復水2min——二甲苯透明3min——封片——鏡檢。
(4)膠原染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無水乙醇2min——無水乙醇2min——95％乙醇2min——95％乙醇2min——水流衝洗2min——Weigert氏蘇木素染色10min——水流衝洗10min——Van Gieson染色液染色1min——棄染液，用95％酒精快速分化數秒鐘——無水乙醇1min——二甲苯Ⅰ3min——二甲苯Ⅱ3min——封片——鏡檢。
(5)sGAG染色：二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——無水乙醇2min——無水乙醇2min——95％乙醇2min——95％乙醇2min——水流衝洗1min——1％阿爾新藍染液染10～30分鐘——水流衝洗約10min至顏色分明為止——1％中性紅水溶液染細胞核1分鐘——水洗2min——95％乙醇1min——無水乙醇1min——二甲苯Ⅰ3min——二甲苯Ⅱ3min——封片——鏡檢。
(6)DNA含量測定：差量法稱量組織，設PCR管重量設為A、PCR管重量+組織重量設為B、組織重量設為C，則C＝B-A，兩者之差即組織的重量。按照差量法稱重分別稱重大約10mg左右的組織，組織稱重後將組織切碎，每管中加入1ml提前預冷的0.85％生理鹽水，用勻漿儀將組織打碎成細胞懸液。簡短離心後即可按照Tiangen DNA提取試劑盒的基本流程提取DNA，260nm下測定吸光值，按照計算公式：DNA的乾重含量(ng/mg)＝OD260x50x(10/0.52)x體積/組織重量，即每毫克組織中含有的DNA含量。接著使用3％LMP含有EB的凝膠對DNA進行電泳分析，紫外光下鑑定DNA片段的長度。
(7)sGAG的測定：同樣採取差量法稱取卵巢組織，稱取約20mg的組織樣品，每管中加入1ml配製好的木瓜蛋白酶於65℃水浴3h，10000g離心10min。試樣—取出10ul上清液於一新離心管中，去離子水加至100ul；空白試劑加入100ul去離子水；標準曲線加入試管中分別加入1、2、3、4、5ug的標準試劑。以上每管加入1ml Blyscan染料試劑，倒置混勻，搖床震蕩30min，12000rpm離心10min，倒出未結合的染料，加入250ul解離試劑，充分渦旋混合。12000rpm離心5min去除浮沫。吸取200ul試樣於96孔板中，656nm下測定OD值。
(8)彈性蛋白測定：差量法定量稱重10-20mg組織樣品並標記好離心管，每管中加入750ul0.25M草酸置於95℃—100℃的水浴鍋中1h，將離心管冷卻至室溫，10000rpm離心10min，收集部分上清液，向離心管剩餘的組織中繼續加入750ul 0.25M草酸再次加熱1h，收集兩次的上清液。檢測試樣加入500ulα-彈性蛋；空白試劑加入100ul去離子水；標準試劑加入12.5,25,50ul標準樣品。以上每管中加入等同體積的彈性蛋白沉澱試劑，渦旋混合後靜置15min，11000g離心10min後倒去上清液，加入1ml Sircol染料置於搖床中90min，11000g離心10min，倒出未結合染料後加入250ul解離試劑，渦旋混合。吸取200ul檢測試樣於96孔板中，513nm下測定OD值。
(9)膠原測定：按照以上的方法稱取組織重量在10mg左右，每管中加入1.3ml冷酸-胃蛋白酶(0.5M乙酸中0.1mg/ml胃蛋白酶)，4℃過夜。吸取1.0ml樣品加入100ul酸中和溶液，每管中加入冷分離和濃縮試劑(200ul/管)。倒置混勻，離心管放入試管架置於半冰半水的容器中，0-4℃下過夜。輕輕的移出試管，避免劇烈搖晃。12000rpm，10min離心從每管中緩慢吸出1000ul上清液棄去。檢測試樣加入100ul溶液；空白對照加入100ul/去離子水/0.5M乙酸//提取液；標準膠原加入5,10,15ug標準膠原。用空白試劑欄中的溶液加至100u，以上每管中加入1.0ml sircol染料，倒置混勻，將離心管置於搖床中30min，12000rpm 10min，小心翻轉並倒去未結合的染料溶液，小心將750ul冰-冷酸-鹽衝洗試劑加到球形的膠原-染料表面，12000rpm 10min離心，倒出衝洗試劑，用棉籤移出試管邊緣中剩餘的液體，分別加入250ul鹼試劑。離心管蓋上蓋，5min後漩渦混合，每管中吸取200ul樣品溶液加入96孔板中的每孔中，555nm測定吸光值。
根據上述實驗結果分析得出0.2％SDS處理12h的DNA濃度為15.6731ug/ml，脫細胞程度為93.94％，不含有完整DNA片段，損失了2/3的sGAG，彈性蛋白還保持比較好的水平，膠原保留值為10％，綜上所述此處理條件對支架損失最小，為最佳的處理條件。
2.小鼠卵巢支架原位移植與再生分析
步驟一小鼠卵巢原位取出
按腹腔注射0.015ml/g麻醉劑處理受體小鼠。用75％酒精棉球擦洗小鼠背部，使用消毒後的手術剪刀在在背中線中部開口，然後使用手術鑷子在背側腎臟偏下的位置將肌肉層扎破，將鑷子伸入到體腔內，夾出與卵巢相連的脂肪組織、卵巢、輸卵管和部分子宮角。在卵巢包膜的一側輕輕的撕破一個小口，把卵巢剝離出來。接著用鑷子夾取卵巢與脂肪連接的根部，將卵巢從其生長部位取出。
步驟二小鼠卵巢支架原位移植
挑取處理好的卵巢支架，找到卵巢包膜的破口處，使用碘酒浸泡的脫脂棉幫助去除卵巢的傷口處先止血，然後將處理的支架組織重新塞回到卵巢生長的原部位，接著把夾取出來的組織重新夾回到體腔內側，縫合傷口、打完耳標後，將手術後的老鼠放回到鼠籠裡，觀察其術後情況。
步驟三小鼠卵巢再生分析
(1)再生效率的分析
小鼠卵巢原位移植支架一個月後回收再生的卵巢，記錄回收的數量並計算再生效率。
(2)再生組織學的分析
小鼠卵巢原位移植後，在移植後5天、10天、15天、20天、25天、30天這六個時間點分別回收再生的卵巢組織，利用上面所述的蠟塊製作方法，製作不同的蠟塊。使用石蠟切片機，製作5mm的石蠟切片。在高於石蠟熔點兩度的烘箱裡，過夜烘片。第二天取出切片，
經過二甲苯Ⅰ10min——二甲苯Ⅱ10min——二甲苯Ⅲ10min——無水乙醇5min——無水乙醇5min——95％乙醇5min——95％乙醇5min——蘇木素染色液5min——蒸餾水水洗2min——伊紅染色液20s——95％乙醇5min——無水乙醇5min——二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min——二甲苯Ⅲ5min——封片——鏡檢。檢查在移植不同時間後，再生卵巢的形態學變化。
(3)再生免疫組織化學分析
根據上述所製作的石蠟切片，30度過夜烘片，然後52度烘片兩小時，進行免疫組織化學實驗。主要檢測blimp-1、stella、inhibinα、dazl、scp3、zp3、gdf9、vasa八個基因的蛋白表達情況。具體操作如下：二甲苯Ⅰ10min——二甲苯Ⅱ10min——二甲苯Ⅲ10min——無水乙醇5min——無水乙醇5min——95％乙醇5min——95％乙醇5min——流水衝洗2min——1×PBS衝洗5min——0.01M的檸檬酸緩衝液抗原修復(使用微波爐修復，大火修復6min，中火修復四次，每次90s，最後涼至室溫)——10％的血清封閉兩小時——一抗孵育4度過夜——1×PBS清洗3次，每次5min——37度二抗孵育2小時——1×PBS清洗3次，每次5min——AP顯色2-5min——1×PBS清洗2次，每次5min——核固紅復染1min-2min——流水衝洗3遍——95％乙醇5min——無水乙醇5min——二甲苯Ⅲ5min——二甲苯Ⅱ5min——二甲苯Ⅰ5min——封片——鏡檢。
(4)基因表達情況分析
取出不同時間回收的再生卵巢，單個再生卵巢提取RNA，反轉錄為cDNA。分別進行PCR和qPCR，檢測blimp-1、stella、inhibinα、dazl、scp3、zp3、gdf9、oct4、ddx4各個基因在再生卵巢中的表達。
其中採用Trizol法提取RNA，先取到新鮮的或者凍於液氮中的再生卵巢組織，切碎組織，至於200ul—500ul的Trizol中，置於室溫下消化組織5—10min之後再加入五分之一體積的氯仿，14000rpm離心5min，取上清，然後加入2.5倍體積無水乙醇-20℃沉澱2小時。取出後14000rpm離心10min，然後用75％乙醇清洗一遍，無酶水混勻後-20℃保存待用。下一步進行反轉錄，使用Takara RR047A反轉錄試劑盒，根據試劑盒說明書反轉錄得到cDNA。
PCR擴增上述9個基因。PCR引物(見SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20)與反應體系見表1.1、表1.2。PCR反應條件：預變性95℃,5min；變性95℃，30s，復性52℃，30s，延伸72℃，30s，30個循環；最後延伸72℃,7min。
實時定量qPCR是選擇相對定量的方法。RT-qPCR反應條件：預變性95℃,5min；變性95℃，10s，復性55℃，20s，延伸72℃，30s，40個循環。
表1.1目標基因和管家基因的引物序列、PCR產物長度和退火溫度
表1.2RT-PCR反應體系
表1.3RT-qPCR反應體系
(5)生殖能力的檢測
原位移植一個月後的雌性小鼠與正常的雄性小鼠以2:1的比例合籠，最後成功繁育出兩代小鼠，共16隻F1代小鼠。
綜上結果表明經過處理的天然的卵巢支架移植到卵巢原位，可以重新發育成正常的可以產生後代的卵巢。
實施例二
1.小鼠胸腺支架的製備與分析
步驟一，小鼠胸腺支架的製備
將4周齡雌性小鼠頸椎處死後，在體式解剖鏡下用75％的乙醇擦拭小鼠胸部，然後剪開胸部及胸腔，找到呈乳白色的兩葉胸腺。用鑷子從胸腺根部輕輕取下胸腺，放置於無菌的PBS中清洗一下，然後在50ml無菌的離心管中預先配置好(體積百分比)1％、0.5％、0.2％的TritonX-100，將取到的胸腺放於離心管中。在搖床中迴旋轉動清洗小鼠胸腺，清洗時間分別為10h、15h、20h。清洗完畢後，在超淨工作檯內把離心管的中TritonX-100倒掉，倒入無菌水，清洗殘留在胸腺支架內的TritonX-100。每隔一個小時換一次無菌水，總共換無菌水8次。為了使支架移植到體內後與體內的滲透壓保持一致，接著使用無菌PBS以同樣的方法也換8次液，結束時加入2000U/ml的雙抗，4℃備用。
步驟二，小鼠胸腺支架的蠟塊製備
同上述小鼠卵巢支架蠟塊製備一致
步驟三，小鼠胸腺支架的切片分析
同上述小鼠卵巢支架切片的分析方法也一樣，包括H&E染色、DAPI染色、sGAG染色、彈性蛋白染色、膠原染色。
步驟四，小鼠胸腺支架的生化成分測定及分析
同上述小鼠卵巢支架測定與分析方法一致，包括DNA含量及片段長度分析、sGAG、彈性蛋白和膠原的含量測定。
2.小鼠卵巢支架原位移植與再生分析
同上述小鼠卵巢支架原位移植方法移植。
再生分析只包含了形態學與組織學的分析，所用的方法都與小鼠卵巢支架形態學與組織學的分析方法一致。
實施例三
1.小鼠睪丸支架的製備與分析
步驟一，小鼠睪丸支架的製備
將4周齡雌性小鼠頸椎處死後，在體式解剖鏡下用75％的乙醇擦拭小鼠腹部，然後剪開腹部，找到小鼠睪丸。用鑷子從睪丸基部輕輕取下睪丸，放置於無菌的PBS中清洗一下，然後在50ml無菌的離心管中預先配置好(體積百分比)1％、0.5％的SDS，將取到的睪丸放於離心管中。在搖床中迴旋轉動清洗小鼠睪丸，清洗時間分別為20h、24h、30h。清洗完畢後，在超淨工作檯內把離心管的中SDS倒掉，倒入無菌水，清洗殘留在睪丸支架內的SDS。每隔；兩個小時換一次無菌水，總共換無菌水8次。為了使支架移植到體內後與體內的滲透壓保持一致，接著使用無菌PBS以同樣的方法也換8次液，結束時加入2000U/ml的雙抗，4℃備用。
步驟二，小鼠睪丸支架的蠟塊製備
同上述小鼠卵巢支架蠟塊製備一致
步驟三，小鼠睪丸支架的切片分析
同上述小鼠卵巢支架切片的分析方法也一樣，包括H&E染色、DAPI染色、sGAG染色、彈性蛋白染色、膠原染色。
步驟四，小鼠睪丸支架的生化成分測定及分析
同上述小鼠卵巢支架測定與分析方法一致，包括DNA含量及片段長度分析、sGAG、彈性蛋白和膠原的含量測定。
2.小鼠睪丸支架原位移植與再生分析
同上述小鼠卵巢支架原位移植方法移植。
再生分析只包含了形態學與組織學的分析，所用的方法都與小鼠卵巢支架形態學與組織學的分析方法一致。此外還包括了生殖能力的檢測，合籠後能夠得到後代。
綜上結果表明經過處理的天然的卵巢、胸腺、睪丸支架移植到卵巢原位，可以重新發育成正常的可以產生後代的卵巢。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
SEQUENCE LISTING
戴雁峰
小鼠ECM的製備方法及得到的不同來源的小鼠ECM和小鼠卵巢體內再生的方法
20
PatentIn version 3.5
1
21
DNA
小鼠（Mus musculus）
1
ggctgtattc ccctccatcg t 21
2
23
DNA
小鼠（Mus musculus）
2
tggtgccaga tcttctccat gtc 23
3
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
3
cgtggtacaa cccaaagcta 20
4
18
DNA
小鼠（Mus musculus）
4
ttggcacaga cattgcac 18
5
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
5
ctttcaaagc cagtaaccag 20
6
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
6
actgctgcaa cacattcata 20
7
22
DNA
小鼠（Mus musculus）
7
atgatacaga cgtcctacaa cc 22
8
19
DNA
小鼠（Mus musculus）
8
tctttcagca ccgacaaca 19
9
22
DNA
小鼠（Mus musculus）
9
cttatgtatt ccggccatcc ca 22
10
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
10
ccccagatga tagcaccaga 20
11
21
DNA
小鼠（Mus musculus）
11
ccgagctgtg caattcccag a 21
12
21
DNA
小鼠（Mus musculus）
12
aaccctctga gccaagggtg a 21
13
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
13
agctgctgaa gcagaagagg 20
14
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
14
ggttctcatt gttgtcggct 20
15
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
15
ggaaaccagc agcaagtgat 20
16
19
DNA
小鼠（Mus musculus）
16
tggagtcctc atcctctgg 19
17
21
DNA
小鼠（Mus musculus）
17
ttatcatgtg cagccacgtc c 21
18
21
DNA
小鼠（Mus musculus）
18
tgatgacctg aactggtgaa c 21
19
19
DNA
小鼠（Mus musculus）
19
agcaccgtac tcattcacc 19
20
20
DNA
小鼠（Mus musculus）
20
catgctaaac actccgtcct 20