構象約束多肽序列的組合文庫的製作方法
2023-11-04 04:40:07 1
專利名稱：：構象約束多肽序列的組合文庫的製作方法構象約束多肽序列的組合文庫發明領域本發明涉及構象約束多肽序列(conformationallyconstrainedpolypeptidesequence)的組合文庫(combinatoriallibrary)及其用途。具體地，本發明涉及構象性表位(conformationalepitope)的組合文庫及其用途。
背景技術：
：限定單克隆抗體結合位點的需要已經導致表位文庫的開發。如此，Parmley和Sm池，Gene73:305318(1988)開發了噬菌體表達載體，其可用於構建大的噬菌體集合，所述噬菌體在其表面上展示短的肽序列。然後可通過生物淘選來純化展示外來表位的噬菌體，如例如由Parmley和Smith,見上文；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:63786382(1990);Scott和Smith,Science249:386390(1990);Christian等，J.Mol.Biol.227:711718(1992);Smith和Scott,MethodsinEnzymology217:228257(1993)所記載的。隨後此技術延伸至通過生物淘選表位文庫來鑑定抗體的肽配體，所述肽配體可在例如疫苗開發和表位作圖中使用(Scott,J.K.,TrendsinBiochem.Sci.17:241245(1992)。用於生物淘選表位文庫的已知方法已經導致了短的(通常長至約6個胺基酸)線性表位序列或不存在於天然蛋白質序列內而是模擬天然線性表位的肽序列的鑑定。然而，線性表位是不連續的或構象性的表位的片段，而且具有比它們為其中一部分的構象性表位低的功能效力。因此，會想要展示構象性表位或模擬構象性表位的本質特性，後者通過接近地放置採取或近似構象的不連續表位而由於其結構支持元件(structuralsupportelement)的4妄近性或存在來實現。此類構象性表位文庫可包括所有構象性表位的物理上可選擇的展示(physicallyselectabledisplay),用於選擇針對所有構象性表位的抗體，並會具有許多別的益處和效用。發明概述本發明至少部分基於如下認識，即接近地放置不連續表位和/或使用結構支持元件能重建構象性表位的本質特性，而且類似的方法可延伸至重建蛋白質的其它三維結構或功能元件，諸如受體的配體結合區、酶的底物結合區等。如此，一方面，本發明涉及一種物理上可選擇的展示，其包含一種或多種天然或變異多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物(tandemormultimericassembly),或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物，其中至少一些所述裝配物形成構象約束多肽靶物，並且其中至少一些所述片段不同於抗體片段。另一方面，本發明涉及一種篩選方法，包括Ca)提供物理上可選擇的展示，其包含一種或多種天然或變異多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物，其中至少一些所述裝配物形成構象約束多肽靶物，並且其中至少一些所述片段不同於抗體片段；(b)使所述展示與候選結合配偶體的文庫在如下條件下接觸，其中彼此具有結合親和力的構象約束多肽靶物和候選結合配偶體形成靶物-結合配偶體複合物；並(c)檢測至少一些所形成的靶物-結合配偶體複合物。在一個實施方案中，所述方法可包括額外的步驟(d)鑑定參與至少一些所檢測出的靶物-結合配偶體複合物形成的靶序列。在另一個實施方案中，鑑定參與所有所檢測出的靶物-結合配偶體複合物形成的靶序列。在又一個實施方案中，所述候選結合配偶體是抗體、抗體片段或抗體模擬物。在一個進一步的實施方案中，另外鑑定參與至少一些所述靶物-結合配偶體複合物形成的抗體、抗體片段或抗體模擬物序列。在一個更進一步的實施方案中，上述方法進一步包括在步驟(d)之前富集和分開參與至少一些所述耙物-結合配偶體複合物形成的靶序列和抗體、抗體片段或抗體模擬物序列的步驟。在一個別的實施方案中，所述方法進一步包括在所述富集和分開之後且在步驟(d)之前獨立地回收參與至少一些所述靶物-結合配偶體複合物形成的耙序列和抗體、抗體片段或抗體模擬物序列的步驟。在一個不同的實施方案中，參與至少一些所述耙物-結合配偶體複合物形成的靶序列是構象性表位的一部分。又一方面，本發明涉及一種方法，包括(a)提供物理上可選擇的展示，其包含一種或多種天然或變異多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物，其中至少一些所述裝配物形成構象性表位；(b)使所述展示與抗體文庫在如下條件下接觸，其中彼此具有結合親和力的構象性表位和抗體文庫成員形成構象性表位-抗體複合物；並(c)檢測至少一些所形成的構象性表位-抗體複合物。在一個具體的實施方案衝，所述構象性表位是通過基因片段或其模擬物的串聯或多聚體裝配物的表達而獲得的。在另一個實施方案中，所述基因片段起源於靶定的生物學相關來源，其中所述靶定的生物學有關來源可以例如選自下組細胞、組織、器官和生物體。其它生物學有關來源包括幹細胞、活化的免疫細胞、患病的組織、器官和病理性生物體。在一個進一步的實施方案中，通過分析靶定的生物學有關來源中的基因表達數據來鑑定至少一些所述基因片段。下列具體的實施方案應用於本發明的所有方面。在所有方面，優選的物理上可選擇的展示是構象性表位文庫。在多個實施方案中，所述展示可含有超過一種天然或變異多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬此類片段的序列的串聯或多聚體裝酉己4勿。在其它實施方案中，至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含兩種或更多種來自相同多肽的不同部分的序列，其中所述序列可包括胞內序列。在一個具體的實施方案中，每個串聯或多聚體裝配物包含兩種或更多種來自相同多肽的不同部分的序列，其中所述序列可包括胞內序列。在一個進一步的實施方案中，所述串聯或多聚體裝配物包含抗體或抗體片段，和抗體或抗體片段的配體。在進一步的實施方案中，在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或模擬序列是彼此直接融合的。在不同的實施方案中，在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或模擬序列是由外源連接序列偶聯的。在別的實施方案中，在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或模擬序列由結構支持元件組成或包含結構支持元件，所述結構支持元件可以是例如一種或多種蛋白質家族的特徵性基序，諸如螺旋束(helicalbundle)、卩-片層結構(卩-sheetstructure)、三葉結構(trifoilstructure)、跨膜螺旋(membrane-spanninghelix)、或月包夕卜環(extracellularloop)。在另一個實施方案中，至少一些所述構象約束多肽靶物是由於所述串聯或多聚體裝配物中所存在的所述片段的接近性而形成的。或者/另外，至少一些所述構象約束多肽靶物可以是由於所述串聯或多聚體裝配物中所述結構支持元件的存在而形成的。在所有方面，可使用合適的展示系統來展示構象約束多肽靶物和/或候選結合配偶體，所述合適的展示系統包括但不限於病毒的、真核生物的和細菌的及體外展示系統，諸如例如噬菌體、哺乳動物、酵母、細菌細胞和孢子展示系統、核糖體、mRNA和DNA展示。在一個具體的實施方案中，孢子展示系統是枯草芽孢桿菌CSacz7/ws或蘇雲金芽孢桿菌CSac/〃wf/z駅77g7'e肌》孑包子展示。在所有方面，抗體片段可以是但不限於Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、(scFv)2、和dAb片段、線性抗體、單鏈抗體分子、迷你抗體(minibody)、雙抗體(diabody)、或由抗體片段形成的多特異性抗體，而抗體模擬物可以是例如親和體(affibody)或適體(aptamer)。本發明進一步涉及用於製備本文中物理上可選擇的展示的方法和手段，包括但不限於合適的編碼序列、載體、和重組宿主細胞。附圖簡述圖l顯示了用於在本發明的展示中呈現構象性表位的兩種方法。在第一種方法(類型I)中，兩個多肽片段由柔性接頭(flexiblelinker)彼此連接，並與展示媒介物系在一起(tethered)。在此情況中，由兩種片段的接近性和摺疊能力(由於柔性連接接頭)來促進構象性表位的形成。在第二種方法(類型II)中，兩個多肽片段由結構支架連接，並與展示媒介物系在一起，其中由結構支架來促進構象性表位的形成。圖2顯示了用於同時選擇構象性表位和抗體文庫的方法，其中使用孢子展示來呈現構象性表位文庫，而抗體文庫是噬菌粒文庫。圖3顯示了促紅細胞生成素(EPO)交換環(crossoverloop)、促血小板生成素(TPO)交換環和EPO/TPOC-D交換環嵌合構建體，其可用於呈現EPO和/或TPO的構象性表位。圖4顯示了使用圖3中所顯示的EPO/TPOC-D交換環嵌合構建體來鑑定構象性表位指導的針對促血小板生成素(TPO)的抗體，接著選擇也在圖3中所顯示的天然TPO交換環。圖5顯示了配體誘導的構象性表位穩定化，其使用系在一起的抗原-抗體展示來實現。圖6顯示了用於同時選擇構象性表位和抗體文庫的方法，其中使用噬菌體展示來呈現這兩種文庫。發明詳述A.定義除非另有定義，本文中所使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的普通技術人員通常理解相同的含義。Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)為本領域技術人員提供了本申請中所使用的許多術語的一般指導。本領域技術人員會認識到與本文中所描述的方法和材料類似的或等同的許多方法和材料，它們能在本發明的實施中使用。確實，本發明決不局限於所描述的方法和材料。出於本發明的目的，下文定義了如下術語。術語"表位"，如本文中所使用的，指至少約3-5個、優選至少約5-10個或至少約5-15個胺基酸，且通常不超過約500個或約1,000個胺基酸的序列，所述胺基酸限定如下序列，其自身或作為更大序列的一部分而結合應答所述序列所生成的抗體。表位不限於具有與衍生其的親本蛋白質那部分相同的序列的多肽。確實，病毒基因組處於不斷變化的狀態，而且在隔離群之間展現出相對高度的變異性。如此，術語"表位"涵蓋與天然序列相同的序列，以及對天然序列的修飾，諸如刪除、替代和/或插入。一般而言，此類》務飾本質上是保守的，但還涵蓋非保守的修飾。該術語明確包括"模擬表位"(mimotope)，即如下序列，其不鑑定連續的線性天然序列或不必在天然蛋白質中存在，但在功能方面模擬天然蛋白質上的表位。術語"表位"明確包括線性和構象性表位。如本文中所使用的，術語"構象性表位"指由蛋白質的不連續部分所形成的，具有正確摺疊的全長天然蛋白質中相應序列的結構特徵的表位。限定表位的序列(包括構成構象性表位的不連續部分的序列)的長度可以有極大的變化，因為這些表位是由蛋白質的三維結構所形成的。如此，限定表位的胺基酸可以是數目上相對較少的，沿著分子的長度廣泛地分散，經由摺疊而變成正確的表位構象。限定表位的殘基之間的蛋白質部分對於表位的構象結構可能不是至關重要的。例如，對這些居間序列的刪除或替代可能不影響構象性表位，只要維持對表位構象至關重要的序列。如此，"構象性表位"，如本文中所定義的，不要求與天然構象性表位相同，而是包括重建(展現)天然構象性表位的本質特性(諸如定性的抗體結合特性)的構象約束結構。"線性表位"是不連續的或構象性的表位的片段。給定多肽中包括表位的區域可使用本領域中公知的許多表位作圖技術來鑑定。參見侈'B口EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,巻66(GlennE.Morris,編，1996)HumanaPress,Totowa，N.J。短語"構象約束多肽靶物，，指由蛋白質的不連續部分或不存在於天然蛋白質中的人工序列所形成的，具有正確摺疊的全長天然蛋白質中相應序列的結構特徵的結合序列。該術語明確包括構象性表位，但還有受體、酶及其它蛋白質的結合區(袋)，包括模擬此類結合區的序列。在所有情況中，限定構象約束多肽靶物的序列可以有極大的變化，因為這些構象約束結合區是由蛋白質的三維結構所形成的。如此，限定構象約束多肽靶物的胺基酸可以是數目上相對較少的，沿著分子的長度廣泛地分散，經由摺疊而變成正確的構象。限定結合區的殘基之間的蛋白質部分對於構象結構可能不是至關重要的。例如，對這些居間序列的刪除或替代可能不影響構象性結合區，只要維持對正確的構象至關重要的序列。如此，"構象約束多肽靶物"，如本文中所定義的，不要求與存在於天然蛋白質中的結構元件相同，而是包括重建(展現)此類天然結構的本質特性(諸如結合特性)的構象約束結構。術語"結合配偶體"在本文中以最廣義使用，指在體外和/或體內條件下能夠通過共價連接或通過非共價結合而彼此連接的兩個或更多個多肽序列。此類結合配偶體的例子包括但不限於抗體與抗原、配體與受體、酶與底物、有配體的抗體(ligandedantibody)與識別此類有配體的抗體的抗免疫球蛋白抗體、抗獨特型抗體與它所結合的抗體，它們可以是分離的，或者是它們存在於其中的或將它們導入其中的細胞、組織、器官或生物體的一部分。可通過超過兩個結合配偶體的結合而發生結合。通過"結合配偶體複合物"或"靶物-結合配偶體複合物"指以特定的可檢測的方式彼此連接的兩個或更多個結合配偶體(如上文所定義的)(諸如耙物與結合所述耙物的分子)的結合；如此，例如，配體與受體、抗體與抗原、酶與底物、抗體與抗獨特型抗體、有配體的抗體與結合它的抗體的結合。術語"固體支持物"在用於本文時指可連接靶物及其候選結合配偶體和耙物-結合配偶體複合物的不溶性基質。固體支持物本質上通常是生物學的，諸如但不限於細胞、孢子、或病毒或噬菌體顆粒。術語"偶聯物"、"經偶聯的"和"偶聯"指任何和所有形式的共價或非共價鍵，而且包括但不限於直接的遺傳融合或化學融合、經由接頭或交聯劑的偶聯、和非共價結合，例如使用亮氨酸拉鏈。術語"串聯或多聚體裝配物"、"串聯裝配物"和"多聚體裝配物，，以最廣義使用，指通過任何手段(包括偶聯(如上文所定義的)或通過絡合)而彼此結合的兩個或更多個多肽片段，其中所述"片段"可以與天然多肽的一部分相同和/或可以是不存在於天然多肽靶物中的人工序列。"串聯裝配物"指兩個片段的結合，而"多聚體裝配物"指超過兩個片段的結合。術語"融合/融合物"在本文中用於指一條多肽鏈中不同起源的胺基酸序對其末端之一的融合/融合物之外，術語"融合/融合物"明確涵蓋內部的融合/融合物，即在多肽鏈內插入不同起源的序列。如本文中所使用的，術語"肽"、"多肽"和"蛋白質"均指通過共價"肽連接，，而連接的胺基酸一級序列。一般而言，肽由少許胺基酸組成，通常約2個至約50個胺基酸，並且短於蛋白質。術語"多肽"，如本文中所定義的，涵蓋肽和蛋白質。在本發明的語境中，術語"抗體，，(Ab)以最廣義使用，包括展現出對特定抗原的結合特異性的多肽以及缺乏抗原特異性的免疫球蛋白和其它抗體樣分子。後一類多肽例如由淋巴系統以低水平生成，和由骨髓瘤以升高的水平生成。在本申請中，術語"抗體"明確涵蓋但不限於單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段。"天然抗體"通常是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構成的，大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過共價二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變域(VH),接著是多個恆定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(VL),另一端是一個恆定域；輕鏈的恆定域與重鏈的第一恆定域排列在一起，而輕鏈可變域與重鏈可變域排列在一起。認為特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面，Chothia等，J.Mol.Biol.186:651(1985);Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4592(1985)。關於抗體鏈的術語"可變的"用於指抗體鏈中在抗體間序列差異廣泛且參與每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的部分。此變異性集中於輕鏈和重鏈可變域兩者中稱作高變區的三個區段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各包含四個FR(分別是FR1、FR2、FR3和FR4)，它們大多採取(3-片層構造，通過形成環狀連接且在有些情況中形成P-片層結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR非常接近的保持在一起，並與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.(1991),第647-669頁)。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性中的參與。術語"高變區"在用於本文時指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自"互補決定區"或"CDR"的胺基酸殘基(即輕鏈可變域中的殘基30-36(Ll)、46-55(L2)和86-96(L3)及重鏈可變區中的殘基30-35(Hl)、47-58(H2)和93-101(H3);MacCallum等，JMolBiol.1996)。術語"框架區"指抗體可變區中存在於更趨異的CDR區之間的本領域公認部分。此類框架區通常稱為框架l-4(FR1、FR2、FR3和FR4),並為在三維空間中保持重鏈或輕鏈抗體可變區中找到的三個CDR提供支架，使得CDR能形成抗原結合表面。抗體根據其重鏈恆定域的胺基酸序列可分為不同的類。有五大類抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些可進一步分成亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恆定域分別稱為a、5、e、y和P。來自任何脊推動物物種的抗體的"輕鏈"根據其恆定域的胺基酸序列可歸入兩種截然不同的型之一，稱作卡帕(K)和拉姆達(X)。"抗體片段"包含全長抗體的一部分，一般是其抗原結合域或可變域。抗體片段的例子包括但不限於Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、(scFv)2、dAb和互補決定區(CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、迷你抗體、雙抗體、由抗體片段形成的多特異性抗體，及一般而言，至少含有免疫球蛋白中足以將特異性抗原結合賦予多肽的部分的多肽。術語"單克隆抗體"用於指由B細胞的單一克隆合成的抗體分子。修飾語"單克隆"指示抗體從基本上同質的抗體群獲得的特徵，不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。如此，單克隆抗體可通過最初由Kohler和Milstein，Nature256:495(1975);Eur.J.Immunol.6:511(1976)記載的雜交瘤方法來製備，可通過重組DNA技術來製備，或者還可從噬菌體或其它抗體文庫分離。術語"多克隆抗體"用於指由B細胞群體合成的抗體分子群體。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vl域，其中這些域存在於一條多肽鏈中。一般而言，FV多肽在VH和VL域之間進一步包含多肽接頭，使得sFv能夠形成結合抗原的期望結構。關於sFv的綜述參見Pliickthun，於ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113巻,Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork,第269-315頁，1994。單鏈抗體披露於例如WO88/06630和WO92/01047。雙抗體是二價的雙特異性抗體，其中在一條多肽鏈上表達VH和Vj或，但使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個域之間不能配對，由此迫使域與另一條鏈的互補域配對，產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:64446448(1993);及Poljak,R.J.等，Structure2:11211123(1994))。術語"迷你抗體"用於指自我裝配成80kDa的二價二聚體(scFv-CH3)2的scFv-CH3融合蛋白。術語"適體，，在本文中用於指以高特異性和親和力結合蛋白質靶物的合成的核酸配體。已知適體是蛋白質功能的有力抑制劑。術語"親和體"用於指工程化的、靶物特異性的非免疫球蛋白結合蛋白，其通常基於自葡萄球菌蛋白A衍生的Z域的三螺旋支架。58個胺基酸的Z域衍生自金黃色葡萄球菌0Sto;/2y/ococcwawww力蛋白A(SPA)中的5個同源域之一(B域)。SPA強烈地結合免疫球蛋白的Fc區，並且Z最初開發為穩定化的基因融合配偶體，用於通過^f吏用含有IgG的樹脂來親和純化重組蛋白。SPA的B域和Fc片段之間的複合物的結構顯示了結合表面由螺旋1和2上暴露的殘基組成，而螺旋3不直接參與結合。親和體通常選自組合文庫，其中通常使螺旋l和2的Fc結合表面處的13個殘基隨機化。然後通過針對想要的靶物生物淘選噬菌體展示文庫來鑑定靶蛋白的特異性結合物。在多種生物化學測定法和臨床應用中，此類親和體可作為免疫球蛋白的備選使用。dAb片段(Ward等，Nature341:544546(1989))由Vh域組成。可以將一個或多個CDR共價地或非共價地摻入分子中以使其成為"免疫粘附素"。免疫粘附素可摻入CDR作為更大多肽鏈的一部分，可共價地將CDR連接至另一多肽鏈，或可非共價地摻入CDR。CDR容許免疫粘附素特異性結合感興趣的特定抗原。如本文中所使用的，術語"抗體結合區"指免疫球蛋白或抗體可變區中能夠結合抗原的一個或多個部分。通常，抗體結合區是例如抗體輕鏈(VL)(或其可變區)、抗體重鏈(VH)(或其可變區)、重鏈Fd區、組合的抗體輕鏈和重鏈(或其可變區)，諸如Fab、F(ab，)2、單域、或單鏈抗體(scFv)、或全長抗體，例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgAl、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。術語"胺基酸"或"胺基酸殘基"通常指具有其本領域公認的定義的胺基酸，諸如選自下組的胺基酸丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬醯胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);穀氨醯胺(Gln);穀氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(Ile);亮氨酸(Leu);賴氨酸(Lys);曱硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val)，儘管在想要時可使用經修飾的、合成的、或罕見的胺基酸。如此，37CFR1.822(b)(4)中所列出的經修飾的和不常見的胺基酸明確包括在此定義之內，並且通過提及而明確收入本文。胺基酸可細分成多個亞組。如此，胺基酸可分組為具有非極性側鏈(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val);帶負電荷的側鏈(例如Asp、Glu);帶正電荷的側鏈(例如Arg、His、Lys);或不帶電荷的極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。胺基酸還可分組為小的胺基酸(Gly、Ala)、親核性胺基酸(Ser、His、Thr、Cys)、疏水性胺基酸(Val、Leu、Ile、Met、Pro)、芳香族胺基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、醯胺(Asp、Glu)和鹼性胺基酸(Lys、Arg)。術語"多核苷酸"指核酸，諸如DNA分子和RNA分子及其類似物(例如使用核苦酸類似物或使用核酸化學所生成的DNA或RNA)。在想要時，多核苷酸可例如使用本領域公認的核酸化學以合成方法製備或使用例如聚合酶以酶法製備，並且若想要的話，可進行修飾。典型的修飾包括曱基化、生物素化及其它本領域^^知修飾。另外，核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，並且若想要的話，可連接至可檢測模塊。除非另有說明，術語"誘變"指用於改變多核苷酸或多肽序列的任何本領域公認技術。優選的誘變類型包括易錯PCR誘變、飽和誘變或其它定點誘變。術語"載體，，用於指能夠在細胞中自主複製並可以可操作連接DNA區段(例如基因或多核苦酸)以引起所附著區段複製的rDNA分子。能夠指導編碼一種或多種多肽的基因表達的載體在本文中稱為"表達載體"。術語"控制序列，，指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適於原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操糹^因序列、和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處於功能性相互關係中，則它是"可操作連才妄的"。例長口，若前序列(presequence)或分泌前導(secretoryleader)的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的定位促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的，，意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導的情況中意味著相鄰且處於閱讀狀態。然而，增強子不必相鄰。連接通過在方便的限制性位點處的連接來實現。若沒有此類位點，則依照常規實踐使用合成的寡核香酸遊f接頭或接頭。百分比胺基酸序列同一性可使用序列比較程序NCBI-BLAST2(Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997))確定。NCBI-BLAST2序列比較程序可以從http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov下載，或者以其它方式從國家衛生研究所(NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD)獲得。NCBI-BLAST2使用幾項搜索參數，其中所有搜索參數設成預設值，包括例如未遮掩=是，鏈=全部，期望發生=10，最小低複雜性長度=15/5,多通過e值二0.01，多通過常數=25，最終缺口對比的降^氐=25,和評分矩陣-BLOSUM62。術語"亮氨酸拉鏈"用於指通常含有4-5個亮氨酸殘基，作為保守域存在於數種蛋白質中的重複性七肽基序。亮氨酸拉鏈摺疊為短的、平行的巻曲螺旋，並且認為負責包含它們所形成的域的蛋白質的寡聚化。術語"微陣列"指可雜交陣列元素，諸如多核苷酸探針在基底上的有序排列。短語"基因擴增"指在特定細胞或細胞系中形成基因或基因片段的多個拷貝的過程。所複製區域(一段擴增的DNA)常常稱為"擴增子"。通常，所生成信使RNA(mRNA)的量即基因表達水平也按所表達特定基因生成的拷貝數的比例升高。B.詳細描述用於實施本發明方法的技術在本領域中是公知的，並記載於標準實驗室教科書中，包括例如Ausubel等，CurrentProtocolsofMolecularBiology,JohnWileyandSons(1997);MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，J.Sambrook和D.W.Russell編，ColdSpringHarbor,NewYork,USA,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001;O'Brian等,AnalyticalChemistryofBacillusThuringiensis，Hickle和Fitch編,Am.Chem.Soc.,1990;Bacillusthuringiensis:biology,ecologyandsafety,T.R.Glare和M.O，Callaghan編，JohnWiley,2000;AntibodyPhageDisplay,MethodsandProtocols,HumanaPress,2001;及Antibodies,G.Subramanian編，KluwerAcademic,2004。例如，談變可使用定點誘變進行(Kunkel等，Proc.Natl.Acad.SciUSA82:488-492(1985))。PCR擴增方法記載於美國專利No.4,683,192，4,683,202,4，800，159,和4,965，188，及數本教科書中，包括PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification,H.Erlich編，StocktonPress,NewYork(1989);及PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis等編,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)。本發明涉及構象約束多肽靶物的物理上可選擇的展示，諸如構象性表位文庫。依照本發明，天然多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物或模擬此類片段的序列的串聯或多聚體裝配物以可選擇的方式展示，並用候選結合配偶體的文庫篩選。由於它們的接近性和/或由於結構支持元件的存在，串聯或多聚體裝配物中所存在的、作為三維結構元件(諸如構象性表位)的一部分的片段會採取正確的構象約束三維結構，並重新創建所討論的結構元件(諸如構象性表位)的本質特性。然後可以使用候選結合配偶體來篩選和鑑定構象約束結構。如此，可如下鑑定構象性表位，即用抗體文庫篩選多肽片段的串聯或多聚體裝配物的可選擇展示，並選擇匹配的靶物-抗體集合。這樣，可以針對所有蛋白質的所有可能構象性表位生成抗體。在一個更一般的方面，此方法適於平行選擇構象約束多肽結構和結合配偶體，諸如抗體、支架、蛋白質、肽等。如此，本發明包括克隆可表達基因片段的串聯或多聚體裝配物，和針對候選結合配偶體的文庫(諸如抗體文庫)篩選所克隆的裝配物集合。然後對匹配的靶物和結合配偶體(例如抗體)集合進行富集和分開，並可獨立地對靶序列和結合(例如抗體)序列進行回收和測序。在第一步中，使用標準克隆方案序貫地將兩種或更多種cDNA片段克隆入表達載體的兩個或更多個克隆位點中。所述位點可以是由合成的接頭(存在於能夠呈現游離氨基或夢A基末端和約束環的支架上)分開的，或者在一些情況中，可以是彼此直接融合的。圖l中顯示了構象性片段呈現的兩種代表性例子，並記載於實施例l中。在一個具體的實施方案中，參與串聯或多聚體裝配物的片段是彼此直接融合的，並通過表達編碼融合多肽序列的核酸來生成。或者，編碼序列可以由外來的可表達序列相連接，這導致其中串聯或多聚體片段由外來序列相連接的多肽的表達。可表達序列包括如下肽接頭，其具有足夠的長度以提供柔性，並容許相連接的片段運動，使得它們能採取想要的構象，但是又足夠短，以保持片段很接近地相連接，使得能誘導構象性變化。此類接頭通常長約3個至約25個殘基、或約5個至約20個殘基、或約8個至約15個殘基、或約10個至約15個殘基，雖然也可以使用更長的接頭，這取決於相連接的片段的性質。在另一個實施方案中，至少一個參與串聯或多聚體裝配物的片段是結構上受約束的，如此例如可以是螺;旋或P-片層結構，或一種或多種蛋白質家族的特徵性基序，諸如螺旋束、三葉結構、跨膜螺旋或胞外環。如此，有可能將靶蛋白的單一線性或不連續序列呈現在替代支架上，使得所導入的序列採用最初蛋白質的部分或全部構象性元件。此方法的一個例子記載於實施例3中。在實施例3中例示的和圖3和4中顯示的促血小板生成素(TPO)和促紅細胞生成素(EPO)之外，四螺旋結構(含有4束反向平行的螺旋束)是許多細胞因子的共同結構支架，諸如白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL國4、IL-5、IL-6、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-15、IL畫17、IL-18、IL-23及它們的相應家族成員，集落刺激因子(CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細胞巨噬細胞集落剌激因子(GMCSF)，以及數種生長因子。來自一種細胞因子的參照四螺旋束可以作為結構支架用於呈現來自其它螺旋束蛋白質(諸如其它細胞因子)的表位。類似地，來自受體(諸如7次跨膜受體)的胞外環可以作為支架用於展示來自相同或不同蛋白質的表位。此方法能夠對針對所有已知的四螺旋束蛋白質或以另一種定義明確的結構基序的存在為特徵的蛋白質的抗體進行容易的和定向的抗體選擇。或者，可以工程化改造這些支架以含有多個環、單個或多個螺旋替代、或者甚至來自任何數目靶蛋白的環和螺旋的組合。通過延伸，可以利用可溶性和單跨度蛋白質的其它保守結構元件來呈現和指導抗體對它們在關聯超家族蛋白質內的關鍵元件的識別。如此，可以將多跨度G蛋白偶聯受體的胞外域的部分嫁接至無關蛋白質支架，如實施例4中所例示的。可以在本發明的方法中4吏用的其它支架記載於Binz等，NatureBiotechnology23(10):1257-1268(2005)，在此通過提及而明確收錄且完整內容。此類支架包括但不限於CTLA-4、tandamistat、纖連蛋白、新制癌菌素(neocarzinostatin)、CMB4-2、脂籠蛋白(lipocalin)、T細胞受體、蛋白A域蛋白Z、lm9、設計的AR蛋白、鋅指、pVIII、鳥胰多肽、GCN4、WW域、Src同源性域3(SH3)、Src同源性域2(SH2)、PDZ域、TEM-1卩-內醯胺酶、GFP、硫氧還蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD指、Cl-2、BPTI、APPI、HPSTI、大腸桿菌素(ecotin)、LACI-D1、LDT-I、MTI-II、蠍毒素、昆蟲防衛素A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、細胞色素8562、Ldl受體域A、y-晶體蛋白、泛蛋白、轉鐵蛋白、C型凝集素樣域、Avimer(Avidia/Amgen)和微生物蛋白質(Amunix)。串聯或多聚體片段可衍生自任何已知的多核苦酸來源，包括單一基因、分化的細胞、組織、器官或生物體。如此，例如來自特定基因的隨機或想要針對想要的表位的抗體以及針對單個靶物的所有表位的抗體。此方法還提供了一種將所表達的基因轉變成供抗體選擇用的物理上重懸呈現的克隆集合的策略，消除了對克隆全長基因的需要。在另一個實施方案中，可以對微陣列或基因擴增研究的結果分析基因及其結構決定簇的差異表達(過表達或表達不足)。在微陣列技術的一個具體實施方案中，以密集陣列將經PCR擴增的cDNA克隆插入物應用至基底。優選的是，將至少10，000種核苷酸序列應用至基底。微陣列化的(microarrayed)基因(以每種10,000個元素(element)固定化於微晶片上的)適於在嚴格條件下雜交。可通過逆轉錄自感興趣組織提取的RNA來摻入螢光核苷酸，從而生成螢光標記的cDNA探針。應用於晶片的經標記cDNA探針特異性地雜交至陣列上的每個DNA點。嚴格清洗以除去非特異性結合的探針之後，通過共焦雷射顯微鏡檢術或通過另一種檢測方法(諸如CCD照相機)來掃描晶片。對每個陣列元素的雜交的定量容許評估相應的mRNA豐度。憑藉雙色螢光，將分開標記的、自兩種RNA來源生成的cDNA4笨針成對雜交至陣列。如此，同時測定與每種指定基因對應的、來自兩種來源的轉錄物的相對豐度。雜交的小型化規模為大量基因提供了表達樣式的便利且快速的評估。已經顯示了此類方法具有檢測罕見轉錄物(其以每個細胞幾個拷貝進行表達)和可再現地檢測至少約兩倍的表達水平差異所需要的靈敏性(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(2):106-149(1996))。可通過商品化的設備遵循製造商的方案(諸如通過使用AffymetrixGenChip技術或Incyte的微陣列技術)來實施微陣列分析。用於大規模基因表達分析的微陣列方法的開發使系統性搜索多種腫瘤類型中的癌症分類和結果預測的分子標誌成為可能。在鑑定出差異表達的決定簇(諸如相對於相同細胞類型的正常組織在患病組織(例如癌組織)中過表達或表達不足的決定簇)後，它們可進行再合成，例如通過肽合成的已知化學方法來實現。預期這種再合成方法將這些決定簇標準化，並產生具有巨大的組合可克隆成分深度的定向物理文庫。從靶細胞中取得RNA或總DNA，並隨後依照本發明篩選自此RNA或DNA表達的序列的串聯或多聚體裝配物能夠鑑定來自靶組織、器官或生物體的所有表位。如此，例如，此實施方案容許鑑定針對來自幹細胞、患病組織、活化的免疫細胞等的抗原決定簇的抗體。用於RNA和DNA提取的一般方法在本領域中是公知的，並披露於分子生物學的標準教科書中，包括Ausubel等,CurrentProtocolsofMolecularBiology,JohnWiley和Sons(1997)。用於從石蠟包埋組織(諸如癌症活組織檢查樣品)中提取RNA的方法披露於例如Rupp和Locker,LabInvest.56:A67(1987);及DeAndr6s等，BioTechniques18:42044(1995)中。具體地，可使用來自商業製造商(諸如Qiagen)的純化試劑盒、緩沖液組和蛋白酶依照製造商的指示來分離RNA。例如，可使用QiagenRNeasy迷你柱自培養中的細胞分離總RNA。其它商品化RNA分離試劑盒包括MasterPureTM完全DNA和RNA純化試劑盒(EPICENTRE⑧，Madison,WI)和石蠟塊RNA分離試劑盒(Ambion，Inc.)。可使用RNAStat-60(Tel-測試)自組織樣品分離總RNA。可通過例如氯化銫密度梯度離心來分離自腫瘤製備的RNA。克隆和表達載體在本領域中是公知的，而且是商品化的。載體構件一般包括但不限於以下一種或多種信號序列、複製起點、一種或多種標誌基因、增強子元件、啟動子、及轉錄終止序列。適於克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞有原核生物、酵母、或高等真核生物(哺乳動物)細胞。合適的原核生物包括革蘭氏陰性的或革蘭氏陽性的生物體，例如埃希氏菌屬(Esc/zeWc/z/a)(例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(五.co//))、腸桿菌屬(五"&rakcfe"、歐文氏菌屬(5rvWm'a)、克雷伯氏菌屬(尺/e^/e〃a)、變形菌屬(屍rafew力、沙門氏菌屬(5Wwowe〃a)(例如鼠傷寒沙門氏菌(h/mowe〃a/y//2/附wn'wm))、沙雷氏菌屬(5^raf&)(例如粘質沙雷氏菌OSerra"awa/rescara))、及志賀氏菌屬(幼!'ge〃a)、以及芽孢桿菌屬(5acz7/0(諸如枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(5.//c/7e"z/on7^)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中所披露的地衣芽孢桿菌41P))、假單胞菌屬(/^ewflfomowoy)(諸如銅綠假單胞菌(戶aerag/"osa))、及鏈黴菌屬(6^epto附少cey)。一種優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446),雖然其它菌抹諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X176(ATCC31，S!3"和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子是例示性的而非限制性的。合適的酵母包4舌啤酒jf唐酵母或酉良酒酵母(6"acc/zflrawycascweWw'ae)或普通麵包酵母。另外，許多其它屬、種和菌抹是通常可獲得的，而且在本文中是有用的，諸如粟酒裂殖糖酵母(&/2/20^^/7^0附>^&;70附6￡);克魯維氏酵母屬(《/w;/veramyce"宿主，諸如例如乳克魯維氏酵母(尺./ac&)、脆壁克魯維氏酵母(K/rag/to)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維氏酵母(尺.6w/gaWcw)(ATCC16,045)、威克曼氏克魯維氏酵母(尺.w/cA:eraw")(ATCC24，178)、〖wa/"7(ATCC56,500)、果蠅克魯維氏酵母(dmso//w7an/m)(ATCC36,906)、耐熱克魯維氏酵母(Awmoto/erara)、及馬克斯克魯維氏酵母(Imflr;a'朋w力；亞羅酵母屬(l^roWa)(EP402,226);巴斯德畢赤氏酵母(屍/c/z/a/ayfw/力(EP183,070);，i絲酵母屬(Ca"(i/(ia);瑞氏木黴(7Hc/o6fe7warees/a)(EP244,234);粗並造脈孢黴(A^wras/oracmysa);許旺氏酵母屬(5b/z麗朋/o，c&s),諸如西方許旺氏酵母(5"c/7麗w"/omyc&socc/tie"/"//";及絲狀真菌，諸如例如脈孢黴菌(AAewra^ora)、青黴屬CPew'cz7/Zww)、彎頸黴屬(7b/，oc/a&wm)和麴黴屬(y^/e/^〃/w力宿主，諸如構巢麴黴(Aw'ofw/a"力和黑麴黴(Am'ger》無脊推動物多細胞生物體的例子包括植物和昆蟲細胞，包括來自如下宿主的昆蟲宿主細胞，諸如草地夜蛾0S^OGfc!p&ra/ragz;peWa)(毛蟲)、埃及伊蚊(j^fes(蚊子)、白糹丈j尹蚊04etfesa/6opz'cfw"(蚊子)、黑腹果蠅(Dmsop/2z7awe/awogosfer)(果錄)、及家蠶(5om勿amon')。用於轉染昆蟲細胞的病毒抹包括例如苜蓿尺蠖G4wtogra;/zaca/z/owz'ca)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5林。還可利用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽牛花、番茄、及菸草的植物細胞培養物作為宿主。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括但不限於經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);為了在懸浮培養中生長而亞克隆的人胚腎系293(293細胞)(Graham等，J.GenVirol.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞託利(sertoli)細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod,23:243-251(1980));猴腎細胞(CVl,ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138,ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2,HB8065);小鼠乳房腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細胞；FS4細胞；及人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。可以在多種培養基中培養宿主細胞。商品化的培養基包括Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)(Sigma)。另夕卜，Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)和Bames等，Anal.Biochem.102:255(1980)中所記載的任何培養基可以用作宿主細胞的培養基。培養條件(諸如溫度、pH等)就是那些先前與選擇用於表達的宿主細胞一起使用的，而且包括在製造商的指導中或者通過其它途徑對於普通技術人員會是顯而易見的。在一個實施方案中，構成串聯或多聚體裝配物的所有片段是隨機選擇的。例如，可使用此方法來表達所有來自靶定群體的可表達表位。如較早所討論的，用於展示異源蛋白質(包括抗體和其它多肽)的系統在本領域中是公知的。已經在編碼抗體基因的絲狀噬菌體表面上展示了抗體片段(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol"222:381388(1992);McCafferty等，Nature348(6301):552554(1990);Griffiths等,EMBOJ"13(14):3245畫3260(1994))。關於用於選擇和篩選抗體文庫的技術的綜述，參見例如Hoogenboom，NatureBiotechnol.23(9):1105-1116(2005)。另夕卜，有本領域中已知的用於在大腸桿菌(Agterberg等，Gene88:37-45(1990);Charbit等,Gene70:181-189(1988);Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2713-2717(1992))和酵母諸如釀酒酵母(Boder和Wittrup，Nat.Biotechnol.15:553-557(1997);Kieke等，ProteinEng.10:1303-1310(1997))表面上展示異源蛋白質及其片段的系統。其它已知的展示技術包括核糖體或mRNA展示(Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022-9026(1994);Hanes和Pluckthun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4937—4942(1997))、DN樣示(Yonezawa等，Nucl.AcidRes.31(19):ell8(2003));微生物細胞展示諸如細菌展示(Georgiou等，NatureBiotech.15:29-34(1997))、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示(Isticato等，J.Bacteriol.183:6294-6301(2001);Cheng等，Appl.Environ.Microbiol.71:3337-3341(2005)和2006年11月13日提交的共同懸而未決的臨時申請流水號60/865，574)、病毒展示諸如逆轉錄病毒展示(Urban等，NucleicAcidsRes.33:e35(2005))、基於蛋白質-DNA連接的展示(Odegrip等，Proc.Acad.Natl.Sci.USA101:2806-2810(2004);Reiersen等，NucleicAcidsRes.33:elO(2005))和微珠(microbead)展示(Sepp等，FEBSLett.532:455-458(2002))。出於本發明的目的，多肽片段的串聯或多聚體裝配物(例如串聯和/或多聚體抗原片段)可方便地使用孢子展示來進行展示，包括使用枯草芽孢桿菌孢子外殼成分(CorB)的表面展示系統和蘇雲金芽孢桿菌(份)孢子展示，如記載於Isticato等，J.Bacteriol.183:6294-6301(2001);Cheng等,Appl.Environ.Microbiol.71:3337-3341(2005);及2006年11月13日提交的共同懸而未決的臨時申請流水號60/865,574的，在此通過提及明確收錄它們的完整公開文本。孢子展示系統是基於將要展示的序列附著於外殼蛋白(諸如枯草芽孢桿菌孢子外殼蛋白)或附著於毒素-原毒素(諸如價原毒素序列)。孢子展示系統的優點在於非真核性質的同質顆粒表面和顆粒大小，預期提供理想的非反應性背景。另外，孢子的顆粒大小足以能夠通過流式細胞術進行選擇，所述流式細胞術基於相互作用而容許可選擇克隆分離。通過影響孢子穩定性，有可能實施多種孢子形成後的化學的、酶的和/或環境的處理和修飾。如此，有可能使用三氟乙醇(TFE)用化學處理來穩定化結構性螺旋結構，若展示此類結構的話。另外，氧化壓力處理(諸如用反應性氧種類(例如過氧化物)或反應性氮種類(例如亞硝酸)進行的處理)是可能的。還有可能將孢子展示多肽的限定的或天然的群體暴露於酶促處理，諸如蛋白水解暴露、其它酶促過程、磷酸化等。其它可能的處理包括但不限於通過過氧亞硝酸鹽處理進行的亞硝基化，通過重組的、純化的或血清蛋白酶處理進行的蛋白水解，照射，與已知的伴侶蛋白(諸如熱休克蛋白(細菌的和哺乳動物的兩者))一起共溫育，用摺疊蛋白(諸如蛋白質二硫化物異構酶、脯氨醯異構酶等)進行的處理，凍幹，和防腐劑樣處理(諸如用硫柳汞進行的處理)。這些處理可通過本領域中7>知的方法進行。最後，可將噬菌體展示的抗體克隆與攜帶關聯抗原的各個孢子共同捕獲至孔。這能夠實現多重共分離和挽救抗原-抗體對。這也可類似地延伸至選擇和挽救其它結合配偶體。簡言之，在份孢子展示系統中，萬源毒素序列可獲自天然的價原毒素蛋白，可通過化學合成或重組DNA技術的方法生成，或通過本領域中已知的任何其它技術來生成。天然的價原毒素蛋白或其編碼序列可分離自多種份亞種，諸如例如庫爾斯塔克(kurstaki)亞種、松i蜀(dendrolimus)亞種、蠟螟(galleriae)亞種、殺蟲(entomocidus)亞種、鯰擇(aizawai)亞種、莫氏(morrisoni)亞種、多窩(tolworthi)亞種、阿萊(alesti)亞種或以色列(israelensis)亞種。如此，可通過本領域中已知的方法，使用合適的寡核苷酸引物和探針自合適的份亞種的染色體PCR擴增編碼說原毒素片段的DNA。然後可通過已知技術純化PCR產物，諸如例如通過使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)遵循製造商的指示來實現。適於克隆原毒素片段的重組宿主細胞包括原核生物、酵母或高等真核生物細胞。對於克隆和常規的質粒操作，優選的宿主是大腸桿菌。然後使用B源毒素序列在價孢子的表面上展示本發明的串聯或多聚體裝配物。如此，本發明還涉^Bf原毒素序列與此多肽序列串聯或多聚體裝配物的偶聯物。本發明的串聯或多聚體裝配物與5源毒素序列的偶聯可通過融合(優選在末端，諸如價原毒素序列的N或C端)來進行。或者，可使用合適的肽接頭序列來製備偶聯物。接頭序列以如下距離分開所展示的裝配物和A原毒素序列，所述距離足以確保每種序列能採取正確的構象(構象約束結構)，若所述序列中所存在的片段能夠形成此結構的話。接頭序列的長度可有所變化，並且一般在l個和約50個胺基酸之間，更通常地，長至約15個胺基酸，或長至約10個胺基酸，或長至約8個胺基酸，或長至約7個胺基酸，或長至約5個氛基酸，或長至約3個胺基酸。通過本領域中公知的方法將接頭序列摻入偶聯物中。為了促進所展示的分子的消除，接頭可以包含作為酶(諸如蛋白酶)的底物的序列。如此，在一個具體的實施方案中，給定蛋白酶的天然底物可作為接頭肽使用或包含在接頭肽之中。例如，接頭可以是或可以包含菸草蝕刻病毒(TEV)的底物位點(ENLYFOG)。或者，接頭肽可不同於蛋白酶的天然底物，但可包含能被蛋白酶切割的序列。如此，已知的是，胰蛋白酶樣蛋白酶在賴氨酸和精氨酸殘基的羧基側進行特異性切割，而胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶對酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基等處的切割是特異性的。原毒素序列與要展示的串聯或多聚體裝配物之間的連接可通過使用異二聚體基序來實現，其中形成二聚體的兩個成分可以是結合配偶體，它們彼此共價結合，或者可經由非共價相互作用而結合。例如。共價結合可經由在結合配偶體的半胱氨酸之間形成二闢"建而發生。可打破二硫鍵，並釋放所展示的裝配物，這通過用破壞二硫鍵的還原劑(諸如例如二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、(3-巰基乙醇、膦、硼氫化鈉等)進行的處理來實現。優選的是，使用含有硫醇基團的還原劑。可使用例如一對亮氨酸拉鏈肽來實現非共價的結合。亮氨酸拉鏈最初是在數種DNA結合蛋白中鑑定的(Landschulz等，Science240:1759,1988)。如此，亮氨酸拉鏈域是用於指這些蛋白質中所存在的，負責蛋白質二聚化的保守肽域的術語。亮氨酸拉鏈域包含重複性七肽重複，通常有4個或5個亮氨酸殘基，散布有其它胺基酸。例如，亮氨酸拉鏈肽包括公知的c-Jun"亮氨酸拉鏈肽"RIARLEEKVKTLKAQNSELASTA畫LREQVAQLKQKVMNY(SEQIDNO:l)和v-Fos"亮氨酸拉鏈肽"LTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAY(SEQIDNO:2)。核癌基因fos和jun的產物包含優先形成異二聚體的亮氨酸拉鏈域(O，Shea等，Science245:646，1989;Turner和Tjian，Science243:1689，1989)。亮氨酸拉鏈肽的其它例子包括但不限於酵母轉錄因子GCN4、大鼠肝中找到的一種熱穩定性DNA結合蛋白(C/EBP;Landschulz等，Science243:1681,1989)、鼠原癌基因c-myc的基因產物(Landschulz等，Science240:1759,1988)中找到的域。數種不同病毒(包括副粘病毒、冠狀病毒、麻滲病毒和許多逆轉錄病毒)的促融合蛋白也擁有亮氨酸拉鏈域(Buckland和Wild,Nature338:547,1989;Britton，Nature353:394，1991;Delwat和Mosialos,AIDSResearchandHumanRetroviruses6:703，1990)。通常優選使用合成的(與天然存在的相比)亮氨酸拉鏈肽，因為合成的序列可設計成展現出改善的特性，諸如穩定性。為了生成本發明的融合物，可以將所擴增的所原毒素DNA片段克隆入合適質粒中，符合要展示的串聯或多聚體裝配物的裝配物的編碼序列的讀碼框，在合適的孢子形成特異性啟動子的控制下。孢子形成特異性啟動子可以但不必須獲自與價原毒素片段起源相同的說亞種。可通過電穿孔將含有原毒素片段-異源多肽融合物的編碼序列的質粒導入說中，基本上如Du等，Appl.Environ.Microbiol.71(6):3337-3341(2005)所記載的，遵循Macaluso和Mettus，J.Bacteriol.173:1353-1356(1991)的方法進行。靶價菌林的質粒轉化後，將細胞培養於合適的培養基中以促進孢子形成。因此，份孢子會在其表面上展示存在於融合物中的異源肽或多肽。毒素展示的分子偶聯物被說成是附著至孢子表面，然而，實際上毒素成分到達孢子外殼內部，因為參與本文偶聯物的原毒素是孢子外殼的一部分，雖然它們不是外殼蛋白。可與在所有的孢子展示系統中使用類似的技術，包括附著於孢子外殼蛋白的展示，包括例如披露於美國專利申請公開文本No.20020150594;20030165538;20040180348;20040171065;及20040254364中的孢子展示系統。結合配偶體(諸如抗體)可有利地使用噬菌體展示來展示。在噬菌體展示中，將異源蛋白質(諸如單鏈抗體片段(scFv))連接至噬菌體顆粒的外殼蛋白，而表達它的DNA序列包裝在噬菌體外殼之內。噬菌體展示方法的詳情可見於例如McCafferty等，Nature348,552-553(1990))，該文獻記載了從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)域基因全集在體外生成人抗體和抗體片段。依照此技術，以符合讀碼框的方式將抗體V域基因克隆入絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，並作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。由於絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基於抗體的功能性特性的選擇也導致對編碼展現出那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式實施；關於它們的綜述，參見例如Johnson,KevinS.和Chiswell,DavidJ.,CurrentOpinioninStructuralBiology3,564-571(1993)。V基因區l殳的數種來源可用於噬菌體展示。Clackson等，Nature352,624-628(1991)從自經免疫小鼠的脾衍生的V基因小型隨機組合文庫分離了一批不同的抗D惡唑酮抗體。可構建來自未免疫人供體的V基因全集，並且可分離針對一批不同抗原(包括自身抗原)的抗體，基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222,581-597(1991)或Gri伍th等，EMBOJ.12,725-734(1993)所記載的技術進行。在天然的免疫應答中，抗體基因以高速率積累突變(體細胞高突變)。所導入的一些變化會賦予更高的親和力，並且展示高親和力表面免疫球蛋白的B細胞優先在隨後的抗原挑戰期間複製和分化。此天然過程可通過採用稱為"鏈改組"的技術來模擬(Marks等，Bio/Techno1.10,779-783(1992))。在此方法中，通過噬菌體的V域基因變體(全集)的全集序貫替換重鏈和輕鏈V區基因而得到改善。此技術容許生成具有在nM範圍內的親和力的抗體和抗體片段。用於製備非常大的噬菌體抗體全集的策略已經記載於Waterhouse等，Nucl.AcidsRes.21,2265-2266(1993)。圖2中顯示了孢子上展示的表位文庫和抗體文庫的噬菌體展示的同時選擇。簡言之，在第1步中，將孢子展示的構象性表位文庫與噬菌粒抗體文庫組合。通過離心來收集孢子，並洗去未結合的抗體噬菌體。接著，通過添加小鼠抗噬菌體抗體和順磁性抗小鼠珠來除去未結合的孢子。將噬菌體-孢子複合物結合至磁性柱，然後對其進行清洗以除去未結合的孢子。這些步驟之後，可回收噬菌體-孢子複合物，可自孢子解離噬菌體，並可選擇性擴增噬菌體和孢子。可根據需要重複上述步驟，通常再進行2次至4次。在第3步中，可將孢子分揀入各個微板孔中，例如通過添加小鼠抗噬菌體抗體和經可4企測標記(例如焚光)的抗小鼠抗體來實現。然後可擴增噬菌體，並增殖攜帶孢子展示序列的芽孢桿菌(例如蘇雲金芽孢桿菌)。構象性表位和抗體文庫的同時選擇也是有可能的，若每種使用相同的載體進行展示的話。圖6中顯示了用於同時選擇構象性表位和抗體文庫(均以噬菌體展示呈現的)的例示性方法。在第1步中，除去未結合的抗體噬菌體。首先，將由合適的標籤(例如HA)標記的噬菌粒構象性表位文庫與用不同的標籤(例如FLAG)標記的噬菌粒抗體文庫組合。通過親和純化來分離HA表位噬菌體和複合的抗體噬菌體，並洗去未結合的抗體噬菌體。接著，解離複合的噬菌體，並擴增表位和文庫噬菌粒集合，例如使用大腸桿菌作為宿主來進行。在第2步中，除去未結合的表位噬菌體。首先，帶有HA標籤的噬菌粒構象性表位文庫與帶有FLAG標籤的噬菌粒抗體文庫再次組合，並通過親和純化來分離FLAG抗體噬菌體和複合的表位噬菌體。洗去未結合的表位噬菌體，解離複合的噬菌體，並擴增表位和文庫噬菌粒集合，例如使用大腸桿菌宿主細胞來進行。雖然已經參照某些噬菌體和孢子展示系統例示了本發明，但是它不限於此。噬菌體和孢子展示系統僅是例示性的，並且其它展示(無論本文中是否明確提及)也適於實施本發明。在以下非限制性實施例中提供了本發明的進一步詳情。實施例實施例l:串聯裝配的構象性cDNA片段(圖1和圖2)為了裝配來自靶定群體的所有可表達表位，首先提供來自該靶定群體的所表達基因的集合。在本情況中，目標是自活化的淋巴細胞捕獲所有可能的構象性表位，但是本文中所描述的方法同樣適用於自任何來源捕獲構象性表位。首先，通過將全血收集入BDVacutainerCP丁TM細胞製備管中來自三名個體分離外周血單個核細胞。接著，如下活化淋巴細胞，即將來自三個集合中的每個的le7細胞混合在一起，接著溫育6小時。溫育之後，通過Tri試劑(Sigma)自新鮮的或RNAlater穩定化的組織提取總RNA。隨後，使用01igotex純化(Qiagen)來將分離的供體總RNA進一步純化成mRNA。接著，通過使用隨機九聚物寡核苷酸和/或寡((1丁)1851物依照AccuScript逆轉錄酶(Stratagene)的方案來生成第一鏈cDNA合成。簡言之，將AccuscriptRT緩沖液(Stratagene)中的100ngmRNA、0.5mMdNTP和300ng隨機九聚物和/或500ng寡(dT),8引物於65。C溫育5分鐘，接著快速冷卻至4。C。然後，添加10x逆轉錄酶反應緩衝液(Stratagene)、100mMDTT、AccuscriptRT和RNA酶阻斷劑(RNAseBlock),並於42。C溫育H、時，並通過於70。C加熱15分鐘來滅活逆轉錄酶。然後可使用標準克隆方案將這些cDNA片段序貫地克隆入表達載體的兩個串聯克隆位點中。串聯位點或是由合成接頭分開或是存在於能夠呈現游離氨基或^^端和限制性環的支架上。(圖l，類型I和類型II)。在本情況中，將這些所表達的串聯片段以與蘇雲金芽孢桿菌原毒素的重組融合物的形式系至孢子表面。針對組合抗體文庫篩選所得孢子展示集合以富集對活化的淋巴細胞構象性表位有反應性的克隆。為了篩選，將含有107-108個蘇雲金芽孢桿菌孢子的lml與10氣10"個噬菌體混合，並將集合於室溫溫育2小時。此溫育之後，通過離心來收穫孢子集合和結合的抗體。離心除去所有未結合的噬菌體，得到未結合的孢子和孢子噬菌體複合物兩者的集合。接著，如下正選擇孢子-噬菌體複合物，即將混合物與小鼠單克隆抗噬菌體抗體和供磁性選擇用的抗小鼠順磁性納米顆粒(Miltenyi)或供基於FACS的富集或分離用的經螢光偶聯的抗小鼠抗體一起溫育(圖2)。然後將複合物用pH2.2甘氨酸處理10分鐘，然後用2MTris中和。此酸洗脫之後，抗體-抗原相互作用受到不可逆的破壞，並且噬菌體能離開孢子，隨著再次增殖和選擇大腸桿菌和芽孢桿菌而擴增。或者，可挽救噬菌體和孢子編碼DNA,並使用其它分子生物學技術(諸如PCR)進行擴增。3-5輪選擇之後，預期抗體集合得到充分的富集以對活化的淋巴細胞進行進一步的測試或選擇。為了證明特異性富集，將抗體克隆的個體或集合製備為可溶性抗體片段，並通過流式細胞術來測試其對活化的淋巴細胞群體進行染色的能力。具體地，於30。C在補充有50pg/ml氨千青黴素和100nMIPTG的2-YT中在大腸桿菌菌才朱HB2151中將200ml抗體克隆培養物培養過夜。此過夜生長之後，通過離心來收穫細胞。為了分離在它們的周質中積累的抗體蛋白質，首先將細胞重懸於10mlBBS-10E(200mM硼酸、150mM氯化鈉、和10mMEDTA)中。接著，添力口5mlBBS-10EL(200mM硼酸、150mM氯化鈉、10mMEDTA和10mg/ml溶菌酶)，並於37。C將混合物放置在定軌搖床中達60-90分鐘。此溫育之後，通過離心從含有抗體的溶胞產物中除去細胞碎片。接著將此溶胞物與親本孢子一起溫育以檢測對關聯表位的結合。具體地，在終體積0.1ml中於室溫用含有3。/。BSA的PBS封閉孢子達15分鐘。向這些經封閉的孢子添加O.lml溶胞物，並將混合物於4。C溫育1小時。接著，通過添加0.8mlPBS來進行清洗，然後通過離心來再次分離孢子。然後，使用小鼠單克隆抗His6抗體來檢測抗體對孢子的結合，其通過於4。C溫育30-60分鐘來進行。另一次清洗之後，用合適的抗小鼠藻紅蛋白焚光團偶聯物來檢測結合。可通過傳統的蛋白質組學和分子生物學方法來鑑定任何特異性抗體的關聯抗原。或者，可使用明確鑑定出的抗體來回收其含有構象性表位的關聯孢子克隆。因為表位是在孢子攜帶的質粒上編碼的，所以它能測序並用於自公眾可獲得的序列資料庫鑑定親本基因。.預期本實施例中所描述的方法為感興趣的任何特定細胞群體或組織生成所有可能的抗原。因為這些片段是隨機的，所以不僅能評估構象性表位，而且還能評估來自單種，甚至多種蛋白質的不連續表位。實施例2:單一基因構象性片段在生成針對指定抗原的抗體中，通常發現針對一種或多種免疫優勢表位的體液應答。在許多情況中，想要的功能性抗體可能需要識別免疫優勢較小的表位。在此情況中，通常設法用抗體封閉免疫優勢表位，然後再次免疫或選擇。然後的體液應答針對下一個最易接近的表位，其仍可能生成或不生成想要的抗體。因為新抗體發現的目標是生成針對功能性構象性表位的抗體，由此可見會表達這樣的表位以進行選擇。單一表位可能僅產生針對線性決定簇的應答，其中所得的抗體可能不識別天然蛋白質。為了提高生成針對此天然蛋白質的構象性抗體的可能性，此表位需要在一些關鍵結構元件的背景內進行表達以侵_接近天然蛋白質。因而，將想要的表位用合成方法裝配成串聯構建體的單一位點，然後用來自親本蛋白質的片段補充第二位點。此第二片段起結構性構象催化劑的作用。在一個具體的實施方案中，用單一序列固定第一片段，然後將來自親本蛋白質的隨機片段插入第二位點中，然後將其用重組方法系至芽孢桿菌載體，諸如蘇雲金芽孢桿菌孢子外殼蛋白。接著，針對組合抗體文庫來篩選此集合，如實施例l中所描述的。3-5輪雙重選擇之後，針對天然蛋白質來對此富集的抗體集合進行反選擇。保留識別天然結構的結合抗體，擴增，並鑑定。預期構象催化提供一般性結構支持，其也可由相關結構替代物來提供。因此，作為第二位點的另一個選項，摻入單一基序或替代結構基序的集合以補充和"催化"構象性表位形成。在此實施例中，描述了單一表位的強制識別。然而，還可將片段隨機化，使得所有可能表位的表達分開。在此情況中，可同時篩選針對單一蛋白質的所有可能表位，由此生成針對特定蛋白質的所有可能抗體解決方案。實施例3:可溶性超家族構象性抗原(圖3和圖4)有可能在替代支架上呈現靶蛋白質的單一線性或不連續序列，使得所導入的序列採取最初蛋白質的部分或全部構象性元件。在此實施例中，在促血小板生成素(Tpo)(—種四螺旋束細胞因子)與中和性抗體之間重新創建已知的靶物-抗體相互作用。抗Tpo抗體TNl識別來自Tpo的交換環。在將此環疊加在緊密相關的替代四螺旋束蛋白質(諸如促紅細胞生成素(Epo))之上時，預期其擁有足夠的結構構象，使得TN1抗體結合嵌合蛋白。具體地，構建兩類Epo-Tpo環蛋白。第一種用來自Tpo的胺基酸57-61替代Epo中的胺基酸57-61。這對應於交換環。因為環的前後呈現可能是至關重要的，還製備另一種Epo-Tpo環蛋白，其額外含有來自Tpo的鄰近螺旋序列。在此情況中，用來自Tpo的胺基酸53-68替代Epo中的胺基酸53-68。邊界以Tpo和Epo兩者中找到的保守序列限定，目的在於它們可能給交換環提供甚至更大的構象穩定性。因為TN1抗體的晶體結構已經顯示了一些與B螺旋的輕微近程接觸，還在Epo-Tpo突變體的背景中製備了上述兩種Tpo環構建體，所述Epo-Tpo突變體含有相應的Tpo替代，即用來自Tpo的胺基酸l10-125替代Epo中的胺基酸l14-139以及用來自Tpo的胺基酸97-134替代Epo中的胺基酸102-148。以重組方式將上文所述Epo-Tpo環蛋白融合至芽孢桿菌原毒素孢子展示系統，並針對TN1抗體篩選孢子。預期這些構建體在單輪淘選中選擇性結合和富集TN1抗體，超過無關陰性對照抗體。接著，我們經過3-5輪孢子淘選來針對組合抗體文庫篩選富集最好的ETL蛋白。這完成之後，對所富集的抗體反選擇對天然Tpo蛋白的結合。結果，鑑定出的任何抗Tpo抗體會是實際上的Tpo交換環結合物。因為許多已知的細胞因子和生長因子是具有高度可變環結構的四螺旋束蛋白質，可利用替代四螺旋束支架(諸如Epo)來展示來自已知的四螺旋束蛋白質的環的文庫。此方法能夠對針對所有已知的四螺旋束蛋白質的抗體進行容易的和定向的抗體選擇。或者，可以工程化改造這些支架以含有多個環、單個或多個螺旋替代、或者甚至來自任何數目靶蛋白的環和螺旋的組合。通過延伸，可以利用可溶性和單跨度蛋白質的其它保守結構元件來呈現和指導抗體對它們在關聯超家族蛋白質內的關鍵元件的識別。實施例4:多跨超家族構象性抗原——GPCR圖l與實施例3類似，可以在替代支架上呈現靶蛋白的單一線性或不連續序列，使得所導入的序列部分或完全採用天然靶蛋白中找到的構象性元件。舉例而言，將多跨度G蛋白偶聯受體的胞外域的一部分嫁接至無關蛋白質支架。G蛋白的B1片段具有游離氨基端和近端環結構，它們分別可用來自CCR3的成熟氨基端和來自CCR3的第三胞外環替換。在先前的研究中，融合物以與全長CCR3受體類似的分級親和力結合CCR3關聯配體、嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)和突變體，雖然親和力總體降低了1000倍(Datta，ProteinSciences巻12,頁2482,ColdSpringHarborLaboratoryPress2003)。這些結果提示可;容性構建體可部分提供足夠的構象性元件以模擬受體。對於對CCR3的質量對照結合，用可溶性或噬菌體展示的嗜酸細胞活化趨化因子測試B1嵌合物。具體地，用CCR3的氨基端(胺基酸1-34)和第三胞外環(胺基酸265-281)替代氨基端的兩個胺基酸和插入G蛋白的B1域片段的環胺基酸18和19之間。接著，經過3-5輪富集，針對組合抗體文庫篩選展示在孢子表面上的此構建體。然後針對過表達CCR3的工程化哺乳動物細胞系正選擇所富集的集合。然後以重組方式表達所得的抗體克隆，純化，然後對CCR3的結合或在嗜酸細胞活化趨化因子中和測定法中進行測試。作為第二個例子，將CCR2的氨基端和第三胞外環類似地展示於B1展示支架上，並測試對中和性抗CCR2抗體1D9的反應性。具體地，用CCR2的氨基端(胺基酸1-42)和第三胞外環(胺基酸269-285)替代氨基端的兩個胺基酸和G蛋白的B1域片段的環胺基酸18和19之間。接著，經過3-5輪富集，針對組合抗體文庫篩選展示在孢子表面上的此構建體。針對過表達CCR2的工程化哺乳動物細胞系正選擇所富集的集合。純化所得的克隆，並對CCR2的結合或在MCP-1中和測定法中進行測試。孢子-噬菌體篩選如實施例1中所描述的那樣進行。重要的是，在這兩個例子中，選擇了第三胞外環，但是也可使用第一或者甚至第二胞外環代替。摻入超過一個胞外環或甚至來自這些環的近膜區的一部分可能是必需的或有利的，以便提供更多構象環境。可將類似的方法應用於具有結構基序的其它蛋白質，諸如所有的G蛋白偶聯受體(GPCR)、離子通道、以及其它多5爭度和其它可溶性或整合的多環蛋白質。實施例5:鑑定和生成構象性抗原的生物信息學方法先前的實施例描述了使用各個蛋白質或超家族以及隨機集合的方法。重要的是，隨機集合可能衍生自其呈現會由於相對表達水平而產生高度偏倚的所表達的cDNA，並且不限於蛋白質的類型或天然蛋白質上片段的易接近性。此外，在克隆隨機片段中，最好的情況也只不過僅能控制取向，但不能正確閱讀框架。因此，預期存在許多非生產性克隆，其在它們的氨基或羧基末端不形成正確的融合物。可經由生物信息學方法來解決這些方面中的一些。例如，代替如實施例l中所描述的自活化的淋巴細胞直接克隆所表達的基因片段，檢查活化的淋巴細胞中的基因表達以找到具有改變的表達性狀的感興趣基因。作為初級濾器，我們可聚焦於那些胞外的感興趣基因。接著，合成或挽救相應的cDNA,並克隆其片段，這與先前實施例中所描述的規程類似。結果，僅生成那些處於正確取向和框架以導致生產性融合物的片段。最終結果是篩選此集合僅產生針對胞外蛋白質的抗體。作為一個額外的生物信息學步驟，進一步檢查先前所描述的感興趣基因，並鑑定在這些蛋白質的外表面上找到的預測的溶劑化區域。然後可合成這些溶劑化區域，克隆入構象性支架中，並針對組合抗體文庫進行篩選。此額外步驟僅生成蛋白質的預測的暴露區域的片段，使集合對易接近表位甚至更具生產性。任一合成方法的主要優點在於根據其它相關標準(諸如基因誘導水平或時間表達)而將基因標準化或者甚至產生定製偏倚的所得能力。此方法還可用於編碼預測的胞內蛋白質的基因和分離作為胞內抗體使用的抗體。實施例6:篩選抗體抗原複合物(圖5)抗體在其可變區中經由特異性相互作用而結合抗原。由於兩種構件之任一或二者中的誘導契合，通常形成並維持穩定的結合。在抗體的情況中，已經顯示了有配體的和沒有配體的抗體在結構上是不同的。通過使用構象性表位呈現來開發此結構差異以篩選識別特性抗體-抗原複合物的抗體。在一個例子中，將抗體克隆入串聯表達質粒的第一位點中，並將關聯表位克隆入第二位點中。在極接近於抗體處放置抗原容許其起抗體的構象催化劑的作用。結果是適於複合物篩選的穩定的且系在一起的抗原-抗體複合物。另外，由於抗原結合誘導抗體中獨特的構象變化，這種穩定的呈現容許有效鑑定有配體的特定抗獨特型抗體。例如，抗c-myc抗體(9E10)可在柔性接頭[(Gly4-Ser)3]的氨基端進行表達，並連接至c-myc肽表位，其以重組方式與芽孢桿菌原毒素系在一起。針對組合噬菌體抗體文庫篩選所得孢子展示複合物以找到抗複合物抗體和抗有配體的抗獨特型抗體。這些所得抗體之任一可用作具有9E10抗體的雙特異性抗體的一條臂。組合此雙特異性抗體與經胞外裝飾的c-myc細胞會具有兩種後果。第一種是c-myc與9E10臂的"定向的"反應。第二種預期的後果是"反式"反應，其中抗獨特型臂結合9E10+c-myc蛋白複合物或另一個雙特異性抗體分子的有配體的9E10臂。此"反式"反應是漸進的反應，其一直繼續，直至在化學計量上耗盡所有的耙物。實際上，此"抗體鏈反應，，裝飾和加強抗體的結合以向靶物靶向、投遞和穩定化最大限度量的Fc。實施例7:噬菌體-噬菌體乾物-抗體選擇(圖6)在先前的實施例中，使用孢子來展示表位集合，而使用噬菌體來展示抗體選擇。還有可能使用相同的展示系統來展示兩種集合，若這兩種集合在選擇方面是物理上可區別的且在擴增方面是遺傳上可區別的。在此實施例中，第l步是在具有不同抗生素抗性(用於表位文庫的四環素抗性和用於抗體集合的氨千青黴素抗性)的質粒中表達集合。其次，給噬菌體外殼蛋白帶上表位標籤以在物理上彼此辨別離散的集合。為了這樣做，以重組方式將獨特的親和標籤融合至pVII外殼蛋白的氨基端。具體地，首先體。例如，可使用HA輔助噬菌體來生成表位文庫噬菌粒集合，而使用FLAG輔助噬菌體來生成抗體噬菌粒文庫集合。將106-107個表位文庫噬菌粒與10、10"個抗體文庫噬菌粒在lmlPBS+1%BSA中混合，並於室溫溫育2小時。接著，將經抗HA包被的蛋白A^K與混合物於4。C溫育1小時。然後用PBS+0.05%丁評6611-20清洗珠子3-5次。最後，將珠子用pH2.2甘氨酸處理10分鐘，然後用2MTris鹼中和。此步驟不可逆地解離抗體-抗原複合物，並容許它們感染大腸桿菌，並在氨千青黴素或四環素選擇下擴增。所擴增的集合含有整個表位文庫和僅生產性的抗體結合物。下一選擇步驟類似於先前的步驟，但是代替HA沉澱，進行抗FLAG沉澱。因此，此步驟除去所有未結合的表位文庫成員，並僅加強生產性的表位-抗體集合。雖然此實施例引用抗體-抗原相互作用，預期相同的方法也對任何數目或種類的相互作用性噬菌體展示集合起作用。這些可以是針對其它抗體的抗體，或者甚至是針對受體或酶的肽。還有可能用單一免疫學獨特輔助噬菌體實現類似的結果，若每輪都將標籤適當地重建給正確的表位或抗體群體。這種免疫學獨特差異可以工程化改造入輔助噬菌體外殼蛋白，或者可以天然存在於兩種不同的噬菌體外殼蛋白之間。實施例8:構象表位和抗體文庫的同時選擇在上述實施例中，使用構象性表位文庫集合來富集識別天然蛋白質或天然呈現靶物的抗體。然而，有可能用目前所述系統來進^f亍同時構象性靶物-抗體選擇。此情況中的目標是保存特定靶物-抗體配對。這僅在靶物集合展示實質上和物理上不同於抗體展示集合時是有可能的，諸如例如在靶物與不溶性孢子顆粒結合而抗體融合至可溶性絲狀噬菌體時。為了保存配對，首先將靶物集合與抗體集合混合。合適的溫育期之後，通過離心來收集孢子靶物集合，並用合適的清洗來除去未結合的噬菌體。進行清洗步驟以除去未結合的噬菌體之後，將複合的集合與單克隆抗噬菌體抗體一起溫育，然後與順磁性抗小鼠珠組合以磁性正選擇噬菌體結合的孢子。或者，可以用偶聯有螢光團的抗小鼠抗體來檢測噬菌體-孢子和抗噬菌體複合物，並可通過FACS克隆分選孢子個體。可以在合適的條件下個別地挽救配對的組合以可尋址地和獨立地挽救噬菌體，並增殖芽孢桿菌孢子。雖然在上述說明書中，參照某些實施方案闡明了本發明，但它不限於此。確實，從上述說明書看，在那些本文中所顯示和描述的之外，對本發明的各種修飾對於本領域的技術人員會變得顯而易見，並落入所附權利要求書的範圍內。在此通過提及而明確且完整地收錄整篇說明書中所引用的所有參考文獻及其中所引用的參考文獻。權利要求1.一種物理上可選擇的展示，其包含一種或多種天然或變異多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物，其中至少一些所述裝配物形成構象約束多肽靶物，並且其中至少一些所述片段不同於抗體片段。2.權利要求l的展示，其是構象性表位文庫。3.權利要求l的展示，其包含超過一種多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物。4.權利要求l的展示，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含兩種或更多種來自相同多肽的不同部分的片段，或模擬所述片段的序列。5.權利要求l的展示，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含來自不同多肽的片段，或模擬所述片段的序列。6.權利要求l的展示，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含抗體或抗體片段和所述抗體或抗體片段的配體。7.權利要求l的展示，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列是彼此直接融合的。8.權利要求l的展示，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列是由外源連接序列偶聯的。9.權利要求l的展示，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列由結構支持元件組成或包含結構支持元件。10.權利要求l的展示，其中至少一些所述構象約束多肽耙物是由於所述串聯或多聚體裝配物中所存在的所述片段或模擬序列的接近性而形成的。11.權利要求l的展示，其中至少一些所述構象約束多肽靶物是由於所述串聯或多聚體裝配物中所述結構支持元件的存在而形成的。12.權利要求ll的展示，其中所述結構支持元件是一種或多種蛋白質家族的特徵性基序。13.權利要求ll的展示，其中所述結構支持元件選自下組螺旋束、卩-片層結構、三葉結構、跨膜螺旋、和胞外環。14.權利要求l的展示，其中所述構象約束多肽靶物包含受體序列。15.權利要求14的展示，其中所述受體序列包括受體的結構基序。16.權利要求l的展示，其選自下組體內和體外展示系統。17.權利要求16的展示系統，其選自下組病毒的、真核生物的、細菌的、核糖體、mRNA、和DNA^示系統。18.權利要求17的展示，其是噬菌體展示。19.權利要求17的展示，其中所述真核生物展示系統是哺乳動物或酵母展示。20.權利要求17的展示，其中所述細菌展示系統是細菌細胞或孢子展示。21.權利要求20的展示，其中所述細菌展示系統是枯草芽孢桿菌(B""7/wS由/fc)或蘇雲金芽孑包軒菌(5ac/〃WJf/2W7'"g/e"^)孑包子展示。22.權利要求ll的展示，其中所述細菌展示系統是蘇雲金芽孢桿菌孢子展示。23.—種篩選方法，包括(a)提供物理上可選擇的展示，其包含一種或多種天然或變異多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物，其中至少一些所述裝配物形成構象約束多肽靶物，並且其中至少一些所述片段不同於抗體片l殳；(b)使所述展示與候選結合配偶體的文庫在如下條件下接觸，其中彼此具有結合親和力的構象約束多肽靶物和候選結合配偶體形成靶物-結合配偶體複合物；並(c)檢測至少一些所形成的靶物-結合配偶體複合物。24.權利要求23的方法，其進一步包括步驟(d)鑑定參與至少一些所檢測出的耙物-結合配偶體複合物形成的耙序列。25.權利要求24的方法，其中鑑定參與所有所檢測出的靶物-結合配偶體複合物形成的靶序列。26.權利要求23的方法，其中所述展示包含超過一種多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物。27.權利要求23的方法，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含兩種或更多種來自相同多肽的不同部分的序列，或模擬所述片段的序列。28.權利要求23的方法，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含來自不同多肽的片段，或模擬所述片段的序列。29.權利要求23的方法，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含抗體或抗體片段和所述抗體或抗體片段的配體。30.權利要求23的方法，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列是彼此直接融合的。31.權利要求23的方法，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列是由外源連接序列偶聯的。32.權利要求23的方法，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，所述兩種或更多種序列中的至少一些由結構支持元件組成或包含結構支持元件。33.權利要求23的方法，其中至少一些所述構象約束多肽靶物是由於所述串聯或多聚體裝配物中所存在的所述片段或模擬序列的接近性而形成的。34.權利要求23的方法，其中至少一些所述構象約束多肽靶物是由於所述串聯或多聚體裝配物中所述結構支持元件的存在而形成的。35.權利要求34的方法，其中所述結構支持元件是一種或多種蛋白質家族的特徵性基序。36.權利要求34的方法，其中所述結構支持元件選自下組螺旋束、|3-片層結構、三葉結構、跨膜螺旋、和胞外環。37.權利要求23的方法，其中所述候選結合配偶體是抗體或抗體片段。38.權利要求37的方法，其中所述抗體片段選自下組Fab、Fab，、F(ab，)2、dAb、scFv和(scFv)2片段、線性抗體、單鏈抗體分子、迷你抗體、雙抗體、和由抗體片段形成的多特異性抗體。39.權利要求38的方法，其中所述抗體片段是scFv片段。40.權利要求37的方法,其中所述抗體或抗體片段是抗體文庫的一部分。41.權利要求23的方法，其中所述候選結合蛋白是抗體模擬物。42.權利要求41的方法，其中所述抗體模擬物是親和體或適體。43.權利要求23的方法，其中所述物理上可選擇的展示是體內或體外展示系統。44.權利要求43的方法，其中所述物理上可選擇的展示選自下組病毒的、真核生物的、細菌的、核糖體、mRNA、和DNM示系統。45.權利要求44的方法，其中所述展示系統是噬菌體展示。46.權利要求44的方法，其中所述真核生物展示系統是哺乳動物或酵母展示。47.權利要求44的方法，其中所述細菌展示系統是細菌細胞或孢子展示。48.權利要求47的方法，其中所述細菌展示系統是枯草芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌孢子展示。49.權利要求40的方法，其中所述抗體文庫是展示的。50.權利要求49的方法，其中所述抗體展示是體內或體外展示系統。51.權利要求49的方法，其中所述抗體展示選自下組病毒的、真核生物的和細菌的展示系統。52.權利要求51的方法，其中所述展示系統是噬菌體展示。53.權利要求51的方法，其中所述真核生物展示系統是哺乳動物或酵母展示。54.權利要求51的方法，其中所述細菌展示系統是細菌細胞或孢子展示。55.權利要求54的方法，其中所述細菌展示系統是枯草芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌孢子展示。56.權利要求49的方法，其中所述抗體文庫是噬菌體文庫，而所述物理上可選擇的展示是孢子展示或噬菌體展示。57.權利要求56的方法，其中所述孢子展示是蘇雲金芽孢桿菌孢子展示。58.權利要求23的方法，其中所述構象約束多肽靶物包含受體序列。59.權利要求58的方法，其中所述結合配偶體是所述受體的配體候選物。60.權利要求59的方法，其中所述受體序列包括所述受體的結構基序。61.權利要求38的方法，其中另外鑑定參與至少一些所述靶物-結合配偶體複合物形成的抗體或抗體片段序列。62.權利要求61的方法，其進一步包括在步驟(d)之前富集和分開參與至少一些所述耙物-結合配偶體複合物形成的耙序列和抗體序列的步驟。63.權利要求62的方法，其進一步包括在富集和分開之後且在步-驟(d)之前獨立地回收參與至少一些所述靶物-結合配偶體複合物形成的靶序列和抗體序列的步驟。64.權利要求38的方法，其中參與至少一些所述靶物-結合配偶體複合物形成的把序列是構象性表位的一部分。65.—種方法，包括(a)提供物理上可選擇的展示，其包含一種或多種天然或變異多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物，其中至少一些所述裝配物形成構象性表位；(b)使所述展示與抗體文庫在如下條件下接觸，其中彼此具有結合親和力的構象性表位和抗體文庫成員形成構象性表位-抗體複合物；並(c)檢測至少一些所形成的構象性表位-抗體複合物。66.權利要求65的方法，其進一步包括步驟(d)鑑定參與至少一些所檢測出的構象性表位-抗體複合物形成的構象性表位和抗體序列。67.權利要求66的方法，其中檢測所有所形成的構象性表位-抗體複合物。68.權利要求67的方法，其中鑑定參與所有所檢測出的靶物-結合配偶體複合物形成的構象性表位序列。69.權利要求65的方法，其中所述展示包含超過一種多肽的離散或隨機片段的串聯或多聚體裝配物，或模擬所述片段的序列的串聯或多聚體裝配物。70.權利要求65的方法，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含來自相同多肽的不同部分的片段，或模擬所述片段的序列。71.權利要求65的方法，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含來自不同多肽的片段，或模擬所述片段的序列。72.權利要求71的方法，其中至少一些所述串聯或多聚體裝配物包含抗體或抗體片段和所述抗體或抗體片段的配體。73.權利要求65的方法，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列是彼此直接融合的。74.權利要求65的方法，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列是由外源連接序列偶聯的。75.權利要求65的方法，其中在所述串聯或多聚體裝配物中，至少一些所述片段或序列由結構支持元件組成或包含結構支持元件。76.權利要求65的方法，其中至少一些所述構象性表位是由於所述串聯或多聚體裝配物中所存在的所述片段或模擬序列的接近性而形成的。77.權利要求65的方法，其中至少一些所述構象性表位是由於所述串聯或多聚體裝配物中所述結構支持元件的存在而形成的。78.權利要求77的方法，其中所述結構支持元件是一種或多種蛋白質家族的特徵性基序。79.權利要求77的方法，其中所述結構支持元件選自下組螺旋束、卩-片層結構、三葉結構、跨膜螺旋、和胞外環。80.權利要求65的方法，其中所述抗體文庫包含抗體片段。81.權利要求80的方法，其中所述抗體片段選自下組Fab、Fab，、F(ab，)2、dAb、scFv、和(scFv)2片段、線性抗體、單鏈抗體分子、迷你抗體、雙抗體、和由抗體片段形成的多特異性抗體。82.權利要求81的方法，其中所述抗體片段是scFv片段。83.權利要求65的方法，其中所述物理上可選擇的展示是細菌細胞或孢子展示。84.權利要求83的方法，其中所述細菌展示系統是枯草芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌孢子展示。85.權利要求65的方法，其中所述抗體文庫是噬菌體文庫，而所述物理上可選擇的展示是孢子展示或噬菌體展示。86.權利要求85的方法，其中所述孢子展示是蘇雲金芽孢桿菌孢子展示。87.權利要求65的方法，其中所述構象性表位是通過基因片段的串聯或多聚體裝配物的表達而獲得的。88.權利要求87的方法，其中所述基因片段起源自靶定的生物學有關來源。89.權利要求88的方法，其中所述靶定的生物學有關來源選自下組細胞、組織、器官和生物體。90.權利要求89的方法，其中所述靶定的生物學有關來源選自下組幹細胞、活化的免疫細胞、患病的組織、器官和病理性生物體。91.權利要求88的方法，其中通過分析所靶定的生物學有關來源中的基因表達數據來鑑定至少一些所述基因片段。92.—種核酸分子，其包含由編碼肽接頭的核苷酸序列分開的編碼抗體或抗體片段和所述抗體或抗體片段的配體的核苷*列。93.—種載體，其包含權利要求92的核酸分子。94.經權利要求93的載體轉化的宿主細胞。95.權利要求94的宿主細胞，其是真核生物的或原核生物的宿主細胞。96.權利要求95的宿主細胞，其是細菌、哺乳動物或酵母細胞。97.權利要求95的宿主細胞，其是大腸桿菌細胞。全文摘要本發明涉及構象約束多肽序列的組合文庫及其用途。具體地，本發明涉及構象性表位的組合文庫及其用途。文檔編號C12N15/10GK101622347SQ200880006994公開日2010年1月6日申請日期2008年1月11日優先權日2007年1月12日發明者勞倫斯·霍羅威茨,拉梅什·R·巴特申請人:航道生物技術有限責任公司