人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因表達產物及製備方法和該產物在酶免技術中的應用的製作方法

2023-11-09 22:29:22

專利名稱：人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因表達產物及製備方法和該產物在酶免技術中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，是人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、羧基端、中間段三片段中的氨基端基因表達產物及其製備方法和該產物在酶免及發光酶免技術中的應用。
背景技術：
自身免疫性甲狀腺病(AITD)是一類多發病，包括Graves』病(GD)、慢性淋巴細胞性甲狀腺炎(HT)等，其發病機制至今尚未完全明了。
促甲狀腺素受體(TSHR)是存在甲狀腺濾泡上皮細胞(TEC)膜上的一種糖蛋白，它與促甲狀腺素(TSH)結合後，調節TEC的生長、分化及其合成和釋放甲狀腺激素的功能。在環境和遺傳因素基礎上，機體免疫功能異常變化導致AITD，TSHR是AITD的主要自身抗原之一，刺激機體產生促甲狀腺素受體抗體(TRAb)，該自身抗體屬於異質性抗體，包括甲狀腺刺激性抗體(TSAb)和甲狀腺阻斷性抗體(TSBAb)，前者模擬TSH功能，長期持續地刺激甲狀腺激素合成釋放而導致Graves』病，表現功能亢進；後者與TSHR特異位點結合而阻止TSH與TSHR的結合及其生理作用的發揮，表現為甲狀腺功能低下。TSHR屬於G蛋白偶聯受體家族，它是由764胺基酸組成的糖蛋白，包括胞外段、跨膜段及很短的胞內段三部分，親水性的胞外區由418個胺基酸殘基組成，該區由9個外顯子編碼。TSH、TSAb和TSBAb的抗原決定簇主要分布於TSHR胞外段(TSHR-ecd)，TSHR-ecd是TSH發揮生理作用或TRAb致病的關鍵環節。因此，探討TSHR的抗原決定簇有助於了解它們的結構和功能，特別是針對不同自身抗體的相應抗原決定簇，對探索AITD的發病機制、AITD診斷分型、療效判斷乃至治療都具有明顯的理論意義，十分重要的臨床應用價值和很好的開發前景。
目前的研究認為TSAb主要結合於TSHR-ecd的氨基端(N-端)，有報導TSHR-ecd N-端的aa22-61是TSAb的重要靶區；TSBAb的靶位點則集中於TSHR-ecd的羧基端(C-端)，其中Cys301、Cys381和Try390是TSBAb結合的關鍵部位；對TSHR-中間段抗原決定簇的報導十分有限。目前有關TSHRAb抗原決定簇的研究主要來自基因刪除或替換、合成肽與AITD患者血清和動物模型來源的抗血清之間的結合反應以及基因工程表達產物的研究結果，但是前兩者由於缺乏或不能正確反應hTSHR-ecd的空間構象，而獲取hTSHR蛋白作為hTSHR蛋白抗原決定簇研究材料已成為對該領域展開深入研究的瓶頸。由於TSHR在甲狀腺濾泡上皮細胞膜上的分布非常稀少且極不穩定，因此，難以直接從TEC獲取足夠量的TSHR進行相關研究；雖然TSHR在真核系統已獲得成功表達，而且該系統表達產物克服TSHR蛋白空間構象的難題，但其產量低、工藝相對複雜、生產成本高的缺點，其表達產量仍然無法滿足TSHR抗原決定簇的研究；相對而言，原核表達系統技術成熟、產量高、工藝簡單、生產成本低，仍然是本研究獲取大量目的蛋白的最佳手段。近年國內外學者也先後使用不同的表達載體在大腸桿菌中表達出了可溶性的hTSHR全長或胞外區蛋白，我室報導已在大腸桿菌中成功表達了可溶性TSHR-ecd蛋白，經過反覆實踐表達產物的產量也逐步提高。由於在TSHR-ecd上分布著兩種自身抗體的的抗原表位，目前仍難以區分它們的確切位點，將該段基因進行粗略的分隔並表達後，再進行抗原決定簇的研究所獲得的結果會較合成肽方法所得結果更具有說服力。日本學者Akira Nakai等人曾將TSHR胞外區分為兩個片段進行原核表達，但迄今為止，尚無將hTSHR胞外區分三段(氨基端、羧基端和中間段)表達的報導。
目前國外常用的TRAb檢測技術有兩種1.放射受體分析，其缺點是只能測TRAb不能分辨TSAb與TSBAb。2.生物學分析可區分TSAb和TSBAb，但操作複雜，不宜常規使用。而且其商品藥盒都很昂貴，國內雖有引進，卻不能推廣。因而創建我國自己的檢測TRAb且對TSAb和TSBAb能有所區分的新技術十分必要。

發明內容
本發明的目的在於將TSHR-ecd cDNA分為三段(hTSHR-N端、hTSHR-C端和hTSHR-M段)分別進行、特別是對hTSHR-N端進行基因克隆、表達載體構建、E.coli原核表達，並進一步以此基因工程片段蛋白為抗原建立TRAb(包括TSAb、TSBAb)ELISA檢測技術。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的本發明人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、羧基端、中間段基因表達產物其中氨基端、羧基端是具有人的促甲狀腺素受體蛋白抗原性的重組片段蛋白。所說的氨基端hTSHR-N片段進行表達獲重組片段蛋白(TrxFus-hTSHR-N)，其cDNA的核苷酸和胺基酸序列為ATG GGG TGT TCG TCT CCA CCC TGC GAG TGC CAT CAG GAG GAG GAC TTC 211bpMet Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe 16AA17 13AGA GTC ACC TGC AAG GAT ATT CAA CGC ATC CCC AGC TTA CCG CCC AGT 259bp
Arg Val Thr Cys lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser 32AA19 25 31ACG CAG ACT CTG AAG CTT ATT GAG ACT CAC CTG AGA ACT ATT CCA AGT 307bpThr Gln Thr Leu lys Leu Ile Glu Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser 48AA37 43CAT GCA TTT TCT AAT CTG CCC AAT ATT TCC AGA ATC TAC GTA TCT ATA 355bpHis Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile 64AA49 55 61GAT GTG ACT CTG CAG CAG CTG GAA TCA CAC TCC TTC TAC AAT TTG ACT 403bpAsp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser 80AA67 73 79AAA GTG ACT CAC ATA GAA ATT CGG AAT ACC AGG AAC TTA ACT TAC ATA 451bplys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile 96AA85 91GAC CCT GAT GCC CTC AAA GAG CTC CCC CAC CTA AAG TTC CTT GGC ATT 499bpAsp Pro Asp Ala Leu lys Glu Leu Pro His Leu lys Phe Leu Gly Ile 112AA97 103 109TTC AAC ACT GGA CTT AAA ATG TTC CCT GAC CTG ACC AAA GTT TAT TCC 547bpPhe Asn Thr Gly Leu lys Met Phe Pro Asp Leu Thr lys Val Tyr Ser 128AA115 121 127ACT GAT ATA TTC TTT ATA CTT GAA ATT ACA GAC AAC CCT TAC ATG ACG 595bpThr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr 144AA133 139TCA ATC CCT GTG AAT GCT TTT CAG GGA CTA 625bpSer Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu 154AA145 151 。
人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、羧基端、中間段基因三種表達產物以融合蛋白形式存在，融合蛋白分子量分別為34.4kD、29.8kD、30.1kD(其中重組蛋白分別為21.2kD，16.6kD，16.9kD；硫氧還蛋白為13.2kD)。
人促甲狀腺素受體胞外區氨基端(也包括羧基端、中間段)基因表達產物的製備方法，採用TRIzol一步法，從Graves』病患者手術治療切下的甲狀腺組織中提取總RNA，經RT-PCR合成並擴增hTSHR-N端(還有hTSHR-C端、hTSHR-M段)編碼基因，定向克隆插入載體pET102/D-His。熱休克法將pET102/hTSHRn(還有pET102/hTSHRc、pET102/hTSHRm)重組表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，進行原核表達。表達條件為以0.4-1.2mM·L-1異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)為誘導劑，25℃-37℃，誘導1-12小時。採用變性Ni2+-NTA親和層析純化系統純化，經過梯度透析、復性、濃縮，獲得TrxFus-hTSHRn(還有TrxFus-hTSHRc、TrxFus-hTSHRm)重組蛋白。
本發明在人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、羧基端、中間段基因表達產物上探索TSAb、TSBAb抗原決定簇分布，將富含TSAb、TSBAb抗原決定簇的TrxFus-hTSHRn和TrxFus-hTSHRc分別作抗原，應用於建立人血清TRAb(包括TSAb、TSBAb)酶聯免疫吸附(ELISA)檢測技術和正在建立發光酶免技術。
本發明的積極效果1、在國內外首先將hTSHR胞外區分三段進行基因克隆和表達並成功地獲得了三段目的基因及其重組融和蛋白。
2、在國內外首次在三個片段的基因工程產品上研究TSAb、TSBAb在不同片段的結合表位(即抗原決定簇)及其分布。TrxFus-hTSHRc和TrxFus-hTSHRn兩目的蛋白具有與甲狀腺阻斷性抗體(TSBAb)和刺激性抗體(TSAb)結合的抗原性，其中前者與TSBAb結合更敏感，說明該片段是TSBAb結合位點佔優勢。
3、率先利用hTSHRN、C二端的重組蛋白成功地建立了二個ELISA方法可檢測人血清TRAb並可區分TSAb和TSBAb誰佔優勢，方法靈敏、特異、精密、穩定並已初步用於臨床，為AITD病因診斷試劑盒的開發做好了準備。此外，為進一步探討抗原決定簇及其分布和研究用於治療AITD的生物製劑奠定了基礎。


圖1為PCR擴增目的基因的鑑定；圖2為重組質粒pET102-hTSHRn的雙酶切鑑定；圖3為重組質粒pET102-hTSHRm的酶切鑑定；圖4為重組質粒pET102-hTSHRc的酶切鑑定；圖5為誘導時間對pET102-TSHRn融合蛋白表達產量的影響；圖6為親和層析純化產物的SDS-PAGE電泳；圖7為蛋白標準曲線；圖8為誘導時間對融合蛋白表達產量的影響；圖9為誘導時間對融合蛋白表達產量的影響；圖10為hTSHR-ecd氨基端原核表達蛋白免疫活性鑑定(Westernblot)。
具體實施例方式
一、人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、中間段和羧基端基因克隆、表達質粒的構建及鑑定(一)人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、中間段和羧基端基因克隆採用TRIzol一步法從Graves』病患者手術治療切下的甲狀腺組織中提取總RNA逆轉錄合成人甲狀腺cDNA第一鏈，用自行設計的引物行RT-PCR分別擴增hTSHR-N端、hTSH-C端和hTSHR-M編碼基因。以核酸分子量標準為參照，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑑定該PCR擴增產物，結果顯示在462bp、417bp和405bp處分別可見一條清晰的、特異電泳條帶，與預期基因片段大小相符(見圖1)。圖1中
泳道1DNA Marker；泳道2PCR hTSHRc擴增產物；泳道3PCR hTSHRm擴增產物；泳道4PCR hTSHRn擴增產物。
(二)重組表達質粒pET102-hTSHRn的構建與鑑定將hTSHRn基因定向克隆插入pET102/D-His載體，重組表達質粒命名為pET102-hTSHRn熱休克法轉化入表達菌E.coli BL21。
1.重組質粒pET102-hTSHRn的酶切鑑定pET 102-hTSHRn重組表達載體經Pst I單酶切，切得6770kb單一條帶；Ssp I酶切，切得1105bp和5669bp兩條帶，均與理論計算結果相符合(見圖2)。圖中1、2DNA Marker；3重組質粒；4Pst I酶切重組質粒；5Ssp I酶切重組質粒。
2.重組質粒pET102-hTSHRn的測序鑑定以重組質粒pET102-hTSHRn為模板，分別以TrxFus、T7 Reverse為測序引物，對該重組質粒進行部分序列測定，測出長約700bp的序列，結果顯示該載體包涵的目的基因片段與Nagayama報告序列完全一致、插入方向正確，與pET102載體的上下遊接口正確吻合。
硫氧還蛋白酶切位點TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC GGC TCT GGA TCC GGTGAT GAC GAT GACPhe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser GlyAsp Asp Asp Asp上遊接口AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC ACCATG GGG TGT TCG TCT CCA CCC TGCLys Leu Gly Ile Asp ProPhe ThrMet Gly Cys Ser Ser Pro Pro CysGAG TGC CAT CAG GAG GAG GAC TTC AGA GTC ACC TGC AAG GAT ATT CAAGlu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys lys Asp Ile GlnCGC ATC CCC AGC TTA CCG CCC AGT ACG CAG ACT CTG AAG CTT ATT GAGArg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu lys Leu Ile GluACT CAC CTG AGA ACT ATT CCA AGT CAT GCA TTT TCT AAT CTG CCC AATThr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn
ATT TCC AGA ATC TAC GTA TCT ATA GAT GTG ACT CTG CAG CAG CTG GAAIle Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu GluTCA CAC TCC TTC TAC AAT TTG AGT AAA GTG ACT CAC ATA GAA ATT CGGSer His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser lys Val Thr His Ile Glu Ile ArgAAT ACC AGG AAC TTA ACT TAC ATA GAC CCT GAT GCC CTC AAA GAG CTCAsn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu lys Glu LeuCCC CAC CTA AAG TTC CTT GGC ATT TTC AAC ACT GGA CTT AAA ATG TTCPro His Leu lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu lys Met PheCCT GAC CTG ACC AAA GTT TAT TCC ACT GAT ATA TTC TTT ATA CTT GAAPro Asp Leu Thr lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu GluATT ACA GAC AAC CCT TAC ATG ACG TCA ATC CCT GTG AAT GCT TTT CAGIle Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln下遊接口GGA CTAAAG GGCGAG CTC AAG CTT GAA GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCTGly LeuLys GlyGlu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro6*His標籤CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG CGT ACC GGTCAT CAT CACCAT CAC CATLeu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr GlyHis His HisHis His HisTGA GTT TGA TCC GGC TGC TAA CAA AGC CCG AAA GGA AGC TGA GTT GGCTGC TGC CAC CGC TGA GCA ATA ACT A(三)重組表達質粒pET102-hTSHRm的構建與鑑定將hTSHRm基因定向克隆插入pET102/D-His載體，重組表達質粒命名為pET102-hTSHRm熱休克法轉化入表達菌E.coli BL21。
1.重組質粒pET102/hTSHRm的酶切鑑定pET 102-hTSHRm重組表達載體經Pst I和Stu I分別酶切後，均切得6770kb單一條帶；經Pst I+Stu I雙酶切後，切得1530bp和5191bp兩條帶，均與理論計算結果相符(見圖3所示)。圖中1、2DNA Marker；3重組質粒；4Pst I+Stu I雙酶切重組質粒；5Stu I單酶切重組質粒；6Pst I酶切重組質粒。
2.重組質粒pET102-hTSHRm的測序鑑定
以重組質粒pET102-hTSHRm為模板，以TrxFus為測序引物，對該重組質粒進行部分序列測定，測出包含上下遊接口、目的基因片段在內長約700bp的序列，結果顯示目的基因片段與Nagayama等報告的序列完全一致、插入方向正確，與pET102載體上下遊接口正確吻合。
硫氧還蛋白 酶切位點TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC GGC TCT GGA TCC GGTGAT GAC GAT GACPhe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser GlyAsp Asp Asp Asp上遊接口AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC AACAAC CCT TAC ATG ACG TCA ATC CCTLys Leu Gly Ile Asp Pro Phe Thr Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile ProGTG AAT GCT TTT CAG GGA CTA TGC AAT GAA ACC TTG ACA CTG AAG CTGVal Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys Asn Glu Thr Leu Thr Leu lys LeuTAC AAC AAC GGC TTT ACT TCA GTC CAA GGA TAT GCT TTC AAT GGG ACATyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly ThrAAG CTG GAT GCT GTT TAC CTA AAC AAG AAT AAA TAC CTG ACA GTT ATTlys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn lys Asn lys Tyr Leu Thr Val IleGAC AAA GAT GCA TTT GGA GGA GTA TAC AGT GGA CCA AGC TTG CTG GACAsp lys Asp Ala Phe Gly Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu AspGTG TCT CAA ACC AGT GTC ACT GCC CTT CCA TCC AAA GGC CTG GAG CACVal Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala Leu Pro Ser lys Gly Leu Glu HisCTG AAG GAA CTG ATA GCA AGA AAC ACC TGG ACT CTT AAG AAA CTT CCALeu lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn Thr Trp Thr Leu lys lys Leu ProCTT TCC TTG AGT TTC CTT CAC CTC ACA CGG GCT GAC CTT TCT TAC CCALeu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr ProAGC CAC TGC TGT GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATC AGA GGA ATC CTTSer His Cys Cys Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile Arg Gly Ile LeuGAG TCC TTG ATG AGC CAC TGC TGT GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATCGlu Ser Leu Met Ser His Cys Cys Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile下遊接口AGA GGA ATC CTT GAG TCC TTGAAG GGCGAG CTC AAG CTT GAA GGT AAGArg Gly Ile Leu Glu Ser LeuLys GlyGlu Leu Lys Leu Glu Gly LysCCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG CGT ACC GGTCATPro Ile Pro Asn Pro Leu Leu GIy Leu Asp Ser Thr Arg Thr GlyHis6*His 標籤CAT CAC CAT CAC CATTGA GTT TGA TCC GGC TGC TAA CAA AGC CCG AAAHis His His His HisGGA AGC TGA GTT GGC TGC TGC CAC CGC TGA GCA ATA ACT A(四)重組表達質粒pET102-hTSHRc的構建與鑑定
將hTSHRc基因定向克隆插入pET102/D-His載體，重組表達質粒命名為pET102-hTSHRc熱休克法轉化入表達菌E.coli BL21。
1.重組質粒pET102/hTSHRc的酶切鑑定pET 102-hTSHRc重組表達載體經Pst I酶切後，切得6770kb單一條帶；經Pst I+Ndl I雙酶切後，切得1469bp和5247bp兩條帶，與理論計算結果相符合(見圖4所示)。圖中；1、2DNA Marker；3重組質粒；4Pst I單酶切重組質粒；5Pst I/Ndl I雙酶切重組質粒。
2.重組質粒pET102-hTSHRc的測序鑑定以純化後重組質粒pET102-hTSHRc為模板，以TrxFus為測序引物，對該重組質粒進行部分序列測定，測出包含上下遊接口、目的基因片段在內長約700bp的序列，結果顯示目的基因片段與Nagayama等報告的序列完全一致、插入方向正確，與pET102載體的上下遊接口正確吻合，確保了讀碼框架的正確性。
硫氧還蛋白 酶切位點TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC GGC TCT GGA TCC GGTGAT GAC GAT GACPhe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser GlyAsp Asp Asp Asp上遊接口AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC ACCGCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATCLys Leu Gly Ile Asp ProPhe ThrAla Phe lys Asn Gln lys lys IleAGA GGA ATC CTT GAG TCC TTG ATG TGT AAT GAG AGC AGT ATG CAG AGCArg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser Ser Met Gln SerTTG CGC CAG AGA AAA TCT GTG AAT GCC TTG AAT AGC CCC CTC CAC CAGLeu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser Pro Leu His GlnGAA TAT GAA GAG AAT CTG GGT GAC AGC ATT GTT GGG TAC AAG GAA AAGGlu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly Tyr lys Glu lysTCC AAG TTC CAG GAT ACT CAT AAC AAC GCT CAT TAT TAC GTC TTC TTTSer lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr Tyr Val Phe PheGAA GAA CAA GAG GAT GAG ATC ATT GGT TTT GGC CAG GAG CTC AAA AAC
Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln Glu Leu lys AsnCCC CAG GAA GAG ACT CTA CAA GCT TTT GAC AGC CAT TAT GAC TAC ACCPro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His Tyr Asp Tyr ThrATA TGT GGG GAC AGT GAA GAC ATG GTG TGT ACC CCC AAG TCC GAT GAGIle Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro lys Ser Asp Glu下遊接口TTC AAC CCG TGT GAA GAC ATA ATG GGC TAC AAG TTC CTG AGA ATTAAGPhe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr lys Phe Leu Arg IleLysGGCGAG CTC AAG CTT GAA GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGTGlyGlu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly6*His 標籤CTC GAT TCT ACG CGT ACC GGTCAT CAT CAC CAT CAC CATTGA GTT TGALeu Asp Ser Thr Arg Thr GlyHis His His His His HisTCC GGC TGC TAA CAA AGC CCG AAA GGA AGC TGA GTT GGC TGC二、人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、中間段和羧基端基因在原核系統的表達及其純化1.誘導表達條件的優化首先固定誘導時間(均取4小時)，採用不同IPTG濃度，0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0mM·L-1；再固定IPTG濃度(1.0mM·L-1)，採用不同誘導時間，1、2、3、4、5和6小時。結果見圖5，圖中1-2.pET102/D/LacZ質粒轉化BL21TM(DE3)，未誘導和IPTG誘導表達；3-4.BL21TM(DE3)空菌，未誘導和IPTG誘導表達；5、蛋白質分子量標誌100kD、75kD、50kD、35.0kD、25.0kD、15kD；6-11.IPTG誘導時間對pET102-TSHRn表達(誘導表達0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)。
2.親和層析純化融合蛋白重組質粒pET102-TSHRn誘導表達產物在層析產物中含量的粗略測定對SDS-PAGE照片掃描分析，融合蛋白條帶光密度約佔總蛋白條帶的91.2％(見圖6所示)。圖中1.包涵體裂解液；
2.包涵體裂解液過柱液；3-10.不同階段的洗滌緩衝液；11.蛋白質分子量標誌100kD、75kD、50kD、35kD、25kD；12-16.親和層析純化後產物.
3分子量測定通過標準蛋白分子量及其Rf值推導回歸方程計算TrxFus-TSHRn分子量為37.33kD。
4.表達產物的定量根據標準蛋白樣品濃度建立標準曲線(見圖7所示)，計算Trx-TSHRn產率為20.6mg/L培養基。圖中y-樣品OD590nmx-純化後融合蛋白樣品濃度。
(二)hTSHR-ecd中間段基因(hTSHRm)在原核宿主菌中的表達與純化1.誘導表達條件的優化首先固定誘導時間(均取4小時)，採用不同IPTG濃度，0.1、0.3、0.5、0.6、0.8和1.0mM·L-1；再固定IPTG濃度(1.0mM·L-1)，採用不同誘導時間，1、2、3、4、5和6小時。結果見圖8所示，圖中1、蛋白質分子量標誌100kD、75kD、50kD、35kD、25kD、15kD；2、3、pET102/D/LacZ質粒轉化的BL21TM(DE3)誘導、未誘導表達；4、5、BL21TM(DE3)空菌未誘導和誘導表達；6-12、1.0mM·L-1IPTG誘導pET102-TSHRm表達(誘導表達0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)。
2.親和層析純化融合蛋白本段親和層析產物的SDS-PAGE電泳結果與Trx-TSHRn的圖片相似(圖片略)。對SDS-PAGE照片經凝膠分析系統掃描，層析後目的融合蛋白條帶光密度約佔總蛋白條帶光密度的92.1％。
3.分子量測定通過標準蛋白分子量及其Rf值推導回歸方程TrxFus-TSHRm分子量為30.75D。
4.表達產物的定量以測定的蛋白樣品OD值(經稀釋後)從該曲線查得樣品濃度，換算出總蛋白濃度為42.75mg/dl，根據融合蛋白所佔百分比，計算Trx-TSHRm產率為35.44mg/L培養基。
(三)hTSHR-ecd羧基端基因(hTSHRc)在原核宿主菌中的表達與純化1.誘導表達條件的優化首先固定誘導時間(均取5小時)，採用不同IPTG濃度，0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mM·L-1；再固定IPTG濃度(1.0mM·L-1)，採用不同誘導時間，1、2、3、4、5和6小時。結果見圖9所示，圖中1、蛋白質分子量標誌150kD、100kD、75kD、50kD、35kD、25kD；2-3、pET102/D/LacZ質粒轉化的BL21TM(DE3)，未誘導和誘導表達；4-5、BL21TM(DE3)空菌，不誘導和誘導表達；6-12、1.0mM·L-1IPTG誘導表達(0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)。
2.親和層析純化融合蛋白本段親和層析產物的SDS-PAGE電泳結果與Trx-TSHRn的圖片相似(圖片略)。對該SDS-PAGE照片掃描分析，計算求得層析後目的融合蛋白條帶光密度約佔總蛋白條帶光密度的90.0％。
3.分子量測定通過標準蛋白分子量及其Rf值推導回歸方程。計算TrxFus-TSHRn分子量為28.96kD。
4.表達產物的定量以測定的蛋白樣品OD值(經稀釋後)從該曲線查得樣品濃度，換算出總蛋白濃度為21.83mg/dl，根據融合蛋白所佔百分比，計算Trx-TSHRc產率為28.3mg/L培養基。
三、人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、中間段和羧基端原核表達蛋白免疫學活性的鑑定(一)採用Western blot方法鑑定人促甲狀腺素受體胞外區氨基端原核表達蛋白免疫活性，步驟如下1.SDS-PAGE電泳取純化TrxTSHRn蛋白20μl，100V電壓，SDS-PAGE電泳4小時。
2.轉膜①剪裁大小與凝膠吻合的硝酸纖維素膜1張和3M濾紙6張，浸泡水中5分鐘除淨氣泡與3M濾紙6張浸入轉移緩衝液中(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris鹼，0.037％SDS，20％甲醇)，取出濾紙。
②電轉儀的陽極在下，從下向上依次放置3層3M濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、3層3M濾紙、蓋上陰板極。根據凝膠面積選擇電流，0.65mA/cm2，室溫下，電轉移2小時。
3.封閉將硝酸纖維素膜用20ml漂洗緩衝液(150mmol/L NaCl，50mmol/LTris.Cl pH7.5)室溫漂洗10分鐘，重複3次以除去硝酸纖維素膜上的SDS，防止影響後來的抗體結合，然後將膜置於5％BSA封閉液中，4℃過夜放置，以封閉未與蛋白結合的位點。
4.加一抗棄去封閉液，按每平方釐米濾膜0.2ml的量分別加入陽性混合血清、正常混合血清，4℃平坦放置2小時。然後棄去抗體，用PBS漂洗3次，每次10分鐘。
5.與鹼性磷酸酶標記的羊抗人IgG二抗結合取出硝酸纖維素膜用20ml漂洗緩衝液室溫漂洗10分鐘，棄淨漂洗液，按每平方釐米濾膜0.2ml的量加入5％BSA稀釋的1∶500山羊抗兔IgG-AP二抗，室溫結合1小時，然後將濾膜應用20ml漂洗緩衝液漂洗3次，每次10分鐘。
6.顯色按每平方釐米濾膜0.1ml的量加入生色底物混合物(66μl NBT溶液、10ml鹼性磷酸酶緩衝液、33μl BCIP溶液)，20分鐘可觀察到蛋白帶，見圖10所示。
(二)ELISA方法鑑定人促甲狀腺素受體胞外區氨基端、中間段和羧基端原核表達蛋白免疫活性以純化的三種重組融合蛋白為抗原，分別以GD患者和正常人血清為一抗，以辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG為二抗，利用優化的ELISA反應條件測定三段重組蛋白免疫活性，以TrxFuS-hTSHRn為抗原，38例GD患者的OD值為 為0.59±0.14，20例正常對照的OD值 為0.45±0.08，兩者有顯著性差異(P＜0.01)，以TrxFuS-hTSHRm為抗原GD患者OD值 為0.81±0.40，正常對照OD值 為1.01±0.46，兩者無顯著性差異(P＞0.05)，以TrxFuS-hTSHRc為抗原GD患者OD值 為0.88±0.25，正常對照OD值 為0.64±0.18，兩者有顯著性差異(P＜0.05)，結果顯示TrxFuS-hTSHRn和TrxFuS-hTSHRc能與GD患者血清發生特異性結合反應，表明這兩個片段具有TSAb的結合位點，前者更顯著。
同樣以純化的三種融合蛋白為抗原，以35例橋本甲狀腺炎伴甲低患者(HT)和58例正常人血清為一抗，以鹼磷酶標記的羊抗人IgG為二抗，利用優化的ELISA反應條件測定三段蛋白免疫活性，其結果如下抗原 HT 正常對照 TrxFuS-hTSHRn 0.66±0.24 0.42±O.12 P＜0.0lTrxFuS-hTSHRm 0.40±O.21 0.35±0.15 P＞0.05TrxFuS-hTSHRc 1.06±0.30 0.32±0.11 P＜0.001由此可見TrxFuS-hTSHRn和TrxFuS-hTSHRc能與HT患者血清發生特異性結合反應，表明這兩個片段具TSBAb的結合位點，後者更著。
四、檢測TRAb的ELISA方法的建立及臨床應用的初步探討(1)檢測TRAb ELISA方法的建立和方法學鑑定，分別以TrxFuS-hTSHRn和TrxFuS-hTSHRc為抗原，分別以已知含TSAb血清和TSBAb血清(陽性血清)以及正常人混合血清(陰性血清)為一抗，以鹼磷酶標記的羊抗人IgG血清作二抗，成功地建立了二個TRAb ELISA方法。
二個ELISA方法的操作程序基本相同，如下
ELISA條件的優化按交叉連續稀釋法進行條件實驗，以陽性血清測得的OD值大於正常對照OD值 或2倍以上為最佳條件，確定ELISA的抗原量為TrxFuS-hTSHRn或TrxFuS-hTSHRc均為16ng/100ul，樣品血清為1∶200稀釋，取100ul；鹼磷酶標記羊抗人IgG血清(二抗)1∶20000稀釋，取100ul；顯色劑PNPP1mg/ml取100ul；終止反應液16mmol/LEDTA或2N NaOH取100ul。
以TrxFuS-hTSHRn為抗原的ELISA方法學鑑定1)取63例血清，經商品ELISA藥盒檢測TSI與該法測得結果進行相關分析，結果相關係數r＝0.742P＜0.05顯示顯著相關。2)精密度取高中低含量的TSAb樣品同次試驗分別檢測8樣，批內變異cv％分別為3.96％、4.21％、4.67％；取高中低含量的TSAb樣品分別檢測8次，批間變異cv％分別為7.32％、7.94％、8.33％。3)正常值範圍58例正常人檢測結果 為0.42±0.12，正常值範圍為0.18-0.66 。4)檢測GD患者95例 為0.90±0.26，顯著高於正常對照P＜0.01，其中79例OD值＞0.66，陽性率為83.16％(79/95)。5)檢測HT患者35例 為0.66±0.24，顯著高於正常對照P值＜0.01，其中21例OD值＞0.66，陽性率60.0％(21/35)。
以TrxFuS-hTSHRc為抗原的ELISA方法學鑑定1)精密度取高中低含量的TSBAb樣品同次試驗分別檢測8樣，批內變異cv％分別為3.24％、4.63％、4.72％；取高中低含量的TSBAb樣品分別檢測8次，批間變異cv％分別為7.22％、8.55％、8.09％。2)58例正常人檢測結果 為0.32±0.11，正常值範圍為0.10-0.54 ；3)檢測HT患者35例 為1.06±0.30，顯著高於正常對照P值＜0.001，其中33例OD值＞0.54，陽性率94.2％(33/35)。4)檢測GD患者95例 為0.73±0.21，顯著高於正常對照P＜0.01，其中66例OD值＞0.54，陽性率為69.4％(66/95)。
(2)臨床應用共檢測正常人108例，GD患者711人次，其中初診患者436例，將hTSHRn和hTSHRc為抗原建立的二個ELISA方法同時檢測每批樣品總陽性率77.7％-93.3％；HT初診患者35例，二個ELISA方法同時檢測每批樣品總陽性率94.2-97.1％；非毒性結節性甲狀腺腫患者6例，總陽性率0％。
氨基端序列表110天津醫科大學總醫院120人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因表達產物及製備方法和該產物在酶免技術中的應用16012101211462212DNA213人屬(Homo)220
221CDS222(164)...(625)4001ATG GGG TGT TCG TCT CCA CCC TGC GAG TGC CAT CAG GAG GAG GAC TTC 211bpMet Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe 16AA17 13AGA GTC ACC TGC AAG GAT ATT CAA CGC ATC CCC AGC TTA CCG CCC AGT 259bpArg Val Thr Cys lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser 32AA19 25 31ACG CAG ACT CTG AAG CTT ATT GAG ACT CAC CTG AGA ACT ATT CCA AGT 307bpThr Gln Thr Leu lys Leu Ile Glu Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser 48AA37 43CAT GCA TTT TCT AAT CTG CCC AAT ATT TCC AGA ATC TAC GTA TCT ATA 355bpHis Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile 64AA49 55 61GAT GTG ACT CTG CAG CAG CTG GAA TCA CAC TCC TTC TAC AAT TTG AGT 403bpAsp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser 80AA67 73 79AAA GTG ACT CAC ATA GAA ATT CGG AAT ACC AGG AAC TTA ACT TAC ATA 451bplys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile 96AA85 91GAC CCT GAT GCC CTC AAA GAG CTC CCC CAC CTA AAG TTC CTT GGC ATT 499bpAsp Pro Asp Ala Leu lys Glu Leu Pro His Leu lys Phe Leu Gly Ile 112AA97 103 109TTC AAC ACT GGA CTT AAA ATG TTC CCT GAC CTG ACC AAA GTT TAT TCC 547bpPhe Asn Thr Gly Leu lys Met Phe Pro Asp Leu Thr lys Val Tyr Ser 128AA115 121 127ACT GAT ATA TTC TTT ATA CTT GAA ATT ACA GAC AAC CCT TAG ATG ACG 595bpThr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr 144AA133 139TCA ATC CCT GTG AAT GCT TTT CAG GGA CTA 625bpSer Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu 154AA145 15權利要求
1.一種人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因(hTSHR-N)表達產物，其特徵在於該hTSHR-N片段進行表達獲重組片段蛋白(TrxFus-hTSHR-N)，其cDNA的核苷酸和胺基酸序列為ATG GGG TGT TCG TCT CCA CCC TGC GAG TGC CAT CAG GAG GAG GAC TTC 211bpMet Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe 16AA1 7 13AGA GTC ACC TGC AAG GAT ATT CAA CGC ATC CCC AGC TTA CCG CCC AGT 259bpArg Val Thr Cys lys Asp Ile Gln Arg lle Pro Ser Leu Pro Pro Ser 32AA19 25 31ACG CAG ACT CTG AAG CTT ATT GAG ACT CAC CTG AGA ACT ATT CCA AGT 307bpThr Gln Thr Leu lys Leu Ile Glu Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser 48AA37 43CAT GCA TTT TCT AAT CTG CCC AAT ATT TCC AGA ATC TAC GTA TCT ATA 355bpHis Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile 64AA49 55 61GAT GTG ACT CTG CAG CAG CTG GAA TCA CAC TCC TTC TAC AAT TTG AGT 403bpAsp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser 80AA67 73 79AAA GTG ACT CAC ATA GAA ATT CGG AAT ACC AGG AAC TTA ACT TAC ATA 451bplys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile 96AA85 91GAC CCT GAT GCC CTC AAA GAG CTC CCC CAC CTA AAG TTC CTT GGC ATT 499bpAsp Pro Asp Ala Leu lys Glu Leu Pro His Leu lys Phe Leu Gly Ile 112AA97 103 109TTC AAC ACT GGA CTT AAA ATG TTC CCT GAC CTG ACC AAA GTT TAT TCC 547bpPhe Asn Thr Gly Leu lys Met Phe Pro Asp Leu Thr lys Val Tyr Ser 128AA115 121 127ACT GAT ATA TTC TTT ATA CTT GAA ATT ACA GAC AAC CCT TAC ATG ACG 595bpThr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr 144AA133 139TCA ATC CCT GTG AAT GCT TTT CAG GGA CTA 625bpSer Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu 154AA145 151 。
2.根據權利要求1所述的人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因表達產物，其特徵在於該表達產物是以融和蛋白形式存在，融和蛋白hTSHR-N分子量為34.4kD，其中目的蛋白為21.2kD，硫氧還蛋白分子量為13.2kD。
3.一種權利要求1的人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因表達產物的製備方法，其特徵在於由Graves』病患者手術治療切下的甲狀腺組織中提取總RNA，經RT-PCR合成並擴增出hTSHR-N端編碼基因，用定向克隆技術將目的基因插入載體pET102/D-His，用熱休克法將所構建的表達載體轉化E.coli TOP10，篩選陽性菌落，提取重組表達質粒pET102/hTSHRn轉化入E.coli BL21原核表達菌中，表達條件以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)為誘導劑，濃度0.4-1.2mM·L-1、溫度25℃-37℃、時間2-12小時。表達產物主要為包涵體形式，故變性條件下通過Ni2+-NTA親和層析純化融和蛋白，再經透析復性獲得融和蛋白TrxFus-hTSHRn。
4.根據權利要求3所述表達產物的製備方法，其特徵在於目的基因與表達載體接口處的鹼基序列為AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC ACC ATG GGG TGT TCG TCT CCA。
5.權利要求1的人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因(hTSHR-N)表達產物的用途，其特徵在於hTSHR-ecd基因的hTSHRn端基因表達產物應用在酶聯免疫分析技術(ELISA)、化學發光酶免疫分析技術(CLEIA)中。
全文摘要
本發明公開了人促甲狀腺素受體胞外區氨基端基因表達產物及製備方法和該產物在酶免技術中的應用。本發明的目的在於將TSHR－ecd cDNA分為三段(hTSHR－N端、hTSHR－C端和hTSHR－M段)分別進行、特別是對hTSHR－N端進行基因克隆、表達載體構建、E.coli原核表達，並進一步以此基因工程片段蛋白為抗原建立TRAb(包括TSAb、TSBAb)ELISA檢測技術。為今後進一步TSHR抗原決定簇的研究開闢新的途徑並最終轉化為TSAb、TSBAb臨床診斷試劑盒奠定基礎。
文檔編號C07K14/435GK1952137SQ20061001538
公開日2007年4月25日 申請日期2006年8月22日 優先權日2006年8月22日
發明者方佩華, 陳慧, 李寧, 王少豔, 譚建 申請人:天津醫科大學總醫院