用於定量測定樣品中磷脂酶a1或a2活性的酶測定法的製作方法

2023-11-09 03:35:42 2

專利名稱：用於定量測定樣品中磷脂酶a1或a2活性的酶測定法的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於定量測定樣品中磷脂酶活性的酶測定法。
背景技術：
磷脂是生物膜的主要結構組分。磷脂除了作為這種結構作用之外，磷脂作為細胞信號過程中介導物的重要性變得日益明顯。結果，對代謝過程例如磷脂酶作用和脂質分選和運輸的研究快速展開。磷脂酶屬於一旦在界面系統中出現就表達其催化活性的最熟悉的界面酶家族。磷脂酶還屬於水解酶類，然而它們有利且特異性地打開水系統中存在的磷脂的酯鍵，取決於磷脂酶類型會得到游離脂肪酸、溶血磷脂、甘油磷脂、磷脂酸和游離醇。這些界面酶不是典型的從水相直接接近它們的底物的可溶性酶，因為它們的酶動力學途徑由兩個不同的步驟組成1)結合至組織化的底物2、催化步驟。根據它們在磷脂分子中的作用部位將磷脂酶分類(圖1) (11)。因此，磷脂酶Al (PLAl)水解磷脂的1_醯基，即其水解脂肪酸和磷脂1_位上甘油殘基之間的鍵。磷脂酶A2(PLA2)水解2-醯基，或者中心的醯基，並且磷脂酶C(PLC)和 D (PLD)，還稱作磷酸二酯酶，水解磷酸二酯鍵的不同側面。磷脂被PLAl或PLA2水解導致產生所謂的「溶血磷脂」。用PLAl選擇性地水解磷脂底物產生2-醯基溶血磷脂並且用PLA2選擇性地水解磷脂導致產生1-醯基溶血磷脂。磷脂酶代謝物參與種種細胞過程，包括信號傳導、宿主防禦(包括抗菌效應)、血小板活化輔因子的形成、膜重建和一般的脂類代謝。分泌的磷脂酶A2 (sPLA2)是富含二硫鍵的，14-kDa, Ca2+-依賴性，胞外酶。它們與還稱作PAF-乙醯基水解酶的脂蛋白相關磷脂酶A2 (Lp-PU^)不同。已經描述了人中的 9個不同的sPLA2基因並分類成IB、IIA、IID、IIE、IIF、III、V、X和XII組。IB和IIA組酶表徵的最多，但是最近發現的家族成員的生物學作用仍難以琢磨。最近，在臨床和非臨床人群中均開展的9個獨立的國際大型臨床研究證明，在 sPLA2和動脈粥樣硬化心血管病之間存在強的正相關(1-9)。更加明確地，sPLA2活性作為用於下列的新的有力工具突顯出來急性冠脈症候群管理的風險分層、急性冠脈症候群診斷、無症狀患者中的心血管風險評估和心血管疾病的治療診斷和治療監測。PLA2組還包括胞質PLA2，其對PC的活性釋放花生四烯酸，它是前列腺素和白三烯以及可能的細胞內第二信使生物合成的前體。磷脂酶A1 (PLA1)是水解磷脂並產生2-醯基-溶血磷脂和脂肪酸的酶，並且在很多生物體中是保守的。哺乳動物具有數個在體外具有PLA1活性酶。細胞外PLA1包括磷脂醯絲氨酸(PS)-特異性PLA1 (PS-PLA1)、膜相關磷脂酸(PA)-選擇性PLA1 OiiPA-PLA1 α和 HiPA-PLA1 β)、肝臟脂肪酶(HL)、內皮脂肪酶(EL)和胰臟脂肪酶相關蛋白2(PLRP》，所有這些酶屬於胰臟脂肪酶基因家族。前三種PLA1與其它酶在底物特異性、結構特徵和基因組織上不同，並且形成了胰臟脂肪酶基因家族中的亞家族。PS-PLA^ πιΡΑ-ΡΙΛα和HiPA-PLA1 β僅具有PLA1活性，而HL、EL和PLRP2除了具有PLA1活性外還表現出水解三醯基甘油的活性。血清PLA2的測定法(1 利用了在螢光反應產物分析中的液體-液體相分配。這些測定法是費力的，需要費時的反應後分析。US2003/219849公開了用於測量磷脂酶活性的一般方法，其基於使用包含非螢光磷脂醯膽鹼、選自磷脂醯甘油、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇或磷脂酸的非螢光負電荷磷脂以及選自螢光標記磷脂醯膽鹼和螢光標記/負電荷磷脂的螢光標記分子的脂質體。脂質體的磷脂成分被磷脂酶水解引起螢光強度變化。用於測定sPLA2活性的一個實例基於使用包含二油醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油和螢光標記1，2-雙-(4，4- 二氟-5，7- 二甲基-4-硼-3a， 4a- 二氮雜-對稱引達省(s-indecene) _3_ i^一醯-sn-甘油基_3_磷脂醯膽鹼(雙-氟硼熒FL C11-PC)的脂質體。US2005/026235公開了用於測定磷脂酶活性的另一個普通方法，所述方法基於使
用包含螢光標記磷脂酶底物的微團或脂質體形式的脂質複合體，所述底物具有下式
O
,
R1-C —『 O—C H2
O
,I
R2-C—O—CH O
I Il
M-C—O一 I'—O—L— 1)
！
Cr其中Rl是具有6至30個碳原子的飽和或不飽和烷基，R2是具有6至30個碳原子的飽和或不飽和烷基，L是化學鍵或連接體，並且D是發螢光的螢光團。然而，發明人發現，包含脂質體或微團形式的磷脂酶底物存在數個缺點。的確，由於天然存在的甘油脂或甘油磷脂實際上不溶於水並且因為界面酶可以以水不溶狀態存在，所以酶必須吸附至底物膜界面發生甘油脂或甘油磷脂水解。雖然表面上簡單，但是甘油脂或甘油磷脂雙層的水解是高度複雜的非平衡過程。通過磷脂酶快速產生脂肪酸或者脂肪酸和溶血磷脂產生了複雜的膜動力學，反過來這將擾亂自身並進行持續的酶作用。的確，磷脂酶活性對膜特性敏感並且由許許多多的膜因素，包括磷脂首基大小、首基電荷、磷脂相狀態、磷脂動力學和膜曲率修飾。已經報導了用於測定SPLA2活性的另一方法(試劑盒，目錄號765001sPLA2測定試劑盒產品冊，開曼(Cayman Chemical), Ann Arbor，MI，12/18/97 和試劑盒 #907-002， sPLA2 測定試劑盒，分析設計公司(Assay Design Inc.) 5777Hines Drive, Ann Arbor, Michigan 48108USA)。這些測定形式具有較多的局限性。例如，僅測量酶活性的測定法受其它酶對該底物的競爭性活性或者測試樣品中多種物質存在的困擾。例如，磷脂酶A2家族的許多成員對氧化的磷脂醯膽鹼具有酶活性。另外，開曼(Cayman)和分析設計公司(Assay design)活性測定法受背景信號困擾，這是因為血清中的物質不依賴於SPLA2活性而轉變成底物。具體而言，這些試劑盒依賴於檢測游離巰基作為方法學的部分。雖然開曼測定法在實驗室條件下工作良好，但是檢測游離巰基使得開曼試劑盒不適用於測量人樣品中的SPLA2，這是因為在人組織、血漿或血清樣品中游離巰基豐富。此外，現存的測定法由於缺乏特異性會不正確地檢測到高活性。臨床環境中的假的活性測量值會導致疾病的錯誤診斷或者患者對期望降低酶活性的治療的。因此，由於脂質體/微團在溶液中結構不穩定並且以多種形式從小的至大的，從多層的(在其它脂質體內的脂質體)至單層的小泡存在，所以使用脂質體/微團形式的底物存在缺點。此外，通過將有機溶劑中的脂質溶液滴入水溶液中生產脂質體是非可重現性的過程，導致所生產的脂質體性質和組織更大的變化。因此，如果底物以這種方式存在的話，酶可獲得的底物數量，即脂質體的外片，將是可變的。難以控制脂質體大小還使得脂質體製備的標準化成為難題。此外，人血清樣品中存在的數個因素會極大地影響用作脂質酶酶測定法底物的脂質體的結構，並且因此影響磷脂酶活性的測量。所述因素為例如離子強度、充當去汙劑的脂類或分子的存在、或樣品中二價離子的濃度。因此，當處理極其複雜的樣品，例如生物學樣品時，重要的是1)使磷脂酶活性不依賴性因素對底物的影響最小化，和2)能夠儘可能準確地測量磷脂酶活性不依賴性因素，並從界面酶活性本身扣除它們。Cho等(12)公開了用於測定SPLA2活性的測定法，其基於使用放射性標記磷脂包被珠。所述珠以1. 310_2個分子/A2，即1. 3個分子/nm2的平衡包裝密度以[3H]-P0PG(1_棕櫚醯-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸甘油)包被。該測定法存在下列缺點(i)放射性標記不適用於診斷應用，(ii)如在本發明實施例中所示，1.3個分子/nm2的包裝密度不適於在螢光測定法中使用，並且(iii)所述方法的檢測限是lng。在本領域中公開了少數幾個以磷脂包被的固相的實例然而，如在下文所示與本發明相比，螢光磷脂的分子蓋度通常更低，並且所述的包被的固相沒有被公開用於在測定磷脂酶Al或A2活性中使用。Bayerl等(US686834;3)涉及對物質與由兩性材料製成的表面相互作用的分析，並且因此用於此目的公開了以兩性分子包被的載體材料(矽酸鹽結構)。 在實例中描述的所述包衣是10摩爾％陰離子帶電1，2_ 二肉豆蔻醯-sn-甘油基-3-磷脂醯甘油(DMPG)、89. 97摩爾％兼性離子卵磷脂1，2-二油酸醯基-sn-3-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DEPC)和0. 03摩爾％螢光標誌物1-棕櫚醯基2-(1-芘癸醯基)-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼的混合物。在該載體材料上的螢光分子的包裝密度因此小於1個螢光磷脂酶底物分子/nm2，這不適於在本發明中使用。Brian等(14)涉及細胞毒性T細胞的同種異型刺激並且用於此目的公開了以磷脂醯膽鹼和膽固醇7 2比例與N-4-硝基苯並-2-氧雜-1，3- 二唑-二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺的1摩爾％的泡懸浮液包被的二維表面(蓋玻片)。因此在該蓋玻片上的螢光分子包裝密度小於1個螢光磷脂酶底物分子/nm2，這不適於在本發明中使用。Das等(15)涉及肺表面活性劑被肺泡巨噬細胞的去除並且用於此目的公開了以 1 10至1 1000比例的螢光和非螢光二油醯磷脂醯膽鹼混合物包被的石英或高嶺土微粒。因此在這些微粒上的螢光分子的包裝密度小於5個螢光磷脂酶底物分子/nm2，這不適於在本發明中使用。因此，更加精確的磷脂酶Al或A2活性測定法是極其感興趣的，特別是用於診斷領域的複雜樣品測試。因此，需要更敏感的、可重現性的和特異性的新的磷脂酶Al或A2活性測定法。

發明內容
本發明的一個目標是以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/nm2。在本發明的一個實施方案中，所述底物包含疏水部分、磷酸鹽部分和直接或通過任選連接體連接至疏水部分的螢光部分。在本發明的另一實施方案中，底物是甘油磷脂。在本發明的另一實施方案中，所述底物在sn-Ι脂肪醯鏈末端和/或sn-2脂肪醯鏈末端被標記。在本發明的另一實施方案中，所述底物以苯並(d，e，f)菲或4，4_ 二氟-5，7_ 二甲基-4-硼-3a，4a- 二氮雜-對稱引達省標記。在本發明的另一實施方案中，所述標記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以供體螢光團標記和在sn-2脂肪酸鏈上以受體螢光團標記，或者相反。在本發明的另一實施方案中，所述標記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以螢光團標記和在sn-2脂肪酸鏈上以猝滅劑標記，或者相反。在本發明的另一實施方案中，所述固相是微粒，優選珠。本發明的另一目標是用於測定樣品中磷脂酶Al或A2活性的方法，所述方法包括-將樣品與如上所述以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相在有效地允許磷脂酶斷裂螢光標記磷脂酶底物的條件下接觸。-檢測作為時間函數的螢光。本發明的另一目標是試劑盒，包含-含有如上所述以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被的標記底物的第一容器，-含有緩衝溶液的第二容器。在本發明的一個實施方案中，所述試劑盒還包含對照和/或校準器。本發明的另一目標是鑑定具有PLAl或PL2活性相關疾病或者處於具有或發展成 PLAl或PL2活性相關疾病風險的受試者的方法，包括根據上述方法測定來自受試者樣品中的PLAl或PLA2酶活性。 在本發明的一個實施方案中，所述PLA2活性相關疾病是心血管病和/或心血管事件。


圖1 磷脂酶水解甘油磷脂中的作用部位；圖2 :405nm處背景螢光發射對磷脂包被珠的分子蓋度；
圖3 :sPLA2活性(起點時的斜率)對磷脂包被珠的分子蓋度；圖4 在向磷脂包被珠中加入增加量的bv_sPLA2後得到的進展曲線；圖5 在向磷脂包被珠中加入66fmol的bv_sPLA2後得到的進展曲線；圖6 在不同量BSA存在下磷脂包被乳膠珠在405nm處的螢光(平均值+/_SD)；圖7 根據本發明的方法在SPLA2活性測量中的甘油三酯幹擾；圖8 根據本發明的方法在SPLA2活性測量中的血紅蛋白幹擾；圖9 根據本發明的方法在SPLA2活性測量中的膽紅素幹擾；圖10 在向1-棕櫚醯基2-(1-芘癸醯基)-sn-甘油基-3-磷酸甲醇脂質體加入 30 μ L人血清樣品後的進展曲線；圖11 使用公布的方法的bv_sPLA2標準曲線；圖12 使用本發明的方法的bv_sPLA2標準曲線；圖13 在40-59歲的男性和女性中sPLA2活性的累積百分數分布；圖14 (A)使用本發明方法的bv_sPLA2標準曲線，⑶使用本發明方法以米_曼氏模型擬合的bv-sPLA2標準曲線；圖15:使用㈧分析設計公司試劑盒⑶開曼試劑盒和(C)本發明方法的 bv-sPLA2標準曲線；圖16 使用分析設計公司方法和本發明方法對人樣品中SPLA2活性的比較。
具體實施例方式本發明的磷脂酶活性測定法是連續的、螢光的、動力學活性測定法。它基於隨著時間測量螢光染料標記底物分子被樣品中所存在磷脂酶水解，所述螢光染料標記底物包被在固相上，例如微球體或珠。本發明的一個目標是以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米，優選地從15 至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米，更優選從20至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米並且甚至優選從20至25個螢光染料標記磷脂酶 Al或A2底物分子/平方納米。如本文所使用，術語「分子蓋度」指每平方納米的螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子平均數或者由一個螢光染料標記底物分子所佔有的平方納米數。分子蓋度可根據下列方法計算(1)計算螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子的數量(例如通過分光光度法測定)，(2)計算固相的表面(平方納米)，然後( 確定螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子數量/固相表面的比值。發明人開展第一次計算，假定在包被相過程中固相沒有損失(在微粒的情況下)。 確定分子蓋度的該第一個方法使發明人確定8至11個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米的分子蓋度對於開展本發明的方法是必須的。然而，發明人發現(1)當使用微粒作為固相時，在包被過程中微粒有損失；和⑵ 當確定螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子數量時使用NaCl作為緩衝液導致低估底物分子的確切數量，這可能是因為底物在緩衝液中沉澱。為了克服此類缺點，發明人基於前面的方法開發了另一方法，以計算本發明固相的分子蓋度，其中-當固相是微粒時，使用BUrker血球計數器的計數室計數微粒的起始數量和包被過程後的微粒最終數量，以便監測包被過程中的損失並因此更精確地計算固相的表面。-當使用分光光度計測定法測量螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子數量時，將去汙劑例如非陰離子去汙劑如Tween 20加入至NaCl緩衝液中，以阻止沉澱並因此更精確地計算螢光底物分子的數量。測定分子蓋度的這種更精確的方法使發明人確定，使用先前方法計算的8至11個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米的分子蓋度相當於所計算的8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米的分子蓋度。因此，本發明的一個目標是以螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米，分子蓋度通過如下確定(1)使用防止底物沉澱的NaCl緩衝液中的去汙劑的分光光度測定法計算螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物分子的數量，(2)計算固相表面(平方納米)，其中，當固相是微粒時，使用Btoker血球計數器的計數室確定包被過程後的微粒數量，並且然後(3)確定螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子數量/固相表面的比率。在本發明的一個實施方案中，固相僅以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物的混合物包被，其中至少 99%,98%,97%,96%,95%,90%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 80%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記，只要是分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 70%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記，只要是分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 60%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記，只要是分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 50%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記，只要是分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 40%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記，只要是分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 30%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記，只要是分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。在本發明的另一實施方案中，固相以磷脂酶Al或A2底物混合物包被，其中至少 20%的磷脂酶Al或A2底物以螢光染料標記，只要是分子蓋度範圍從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/平方納米即可。
如本文所使用，術語「以......包被的固相」指底物可以直接結合(例如包被、附
加、固定化、陷入或捕獲)或者可以被功能化以接受底物(間接結合)的任何支持物。底物被如此包被以致於它可以被溶液中的磷脂酶接近。固相可以由天然或合成的材料、有機或無機材料例如聚合物、樹脂、金屬或玻璃及其組合組成。根據本發明，所述標記的底物被穩定在固相上。在一個實施方案中，所述標記的底物與固相非共價連接。固相的實例包括，但不限於，微粒例如乳膠(聚苯乙烯)珠、玻璃珠、磁珠、鐵珠、金珠；或者片、基質或者樣品容器。樣品容器的實例包括樣品孔、管、板或瓶。在本發明的一個實施方案中，所述標記的底物被穩定在珠上，優選乳膠珠。所述珠具有常規大小例如0. 5至7 μ m，優選1-6 μ m,優選2-5. 5 μ m,並且更優選 3-5 μ m, 4-4. 5 μ m。根據本發明，螢光標記的磷脂酶底物可被選自磷脂酶Al和磷脂酶A2的磷脂酶斷 m農。在本發明的一個實施方案中，所述底物包含疏水部分、磷酸鹽部分和直接或通過任選連接體與疏水部分連接的螢光部分。在本發明的一個實施方案中，所述底物是陰離子的、陽離子的或者中性的甘油磷脂。優選地，所述甘油磷脂是陰離子的。所述甘油磷脂具有下式
權利要求
1.以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相，其中分子蓋度在從8至30個螢光染料標記磷脂酶Al或A2底物分子/nm2的範圍內。
2.根據權利要求1的固相，其中所述底物包括疏水部分、磷酸鹽部分和直接或者通過任選連接體連接至疏水部分的螢光部分。
3.根據權利要求1或2的固相，其中所述底物是甘油磷脂。
4.根據權利要求3的固相，其中所述底物在sn-Ι脂肪醯鏈末端和/或sn-2脂肪醯鏈末端被標記。
5.根據權利要求1至4中任一項的固相，其中所述底物以苯並(d，e,f)菲或4，4_ 二氟-5，7- 二甲基-4-硼-3a，4a- 二氮雜-對稱引達省標記。
6.根據權利要求1至4中任一項的固相，其中所述標記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以供體螢光團標記並且在sn-2脂肪酸鏈上以受體螢光團標記，或者所述標記的底物是在 sn-Ι脂肪酸鏈上以受體螢光團標記並且在sn-2脂肪酸鏈上以供體螢光團標記。
7.根據權利要求1至4中任一項的固相，其中所述標記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以螢光團標記並且在sn-2脂肪酸鏈上以猝滅劑標記，或者所述標記的底物是在sn-Ι脂肪酸鏈上以猝滅劑標記並且在sn-2脂肪酸鏈上以螢光團標記。
8.根據權利要求1至7中任一項的固相，其中所述固相是微粒。
9.根據權利要求1至8中任一項的固相，其中所述固相是珠。
10.用於測定樣品中磷脂酶Al或A2活性的方法，所述方法包括-將樣品與根據權利要求1至9中任一項的以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被的固相接觸，-檢測作為時間函數的螢光。
11.試劑盒，包含-第一容器，含有根據權利要求1至9中任一項的以螢光染料標記的磷脂酶Al或A2底物包被的標記底物，-含有緩衝溶液的第二容器。
12.根據權利要求11的試劑盒，還包含對照和/或校準器。
13.鑑定具有PLAl或PLA2活性相關疾病或者處於具有或者發展成PLAl或PLA2活性相關疾病風險中的受試者的方法，包括根據權利要求9的方法測量來自受試者的樣品中的 PLAl或PLA2酶活性。
14.根據權利要求13的方法，其中所述PLA2活性相關疾病是心血管病和/或心血管事件。
全文摘要
本發明涉及使用以螢光染料標記的磷脂酶A1或A2底物包被的固相測定樣品中磷脂酶A1或A2活性的方法，其中分子蓋度在從8至30個螢光染料標記磷脂酶A1或A2底物分子/nm2範圍內，以及開展所述方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/58GK102388311SQ201080016123
公開日2012年3月21日 申請日期2010年2月10日 優先權日2009年2月10日
發明者C·西比拉, E·瓦倫廷 申請人:阿特羅瓦西公司