豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR鑑別檢測試劑盒及其生產方法

2023-11-04 02:11:47

專利名稱：：豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR鑑別檢測試劑盒及其生產方法
技術領域：
：本發明所涉及的豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR鑑別檢測試劑盒及其生產方法，屬於獸醫微生物學領域動物病毒學技術。
背景技術：
：豬癌(ClassicalSwineFever，CSF)是由豬癌病毒(ClassicalSwineFevervirus,CSFV)引起的豬的高度致死性、接觸性傳染病，其特徵是小血管壁的變性，導致內臟器官中的多發性出血、壞死和梗死(殷震，劉景華.動物病毒學.第二版.北京科學出版社，1997,645-664)。根據OIE制定的《陸生動物衛生法典》2006年版，CSF被列為必須報告的疫病之一，在我國被列為「二類動物疫病」，經濟損失嚴重。目前臨床上CSF在流行特點、臨床表現和病理變化等方面表現出非典型性的特徵，同時存在著與其它病混合感染的狀況。因此對其診斷非常困難(周緒斌，王新平，宣華，塗長春.鑑別牛病毒性腹瀉黏膜病毒和CSFV複合PCR方法及其應用.中國獸醫學報，2002，22(6)173-179)，必須依賴實驗室診斷才能確診。由於CSFV在細胞內繁殖滴度較低，並且不產生肉眼可見的病變，致使從病原學角度的診斷技術研究很困難；且豬瘟病毒只有一個血清型，致使無法從血清學角度區別感染群和免疫群，目前CSF的各種不太成熟的試劑盒通常存在靈敏度較低、特異性差、耗時等問題。自2009年豬瘟已被國家納入強制免疫動物疫病目錄，對疫苗免疫豬和自然感染豬的鑑別診斷具有十分重要的意義(Van0irschot，J.Τ.Vaccinologyofclassicalswinefever:fromlabtofield.VeterinaryofMicrobiology.2003,96:367_384.),但是目前尚沒有成熟的方法或試劑盒能鑑別檢測豬瘟兔化弱毒疫苗免疫群和野毒感染群。目前常見的CSF病原學診斷技術主要有病毒分離法、免疫螢光技術、兔體交互免疫試驗、ELISA抗原捕獲法、RT-PCR技術和實驗動物法等。豬瘟病毒分離技術(HaegemanA，DewulfJ,VranckenR,TignonΜ,RibbensS,KoenenF.CharacterisationofthediscrepancybetweenPCRandvirusisolationinrelationtoclassicalswinefevervirusdetection.JournalofVirologicalMethods.2006,136:44_50)是豬癌診斷的金標準，敏感，但檢測周期長、費力、需實驗設施，不適合全群普查；豬瘟免疫螢光技術又可分為直接免疫螢光和間接免疫螢光，應用螢光標記的一抗或二抗對組織切片進行染色觀察，以檢測是否有CSFV感染。免疫螢光法是目前檢測CSF病原的法定方法，但該法需要有經驗的試驗人員，該技術經驗性較強，在製片特別是組織切片過程中難度大，耗時長。組織抹片的製作也可能由於選定的樣品為非病灶區而漏檢。因而該方法也受到一定程度的限制；實驗動物法用敏感仔豬進行接種試驗或用兔體交互免疫試驗進行病原的鑑定，此法可用來鑑別豬瘟兔化弱毒疫苗毒和野毒感染，但該法需在有條件的實驗室進行，而且費時；抗原捕獲ELISA法(D印nerK,PatonDJ,CruciereC,DeMiaGM,MullerA,KoenenF,StarkR,LiessB.Evaluationoftheenzyme—1inkedimmunosorbentassayfortherapidscreeninganddetectionofclassicalswinefevervirusantigensinthebloodofpigs.RevueScientifiqueetTechnique.1995,14(3):677_689.)利用雙抗夾心法或競爭法捕獲CSFV於酶標板上，然後利用辣根過氧化物酶標記的二抗進行顯色，根據吸光值的高低來判斷有無CSFV，目前這種試劑盒主要靠進口，價格昂貴，而且敏感度較氐；RT-PCR技術(HandelK，KehlerH，HillsK，PasickJ.Comparisonofreversetranscriptase-polymerasechainreaction,virusisolation,andimmunoperoxidaseassaysfordetectingpigsinfectedwithlow,moderate，andhighvirulentstrainsofclassicalswinefevervirus.JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation.2004,16(2):132_138.)隨著分子生物學的發展，越來越多的學者應用反轉錄PCR(RT-PCR)和反轉錄套式PCR(RT-Npcr)對CSFV成功進行了擴增。雖然該法具有操作簡便，快速，特異性強等優點，但RT-nPCR要經過反轉錄、PCR、二次PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，大量檢測時易造成氣溶膠汙染，不利於實驗室快速檢測。上述各種方法及其不太成熟的試劑盒通常存在靈敏度較低、特異性差、耗時、無法區分免疫群與感染群等諸多問題。因此開發豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR鑑別檢測技術對於豬瘟病原的鑑別檢測具有十分重要的意義。本發明的目的是利用TaqMan-MGB螢光定量PCR技術，建立豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR快速鑑別檢測技術，從而製備用於CSFV快速鑑別檢測的試劑盒。
發明內容一、本發明的主要技術原理實時螢光定量聚合酶鏈式反應(Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction,RQ-PCR)技術是20世紀90年代中期發展起來的一種新型核酸定量技術(Heid，C.A.,etal.,RealtimequantitativePCR.[J].GenomeRes,1996.6(10)986-94.技術是通過始點定量和螢光檢測系統實時監測累積螢光強度而實現的，它可以採用絕對定量和相對定量兩種方式實現定量檢測。實時螢光定量PCR(RQ-PCR)技術包括探針類和染料類兩種(Wittwer，C.Τ.，etal.，ContinuousfluorescencemonitoringofrapidcycleDNAamplification.Biotechniques,1997.22(1)=130-1,134-8)。探針類是利用與模板特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，以TaqManTM技術為代表，常用的螢光基團是FAM，TET，VIC，HEX；染料類是應用一種能與雙鏈DNA小溝結合的螢光染料，螢光信號強弱與雙鏈DNA的數量相關，可以根據螢光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量，常用的是SYBRGreenI染料。實時螢光PCR技術常用TaciMan技術(Heid，C.Α.，etal.，RealtimequantitativePCR.GenomeRes,1996.6(10)986-94.),^ΗPerkinElmer它在PCR擴增體系中加入一條20多bp的特異螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記上螢光發射基團(R)和淬滅基團(Q)，在PCR反應中設立標準模板系列對照反應管和陰性對照管，在PCR擴增的退火或延伸步驟中檢測螢光信號的變化，得出實時螢光定量PCR(RQ-PCR)的動力學曲線圖。探針完整時，兩者發生螢光共振能量轉移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET)，R基團發射的螢光信號被Q基團淬滅；PCR擴增進行時，Taq酶發揮5'-3'外切酶活性，將探針降解，R基團與Q基團分離，Q基團淬滅作用隨即消失，R基團釋放螢光信號，被螢光監測系統接收，即每完成一次擴增，就有一個螢光信號累積，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步(Hiyoshi，M.andHosoiS.，AssayofDNAdenaturationbypolymerasechainreaction-drivenfluorescentlabelincorporationandfluorescenceresonanceenergytransfer.AnalBiochem,1994.221(2):306_11；Holland,P.Μ.,etal.,Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5'-3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase.ProcNatlAcadSciUSA,1991.88(16)7276-80.)。其工作原理見圖1。TaqManMGB探針(TaqManMinorGrooveBinderprobe)(Decaro,N.,etal.,Aminorgroovebinderprobereal-timePCRassayfordiscriminationbetweentype2-basedvaccinesandfieldstrainsofcanineparvovirus.JVirolMethods,2006.136(1-2)65-70)與普通TaqMan水解探針不同之處在於TaqManMGB探針的3』端連接一個不發螢光的Q基團和一個特殊的小溝結合子(MinorGrooveBinder)，這種特殊的設計賦予了MGB探針三大優勢一是顯著提高Tm值，這樣可以減少探針設計長度，對AT富含區的探針設計更為有利；二是可以降低背景螢光信號，提高信噪比，使實驗結果更精確，解析度更高；三是提高了探針與互補模板的結合特異性，即使一個鹼基的不匹配都能精確分辨。該方法已經廣泛用於等位基因鑑定、單核苷酸多態性分析、定點突變檢測等。其工作原理見圖2。計算樣品的CT值就可以確定樣品的起始模板量。CT值是指樣品管的螢光信號達到某一固定閾值的PCR反應循環數，閾值是由所選定作為基線的各個循環數的ARn值的平均數加上其標準差所得的數值決定。PCR循環在到達CT值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期，此時微小誤差尚未放大，因此CT值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的CT值是恆定的。根據CT值與初始模板濃度的對數呈線性關係，利用標準品10倍梯度稀釋繪製出標準曲線，見圖3。利用各樣品的CT值即可計算樣品的起初模板量。二、本發明的詳細描述1.MGB探針和引物的設計對GenBank公布的豬瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和綿羊邊界病病毒(BDV)全序列進行綜合比對，發現在其5'端非編碼區的137位存在一個A/GSNP位點，即豬瘟兔化弱毒疫苗病毒株在該位點為A，而其它野毒株和其他疫苗株該位點為G，利用PrimerExpress2.O軟體，針對該位點設計了豬瘟病毒野毒株特異的MGB探針，並在兩端保守區設計了一套通用引物，命名為上遊引物MGB-F、下遊引物MGB-R、探針MGB-P，序列如下MGB-F:5，-CATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA-3，MGB-R:5，-GAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA-3，MGB-P:5，-FAM-CTAGCCGTAGTGGCGA-MGB-3，其中FAM為羧基螢光素；MGB為小溝結合子。2.陽性對照的製備陽性對照採用豬瘟石門標準毒株(SM)特異克隆其非編碼區約300bp的片段體外逆轉錄獲得，濃度為(0.1260.368μg/10μL)。製備方法如下(1)目的片段擴增採用SNP-F:GACGGCCGAACTGGGCTA；SNP-RATTCAACTCCATGTGCCATGAA作為引物，按常規RT-PCR反應體系配成RT-PCR反應液，加入陽性SMRNA模板，用PCR擴增儀進行擴增，得到大量目的片段，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離擴增產物，紫外顯像可見一條分子量大小為307bp的特異條帶(見序列6)，且無非特異性擴增條帶，證明擴增成功，在亮帶部位切下PCR凝膠產物保存備用。(2)純化目的片段採用的GelExtractionKit試劑盒純化上述PCR凝膠產物中的目的核酸片段，再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對純化的擴增產物進行粗略定量。(3)連接與轉化反應按pGM-TEasy連接試劑盒說明，進行PCR純化產物與T載體的連接反應，構建含目的片段質粒。將上述連接產物轉化入T0P10感受態細胞，然後將轉化的感受態細胞塗於加有40μLX-Gal(20mg/mL)禾口8μLIPTG(200μg/mL)的瓊脂平板，37°C培養1216h。(4)克隆菌落的擴大培養與鑑定培養後平板上長出藍色和白色菌落，挑取飽滿、表面清亮的單個白色菌落接種於含有氨苄抗性的5mlLB培養基中，每個菌落都記錄編號，37°C、180r/min搖床培養1216h。應用PlasmidMiniKitI質料提取試劑盒對每個菌落的培養菌液進行質料的提取，並對質粒進行測序鑑定。(5)體外轉錄以鑑定後的陽性質料為模板，按Promega公司的RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7試劑盒說明進行標準陽性質粒的體外轉錄。(6)轉錄後處理1)力卩RQlRNase-FreeDNase至終濃度為1μ/μg模板DNA，37°C放置15min。2)用1倍體積的TE飽和苯酚(pH4.5)氯仿異戊醇=25241抽提，渦旋lmin,12000r/min離心2min。3)將上層水相轉入一個新的離心管中，加1倍體積的氯仿異戊醇=241，渦旋lmin,12000r/min離心2min。4)將上層水相轉入一個新的離心管中，加1倍體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和1倍體積的異丙醇或2.5倍體積的95%乙醇，混勻置於冰上25min，12000r/min離心lOmin。5)輕輕棄去或吸出上清，用Iml的70%乙醇清洗離心管，真空環境下乾燥離心管中的RNA，並用TE緩衝液重懸RNA，保存在_70°C。(7)轉錄後鑑定與檢驗經體外轉錄製備的RNA用IXTE緩衝液(IOmMTris-HCl,ρΗ8·5，ImMEDTA)按1100到1300稀釋，用紫外分光光度計測定OD26tZOD28tl比值(0D26C1/0D28C1=1.92.1之間說明所得的RNA純度較高，比值若低於1.9可能有蛋白汙染，若高於2.1則可能RNA已降解)及OD26tl的值(IOD26tl相當於大約40ug/mlRNA)，鑑定合格的即可用作陽性標準品原液。將陽性標準品原液用DEPC水進行10倍梯度稀釋，得到多個梯度的稀釋液，各個梯度的稀釋液用試劑盒CSFVTaqMan-MGBPCR檢測試劑進行CT值標定，取CT值在15.0-20.0的稀釋液作為試劑盒的強陽性對照，取CT值在35.0左右的稀釋液作為試劑盒的弱陽性對照。3.質控樣本及陰性對照的信息質控樣本菌、毒株及細胞見表1，試驗用豬瘟兔化弱毒疫苗信息見表2。表1質控菌、毒株及細胞背景信息tableseeoriginaldocumentpage74.陰性對照背景信息採用無特異性病原(SPF)豬扁桃體或頌下淋巴結、腸繫膜淋巴結，按15倍體積加入磷酸鹽緩衝液(PBS)液，於研缽或組織勻漿器中充分研磨，然後3000r/min離心lOmin，取上清液轉入離心管中備用。4)用於陰性對照及質控樣本RNA的製備。(1)取1.5mLEppendorf管，每管加入500μLTrizol，分別加入被檢樣品，一份樣品換一個吸頭，充分混勻，靜置5min；再加入200μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s(不能過於強烈，以免產生乳化層，也可以用手顛倒混勻)。於4°C、12000r/min離心15min。(2)取1.5mLEppendorf管，加入500μL異丙醇(4°C預冷)，做標記。取1)中的上清約500μL(注意不要吸出中間層)轉移至相應的管中，顛倒混勻，4°C靜置20min。(3)於4°C、12000r/min離心15min，小心倒去上清，倒置於吸水紙上，沾幹液體，加入600μL75%乙醇，顛倒洗滌。(4)4°C、12000g離心lOmin，小心倒去上清，倒置於吸水紙上，儘量沾幹液體。(5)4000r/min離心10s，將管壁殘液甩到管底，用微量加樣器小心吸乾，一種樣品換用一個吸頭，室溫乾燥3lOmin。(6)加入25μLDEPC水輕輕混勻，溶解RNA，冰上保存備用。提取的RNA須在2h內進行PCR擴增；若需長期保存須放置-70°C冰箱。5.試齊[JTrizol裂解試劑(TrizolRegeant,200mL/瓶)、SuperScriptIII(200U/μL)反轉錄酶(SuperScriptIIIReverseTranscriptase)購自Invitrogen公司；TaqHSDNA聚合酶(5U/μL)、10XPCR緩衝液(PCRBuffer,pH8.3Tris-HCl,IOOmM；KCl,500mM；MgCl2,15mM)、dNTP混合液(dNTPMixture,2.5mM/每種)購自寶生物工程(大連)有限公司；TaqManMGB探針和引物由上海基康生物技術有限公司合成。6.TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR反應體系的建立以CSFVSM株病毒作為模板進行TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR，經過對SSIII反轉錄酶、TaqHSDNA聚合酶(TaqHSDNAPolymerase)、上下遊引物、探針和反應體系的逐步優化。最終選用的反應體系見表1。表3CSFVTaqMan-MGBPCR反應體系組分~""「"「「~~~一~「「~~i*TiL)「IOxPCRBuffer5dNTPMixture(2.5μΜeach)1.6SSIIIReverseTranscriptase(200υ/μ)0.3TaqHSDNAPolymerase(5υ/μ)0.5MGB-F(ΙΟμΜ)3MGB-R(ΙΟμΜ)3MGB-P(5μΜ)1.6RNASolution10ddH2Q25儀器螢光PCR檢測儀(ABI7500螢光定量PCR儀，美國應用生物系統(ABI)公司廣品)O反應條件:50°C,20min；94°C,4min；88°C，8s；60°C,35s,40個循環。每個循環在60°C時採集一次MGB探針釋放的螢光信號。三、試劑盒生產組裝及應用1.試劑盒生產組裝(1)對照品及水陽性和弱陽性對照採用豬瘟石門標準毒株(SM)特異克隆其非編碼區約300bp的片段體外逆轉錄獲得特異RNA，含量分別為(陽性對照0.1260.368yg/10yL)和(弱陽性對照0.0130.037μg/10μL)，300μL/管分裝，各2管，-20°C凍存備用。製備方法見附件。陰性對照採用無特異性病原(SPF)豬的扁桃體或頌下淋巴結、腸繫膜淋巴結，按15倍體積加入0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水，於組織勻漿器中充分研磨，然後30001·/min離心lOmin，取上清液轉入離心管中，分裝成200μL/管，共10管，_20°C凍存備用。焦碳酸二乙酯(DEPC)水20mL/瓶。(2)試劑Trizol裂解液40mL/瓶，分裝至棕色瓶中，4°C存放備用。TaqMan-MGBPCR反應液每個反應包括IOXPCRBuffer5μL、dNTPMixture(2.5μMeach)1·6μL,MGB-F(10μΜ)3μL,MGB-R(10μΜ)3μL，共12.6μL。50個反應共計630μL，分裝成2管(365μL/管，有50μL富餘)。反應酶每個反應包括SSIII反轉錄酶0.3yL、TaqHSDNA聚合酶0.5μL，共0.8μ。50個反應共計45yL(有5yL富餘)，分裝成1管。探針溶液用0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水稀釋成5μM，每個反應需1.6μL。50個反應共計90μL(有10μL富餘)，分裝成1管，-20°c凍存備用。(3)試劑盒組裝(以48頭份計)取上述陽性對照和弱陽性對照各2管，陰性對照10管，TaqMan-MGBPCR反應液2管、反應酶1管、探針溶液1管、Trizol1瓶(40ml)，0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水1瓶(20ml)，正放於試劑盒中；8聯PCR反應管及管蓋6排。2試劑盒的相關試驗(1)特異性試驗採用本發明人按本發明提供的方法製備的20080801、20080802、20080803三個批號的CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測試劑盒反應液，分別取質控樣本200μL提取RNA，按優化後的體系和循環條件，進行TaqMan-MGBPCR反應，檢測其特異性。同時採用5個不同廠家的6批次豬瘟兔化弱毒疫苗株作有效性檢測。檢測結果顯示，17個CSFV質控株檢測均為陽性，HCLV株檢測陰性，12個非CSFV病原檢測均為陰性，ΡΚ15細胞對照檢測陰性。證實該方法具有很好的特異性，且能鑑別豬瘟兔化弱毒疫苗株與其它CSFV株。(2)靈敏度試驗200μLSM血毒提取RNA，紫外分光光度計(NanoDropND-1000)測定OD26tl、OD26tl/OD280,換算成濃度為64ng/μL，10—1到10_1Q梯度稀釋後，同時進行FQ-PCR和RT_nPCR反應(TuCC,etal..PhylogeneticcomparisonofclassicalswinefevervirusinChina.VirusResearch.2001，(81)29-37)，檢測其靈敏度。表4CSFVRT-nPCR和TaciMan-MGBPCR產物測序結果_測序梯度RT-nPCRTaqMan-MGBPCR值「IO"1++13.52IO"2++16.86IO"3++20.28IO4++23.67IO"5++27.07IO"6++30.44IO"7++34.02IO"8—+37.38IO"9—-37.98IO"10-一.39.77注『『+」表示測序結果陽性；『『_」表示測序結果陰性由CT值可知ICT110_8間的CT值與模板拷貝數的對數呈線性關係，相鄰兩個模板濃度間的CT值相差約3.3，與理論上計算的模板濃度相差10倍，CT值相差3.3相符，RT-nPCR檢測10"，由此TaqMan-MGBPCR比常規RT_nPCR的靈敏度高出10倍。(3)重複性試驗採用20080801、20080802、20080803共3批CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測試劑盒試劑，對30個質控樣本，採用MeDiProSuperSystem-32核酸提取儀，嚴格按照其操作說明進行RNA提取，溶於100μL0.焦磷酸二乙酯(DEPC)水，37°C放置20min，待其充分溶解，每個反應取10μL，按優化好的反應體系和循環條件進行CSFVTaqMan-MGBPCR反應，每個樣本做9個重複。檢測結果參數統一設定為315cycle基線(Baseline)，2000閾值(Threshold)0根據CT值計算試劑盒三批試劑批間、批內變異係數(CV)。結果顯示20080801批試劑對30個質控樣本的檢測CT值變異係數為1.04%5.88%；20080802批試劑對30個質控樣本的檢測CT值變異係數為1.06%7.23%；20080803批試劑對30個質控樣本的檢測CT值變異係數為0.75%9.93%，說明三批試劑具有很好的批內重複性；同時，20080801,20080802,20080803批試劑對30個質控樣本的檢測CT值變異係數為0.60%5.71%，均小於10%，說明20080801,20080802,20080803這3批試劑具有很好的批間可重複性。(4)穩定性試驗分別使用CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測試劑盒的20080801、20080802、20080803批試劑對30個質控樣本進行檢測，每個月1次，每批試劑做3個重複，持續5個月，檢測該CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測試劑盒的穩定性。結果顯示，批號20080801、20080802、20080803的3批CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測試劑盒對30個質控樣本的5個月的CT值變化不大，說明該CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測試劑盒在5個月內具有很好的穩定性。(5)符合性試驗本研究採用CSFVRT-nPCR方法作為CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測方法的符合參比，對122份臨床樣本RNA同時進行CSFVTaqMan-MGBPCR禾口CSFVRT-nPCR檢測，結果CSFVTaqMan-MGBPCR與RT-nPCR符合率為94.3%。(6)臨床檢測對河北、湖南、北京、福建、山東、江西、四川7個省市的925份臨床樣本採用CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測試劑盒進行CSFV檢測，同時以RT_nPCR作為符合。對925份臨床樣本檢測，MGB螢光定量PCR檢出101份，陽性率為10.9%；RT-nPCR檢出40份，陽性率為4.3%。符合率為92.8%(858/925)。說明兩種方法符合率較高。3.試劑盒的應用(1)樣品前處理及存放1)血液樣品每個反應取200μL全血提取RNA。2)組織臟器取待檢樣品50IOOmg於潔淨、滅菌並烘乾的研缽中充分研磨，加ImL0.1%焦磷酸二乙酯(DEPC)水混勻，4°C，3000r/min離心15min，取200μL上清液轉入無菌的1.5mLEppendorf管中，編號備用。3)細胞培養物每個反應取200μL細胞培養物提取RNA。製備的樣本在2°C8°C條件下保存應不超過24h，若需長期保存應置-70°C以下，但應避免反覆凍融(凍融不超過3次)。(2)待檢樣品RNA的製備1)取1.5mLEppendorf管，每管加入500μLTrizol，分別加入被檢樣品，一份樣品換一個吸頭，充分混勻，靜置5min；再加入200μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s(不能過於強烈，以免產生乳化層，也可以用手顛倒混勻)。於4°C、12000r/min離心15min。2)取1.5mLEppendorf管，加入500μL異丙醇(4°C預冷)，做標記。取1)中的上清約500μL(注意不要吸出中間層)轉移至相應的管中，顛倒混勻，4°C靜置20min。3)於4°C、12000r/min離心15min，小心倒去上清，倒置於吸水紙上，沾幹液體，力口入600yL75%乙醇，顛倒洗滌。4)40C、12000g離心lOmin，小心倒去上清，倒置於吸水紙上，儘量沾幹液體。5)4000r/min離心10s，將管壁殘液甩到管底，用微量加樣器小心吸乾，一種樣品換用一個吸頭，室溫乾燥3lOmin。6)加入25μLDEPC水輕輕混勻，溶解RNA，冰上保存備用。提取的RNA須在2h內進行PCR擴增；若需長期保存須放置-70°C冰箱。(3)擴增試劑準備在反應混合物配製區進行。從試劑盒中取出豬瘟病毒TaqMan-MGBPCR反應液、反應酶和探針溶液，在室溫下融化後，2000r/min離心5s。設需PCR數為n，其中η為待檢樣品數X重複數、1管陽性對照、1管弱陽性對照及1管陰性對照之和，每個樣本測試反應體系配製見表3。表5反應體系配製表formulaseeoriginaldocumentpage12反/k酶0.8從探針溶液1.6μι合計15.0μΙ>(4)加樣在樣本處理區進行。在各設定的螢光RT-PCR管中分別加入上述待檢樣品RNA的製備中製備的10μLRNA溶液，補水至50μL蓋緊管蓋。陽性對照和弱陽性對照管中分別加入IOL陽性對照和弱陽性對照，補水至50μL。(5)TaqMan-MGBPCR檢測在檢測區進行。將上述PCR管放入螢光PCR檢測儀(ΑΒΙ7500螢光定量PCR儀，美國應用生物系統(ABI)公司產品)內，記錄樣本擺放順序。循環條件設置第一階段，反轉錄50°C/20min；第二階段，預變性94°C/4min；第三階段，88°C/8s,60°C/35s，40個循環，60°C採集螢光信號。試驗檢測結束後，由檢測儀上根據採集的動態螢光信號曲線和CT值綜合判定結^ο(6)結果判定1)結果分析條件設定直接讀取檢測結果。閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。2)質控標準陰性對照無CT值並且無擴增曲線。陽性對照CT值應在15.020.0、弱陽性對照CT值應在35.0左右並出現典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。3)結果描述及判定①陰性無CT值並且無典型的擴增曲線，表示樣品中無豬瘟病毒。②陽性CT值35且出現典型的擴增曲線的樣本建議重做。重做結果出現CT值(35和典型的擴增曲線者為陽性，否則為陰性。圖ITaqMan螢光定量PCR工作原理在PCR反應退火過程中，探針(5『標記螢光基團，3'端標記淬滅基團)先於上下遊引物和模板互補結合，引物在聚合酶作用下由5'-3'進行新生鏈合成，合成過程中探針被聚合酶5'-3'外切酶活性降解，3'端淬滅基團失去對5'螢光基團的淬滅作用，釋放出特定波長的螢光信號，該信號被檢測系統實時監測，從而實現對PCR擴增的全程監控。圖2TaqManMGB探針工作原理MGB探針的5'標記一個螢光報告基團，3』端連接一個不發螢光的淬滅基團和一個特殊的小溝結合子，這種特殊的設計使得MGB探針與模板的結合特異性更高，探針序列必須與模板序列完全互補匹配才能與之退火結合，引發聚合酶介導的探針降解，釋放螢光，檢測系統檢測到信號；但如果有一個鹼基不匹配，MGB探針就不能和模板互補結合，不能引發聚合酶介導的探針降解，不能釋放螢光，檢測系統檢測不到螢光信號。圖3標準品10倍梯度稀釋繪製出標準曲線利用本發明製備的體外轉錄的RNA標準品，進行8個梯度的10倍系列稀釋，按本發明的反應體系進行檢測，由ABI7500軟體作出標準曲線，橫坐標為起始模板拷貝數的對數值，縱坐標為CT值，曲線斜率為-3.339，線性相關係數為0.998。圖4本發明的技術路線圖510倍梯度稀釋的CSFVRNART-nPCR(A)和TaciMan-MGBPCR擴增(B)將本發明的體外轉錄的RNA標準品進行8個梯度的10倍系列稀釋，同時進行RT-nPCR檢測和螢光定量檢測，A為RT-nPCR方法的檢測結果，B為螢光定量的檢測結果，圖5-1中17泳道出現條帶，說明該方法可以檢測到10_7梯度；而圖5-2在10_8梯度曲線還有螢光信號，說明本發明的螢光定量PCR方法能檢測到10_8梯度，證實本發明的螢光定量PCR方法檢測靈敏度比RT-nPCR高一個數量級。本發明的優點根據GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV(BarbaraΕ,WilliamS.D.,DavidJL，，DISEASEOFSWINE..I.S.U.Press.Vol.8Th.1999=AMES,IOffAU.S.A)全序列進行綜合比對，發現在豬瘟病毒基因組5'端非編碼區的137位存在一個A/GSNP位點，即豬瘟兔化弱毒疫苗株在該位點位A，而其它豬瘟毒株該位點為G，利用PrimerExpress2.0軟體，針對該位點設計了野毒株特異的MGB探針，並在兩端保守區設計了一套通用引物，經過反轉錄酶濃度、DNA聚合酶濃度、上下遊引物濃度和探針濃度的進一步優化，建立了CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測方法。靈敏度試驗結果顯示，該方法與RT-nPCR符合率為94.3%，且靈敏度比RT-nPCR敏感10倍；特異性試驗結果顯示，17個CSFV質控株檢測均為陽性，HCLV株和12個非CSFV病原檢出率均為零，說明該方法具有很強的CSFV特異性，且能鑑別HCLV和其他豬瘟毒株。從反應時間和試驗成本等方面都體現了TaqMan-MGBPCR鑑別檢測CSFV的優越性。本發明的優點，可以歸納為1)特異性好=TaqMan-MGBPCR定量技術通過MGB探針的單突變特異性對CSFV核酸的SNP位點行甄別，達到鑑別檢測豬瘟野毒的目的，準確性高，同時靶序列由特異引物和探針雙重控制，特異性好，假陽性低。而對疫苗毒不予檢測，從而達到在野毒檢測中排除疫苗免疫的幹擾；2)靈敏度高反應過程由螢光檢測系統實時監控，螢光檢測系統對螢光信號具有很靈敏的檢測能力；3)線性關係好由於螢光信號的強弱與模板擴增產物的對數呈線性關係，通過螢光信號的檢測可以直接對樣品初始模板濃度進行定量；4)操作簡單自動化程度高，TaqMan技術對模板的擴增和檢測在閉管的情況下一步完成，不需要開蓋，對環境汙染機會少；5)沒有後處理過程不用雜交、電泳、拍照等過程。序列表中國獸醫藥品監察所豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-CR鑑別檢測試劑盒及其生產方法6124DNA人工序列對人工序列的描述本發明所設計和使用的上遊引物MGB-F。1CATGCCCACAGTAGGACTAGCAAA24227DNA人工序列對人工序列的描述本發明所設計和使用的下遊引物MGB-R。2GAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA27316DNA人工序列對人工序列的描述本發明所設計和使用的探針MGB-P。3CTAGCCGTAGTGGCGA16418DNA人工序列對人工序列的描述本發明製備陽性對照所設計和用於的引物SNP-F。4GACGGCCGAACTGGGCTA18522DNA人工序列對人工序列的描述本發明製備陽性對照所設計和用於的引物SNP-R。5ATTCAACTCCATGTGCCATGAA226307DNA人工序列對人工序列的描述本發明陽性對照標準品目的基因片段序列。6GACGGCCGAACTGGGCTAGCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGT60AGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGAC120GTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTA180ACCCTAGCGGGGGTCGCTAGGGTGAAATCACACCACGTGATGGGAGCACGACCTGATAGG240GCGCTGCAGAGGCCCACTATTAGGCTAGTATAAAAATCTCTGCTGTTCATGGCACATGGA300GTTGAAT30權利要求一種豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR鑑別檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒是由試劑、對照品、水和PCR反應管所組成1)陽性對照採用豬瘟石門標準毒株特異克隆其非編碼區約300bp的片段體外逆轉錄獲得，濃度為0.126～0.368μg/10μL；2)陰性對照採用無特異性病原豬扁桃體或頜下淋巴結、腸繫膜淋巴結，按1∶5倍體積加入磷酸鹽緩衝液，於研缽或組織勻漿器中充分研磨，然後3000r/min離心10min，取上清液轉入離心管中備用；3)Trizol裂解液40mL/瓶，分裝至棕色瓶中，4℃存放備用；4)TaqMan-MGBPCR反應液每個反應包括10×PCR緩衝液5μL、2.5μMdNTP混合物1.6μL、10μMMGB-F3μL、10μMMGB-R3μL，共12.6μL，50個反應共計630μL，分裝成2管；MGB-F和MGB-R為本發明人設計、由專業公司合成的引物MGB-FCATGCCCACAGTAGGACTAGCAAAMGB-RGAACTACTGACGACTGTCCTGTACTCA；5)反應酶每個反應包括SSIIITM反轉錄酶0.3μL、TaqHSDNA聚合酶0.5μL，共0.8μL，50個反應共計45μL，分裝成1管；6)探針溶液按本發明所設計並由專業公司合成的探針MGB-P5』-FAM-CTAGCCGTAGTGGCGA-MGB-3』，由5』-FAM和-MGB-3』修飾，合成的探針用0.1％焦磷酸二乙酯水稀釋成5μM，每個反應需1.6μL，50個反應共計90μL，分裝成1管，-20℃凍存備用。2.如權利要求1所述一種豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR鑑別檢測試劑盒，其特徵在於陽性對照製備過程中使用的引物為SNP-F:GACGGCCGAACTGGGCTA；SNP-R:ATTCAACTCCATGTGCCATGAA。全文摘要本發明設計一種豬瘟病毒TaqMan-MGB螢光定量RT-PCR鑑別檢測試劑盒及其生產方法。本發明針對該豬瘟病毒基因組5′端非編碼區的137位存在一個A/GSNP位點設計了野毒株特異的MGB探針，並在兩端保守區設計了一套通用引物，經過反轉錄酶濃度、DNA聚合酶濃度、上下遊引物濃度和探針濃度的進一步優化，建立了CSFVTaqMan-MGBPCR鑑別檢測方法。靈敏度試驗結果顯示，該方法與RT-nPCR符合率為94.3％，且靈敏度比RT-nPCR敏感10倍；特異性試驗結果顯示，17個CSFV質控株檢測均為陽性，HCLV株和12個非CSFV病原檢出率均為零，說明該方法具有很強的CSFV特異性。該方法僅能檢測豬瘟病毒野毒株，而不能檢測疫苗株和其它非豬瘟病毒株。從反應時間和試驗成本等方面都體現了TaqMan-MGBPCR鑑別檢測CSFV的優越性。文檔編號G01N21/64GK101812539SQ200910242080公開日2010年8月25日申請日期2009年12月3日優先權日2009年12月3日發明者劉俊,徐璐,王棟,王琴,範學政,趙啟祖,鄒興啟申請人:中國獸醫藥品監察所