雲南紅梨PybHLH基因及其原核表達載體和應用的製作方法

2023-12-09 09:23:16 3

專利名稱：雲南紅梨PybHLH基因及其原核表達載體和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種雲南紅梨花青素生物合成、毛狀體發生發育及鹽脅迫調控蛋白基因及其原核表達和原核表達載體在製備PybHLH蛋白和特異性抗體中的應用。
背景技術：
紅色果皮是梨分子育種的重要性狀指標。雲南省因其獨特的地理和氣候條件而擁有較多的紅皮梨種質資源，1986年以來先後已選育出早白蜜、美人酥、滿天紅和雲紅梨I號四個栽培品種。但生產中除雲紅梨I號外，其它3個品種都會因氣候變化而導致著色較差甚至不著色，因此需要研究紅梨果皮的著色機理。已有研究表明植物花青素的合成是由轉錄複合物MYB/bHLH/ WD40調控的。前人對MYB研究較多，而對植物中的bHLH和WD40蛋白研究較少。在擬南芥中LDOX基因啟動子直接包括EGL3和TT8在內的不同的MYB-BHLH-TTG1轉錄複合物的調控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突變體試驗也表明了 egl3和tt8是擬南芥幼苗花青素累積的必要條件。在擬南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白與WD-repeat/bHLH/MYB 轉錄複合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB轉錄因子(MYB75和Glabral)互作，抑制了 JA調控的花青素的累積和毛狀體的發生，而JA誘導的JAZ蛋白的降解能夠解除這種抑制。在大麗花(DahI iavariabilis)中，bHLH 轉錄因子 DvIVS 通過調控 DvCHSl, DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的轉錄來參與其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH轉錄因子MYCAl可能通過調控ANR和UFGT基因的表達來調控其花青素的生物合成。在龍膽花(G.triflora)中，GtMYB3和GtbHLH參與花青素的生物合成。Zhang等人通過酵母雙雜交和植物過表達技術發現EGL3、GL3能夠與TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl, PAPl、PAP2、CPC、TRY)組合，形成 MYB/bHLH/WD40 複合物進行包括花青素生物合成和毛狀體形 成的多功能的調控。Baudry等人通過遺傳和分子的方法發現TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能夠形成四元複合物直接調控BAN在植物中的表達。Payne等通過酵母雙雜交證實了在擬南芥中GL3/GL1/TTG1複合物調控毛狀體的發育。Bouyer通過克隆分析、誤表達和微注射試驗提出了毛狀體形成的捕獲_耗盡機制:在高濃度的毛狀體促進蛋白GL3細胞中，GL3通過結合毛狀體形成蛋白TTGl來耗盡臨近細胞中的TTGl，從而導致毛狀體形成，而周圍的細胞因TTGl的減少而不能形成毛狀體。而Zhao等人通過離子轟擊試驗證明了 TTGl，GL3，GLl和GL2並不在鄰近細胞間轉移，而R3-MYB，CPC則可在鄰近細胞間轉移，提出TTGl複合物直接調節激活子和抑制子，而抑制子的運動影響擬南芥葉上毛狀體的類型。另外，植物中的bHLH轉錄因子也參與植物抗逆性機制，擬南芥中過表達0rbHLH2或OrbHLHOOl基因增強擬南芥的抗鹽和抗冷的特性。在雲南紅梨著色機理研究方面，本實驗室研究了光照對雲南紅梨著色的影響、構建了光誘導果皮差異表達基因的SSH文庫，進行了著色相關基因的分離和表達分析。前期研究結果表明雲南紅梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40調控的。前期分離克隆的基因的部分片段(Λ構建的原核表達載體，由於該載體只含有PybHLH基因的一段序列而不是全長序列，獲得的PybHHL抗體特異性不是很理想，不能準確的用於分離與PybHLH蛋白相互作用的蛋白質和DNA片段；在前人研究基礎上，針對雲南紅梨栽培品種早白蜜、滿天紅、美人酥著色不穩定、在國內外尚未見有關雲南紅梨果皮紅色著色機理方面研究報導，本研究選擇著色最好且穩定的『雲紅梨I號』作為實驗材料，克隆了 『雲紅梨I號』中基因的全長序列，並且進行了序列分析、原核表達和蛋白純化抗體製備的研究，這將為研究雲南紅梨轉錄因子PybHLH的結構和功能奠定了基礎，並為作物花卉育種提供有利的科學依據。

發明內容
本發明的目的在於提供一種雲南紅梨基因，該基因主要是對雲南紅梨花青素生物合成、毛狀體發生發育及鹽脅迫調控蛋白起作用，/>況￡//基因來源於雲紅梨I號，雲南紅梨基因含有兩個相連的基本亞區，即富含鹼性胺基酸BASIC區域及其下遊的HLH區域，其中鹼性胺基酸基序與DNA的結合有關，對基因的轉錄發揮調控作用。本發明另一目的是提供雲南紅梨/基因的原核表達載體V從奶-PybHLH,該載體含有基因，上遊有Ptac啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，Ptac啟動子的下遊有可被IPTG誘導的操作子序列，基因的N端含有GST標籤。本發明另一目的是將原核表達載體應用在製備雲南紅梨色素合成特異性調控蛋白 PybHLH 中。本發明另一目的是將原核表達載體應用在製備PybHLH特異性抗體中，PybHLH特異性抗體應用在檢測其在轉基因植物中的表達情況、PybHLH蛋白的亞細胞定位檢測、PybHLH蛋白的純化並且在蛋白相互作用分析以及用於Far Western Blot和免疫沉澱(IP)及染色質免疫共沉澱(ChIP)中的應用。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:
1、原核表達載體的構建
(I)根據蘋果MdbHLH33基因(GenBank登錄號為DQ266451.1)編碼框，設計I對特異引物 PybHLH-F:5』 -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3 和 PybHLH-R:3』:CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc,在上下遊引物的5'端分別加入BamHI和XhoI酶切位點(下劃線部分為酶切位點)。以雲紅梨I號總RNA為模板，用M-MLV反轉錄酶合成cDNA後使用PybHLH-F和PybHLH-R進行擴增；
基因全長片段的回收；
基因的T/A克隆和測序；
(4)/>從^7基因的生物信息學分析及GenBank登錄號的獲得；
(5)構建原核表達載體:使用BamHI和XhoI對pMD-lST-Zy/yK"質粒和pGEX_4T_l進行雙酶切，分別獲得5』和3』末端帶有分別帶有BamHI和XhoI酶切位點的/基因片段和PGEX-4T-1載體，瓊脂糖凝膠電泳後分別進行回收，然後在16°C連接16 h，獲得原核表達載體認^l-M-PybHLH ；
2、PybHLH基因的原核表達
使用熱刺激法將pGEX-4T-/^^yZ"質粒轉入大腸桿菌Rosetta (DE3)中，在IPTG誘導下摸索最佳表達條件，在最適條件下進行大量表達；3、PybHLH蛋白純化及抗體製備
收集菌體，進行超聲破碎，過GST瓊脂糖親和層吸柱進行純化，收集純化後的蛋白，純化後的蛋白用於製備PybHLH蛋白特異性抗體、PybHLH蛋白表達檢測。本發明的有益效果:
本發明獲得了基因的全長序列以及重組原核表達載體pGEX-4T-/y^K仏通過
表達獲得純化蛋白，製備特異性較強的PybHLH抗體，與前期製備的抗體相比，本次發明獲得載體與抗體的優勢更強，減少了在GST pull down和免疫共沉澱實驗中出現的非特異性條帶，使實驗結果更加精 確，並且得出更好的結論。本發明製備的抗體可用於檢測PybHLH蛋白，彌補了目前沒有專門檢測PybHLH蛋白、蛋白相互作用分析的缺陷，另外，本發明的抗體還含有穀胱甘肽S轉移酶(GST)標籤,該抗體還可用於GST pull down>Far Western Blot和免疫沉澱(IP)及染色質免疫共沉澱(ChIP)中，研究與PybHLH蛋白相互作用的蛋白質和DNA片段，並且，該抗體含有的GST標籤，也方便了後續實驗。


圖1為本發明中雲紅梨I號的總RNA電泳示意 圖2為本發明/基因的PCR結果示意圖，圖中:1是DNA MarkerIII ;2和3為PybHLH纖PCR的結果；
圖3為本發明中原核表達載體pMD18T-/y^K#的酶切結果示意圖；圖中:1是DNAMarkerIII ;2、4、6 為 pMD18T_/y^K"質粒；3、5、7 分別為泳道 2、4、6 中 pMD18T_PybHLH質粒的BamHI和XhoI雙酶切結果；
圖4為本發明中PybHLH蛋白在16°C、IPTG終濃度為I mM條件誘導下的表達情況示意圖，圖中:1是轉化PGEX-4T-1空載體的Rosetta菌體總蛋白；2_6是工程菌在16°C、IPTG終濃度為I mM條件下誘導0、2、4、6和8 h後的表達情況；M是蛋白質分子量標準M0431 ;7_8是工程菌在16°C、IPTG終濃度為I mM條件下誘導8 h，總蛋白破碎後目的蛋白在上清和沉澱中的表達情況；
圖5為本發明中PybHLH蛋白的割膠純化示意圖，圖中:I的割膠回收後的PybHLH蛋白樣品；2是蛋白質分子量標準M0441 ；
圖6為本發明中PybHLH蛋白的Western Blot檢測結果示意圖；圖中:1是是PybHLH蛋白，2是GST蛋白負對照；
圖7為本發明中使用PybHLH抗體檢測35S::轉基因菸草葉片PybHLH蛋白表
達結果示意圖，圖中:1，2，3，4是轉基因株系，5是野生型對照；
圖8為本發明中免疫共沉澱分析結果示意圖，圖中:1-3是免疫沉澱的PybHLH蛋白；4是用ant1-GST進行免疫沉澱的負對照；
圖9為本發明中Far Western blotting分析結果示意圖，圖中:1和3是PybHLH蛋白，2是GST為負對照；
圖10為原核表達載體pGEX-4T-/y^K"的構建策略示意圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容並不局限於此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的採用常規試劑或按常規方法配置的試劑。實施例中使用的試劑主要為分子生物學試驗試劑:各種限制性內切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連，Takara)產品，反轉錄酶購於Promaga公司的，PCR產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海生工生物技術有限公司，大腸桿菌辦Miia (DE3)菌株和大腸桿菌DH5 α感受態細胞為北京Transgene公司產品，其餘試劑均為國產分析純。使用的儀器為GST瓊脂糖凝膠柱子，其它儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器設備。所有引物序列合成在上海傑瑞生物科技股份有限公司進行，所有基因測序在北京六合華大基因科技股份有限公司進行。實施例1:本發明雲南紅梨/基因的克隆、原核表達、純化和抗體製備，具體步驟如下:
(1)引物設計
根據蘋果MdbHLH33基因(GenBank登錄號為DQ266451.1)編碼框，設計I對特異引物PybHLH-F:5』 -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3』 和 PybHLH-R:5，-CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc-3』，在上下遊引物的5'端分別加入BamHI和XhoI酶切位點(下劃線部分為酶切位點)。(2)總RNA的提取
a、用液氮將0.1 g雲紅梨I號紅色果皮充分研磨成粉末以後，加入1 ml RNA提取緩衝液(4 M異硫氰酸胍，25 mM檸檬酸鈉，0.5 % (w/v)十二烷基肌氨酸鈉，2 %(w/v) PVP,β-巰基乙醇)，轉入2 ml離心管中，再研磨均勻後，再加入1/10體積2 M醋酸鈉(pH 4.2)；
b、顛倒離心管數次，混勻之後，接著加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，蓋緊離心管蓋，劇烈搖動5 min,冰上靜置15 min後，4°C離心15 min (12000 g/min)；
C、離心結束後取上清於新離心管中，加入等體積的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈搖動5min,冰上靜置 15 min 後,4 °C離心 15 min (12000 g/min)；
d、取上清，加入等體積異丙醇，在_20°C沉澱RNA30 min，再次4°C離心15 min (12 000g/min),讓RNA沉澱在管壁；
e、RNA沉澱經75%乙醇清洗兩次後抽真空乾燥，然後加入20μ l無RNase的DEPC處理水徹底溶解RNA ；
f、使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA (見圖1)。(3) RT-PCR
以雲紅梨I號總RNA為模板,用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄合成cDNA,具體步驟如下:
a、在EP管中加入以下組分:總RNA2 μ g ;oligo (dT) 18 0.5 μ g ;無RNase的水補足15
μ l ;
b、70°C5 min後，迅速冰上靜置2 min ；
C、離心數秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集離心底部；
d、再向離心管中加入以下組分:5XM-MLV反應緩衝液5 μ 1、dNTP (IOmM)U.25 μ 1RNase 抑制劑 0.5 μ 1、RTase M-MLV(200 U) 1 μ 1，無 RNase 的水補足 25 μ 1 ;e、42°C保溫60 min, -20 1:保存備用；
以反轉錄合成的雲紅梨I號cDNA後使用PybHLH-F和PybHLH-R進行PCR擴增，反應體系如下:
反應體系:ddH20 17.8 μ I, Taq Plus DNA Polymerase IOXBuffer 2.5 μ 1,10 mMdNTP 0.4μ 1，10μΜ 的 5』 引物 1μ 1，10 μΜ 的 3』 引物 I yl，cDNA 模板 2 μ 1,5 U/μ I的 Taq Plus DNA Polymerase 0.3 μ I ;反應條件為:94 °C 2 min, (94°C 30 s』 59°C 30s，72°C 2 min) 30 個循環，72°C 10 min (見圖 2)。基因片段的回收:對PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳後，切下目的片段；使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對目的片段進行回收。基因的T/A克隆和測序；將回收的PCR產物，按照pMD18T說明書，進行T/A克隆；轉化大腸桿菌感受態DH5 α後，塗固體LB + Amp平板，挑取白色菌落，接種到液體LB + Amp培養基中，37°C、200 rpm搖床過夜，提取質粒，進行酶切檢測，然後送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。基因測序和生物信息學分析及GenBank登錄號的獲得:PybHLH基因的讀碼框為1947 bp，該基因編碼648個胺基酸，分子量為72925.8 Da，等電點為5.5LDNAMAN比對結果表明，PybHLH與蘋果、矮牽牛、擬南芥和玉米等調控花青素生物合成的bHLH轉錄因子具有很高的同源性，尤其是與蘋果中的MdbHLH33在同一進化枝，故將該序列命名為PybHLH 荖裡。 (7 )原核表達載體的構建(構建策略見圖1O ):使用BamHI和Xho I對pMD \m~PybHLH和載體pGEX-4T-l按照說明書進行雙酶切(見圖3)，分別獲得5』端帶有BamHI和3』端帶有XhoI的/基因片段和PGEX-4T-1載體，跑電泳後分別進行膠回收，按照摩爾比目的基因:載體=3:1加樣,然 後加入Ligation Solution I,16°C連接16 h ;將感受態大腸桿菌E.coli DH5 α 100 μ I加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30 min, 42°C熱刺激45s後，冰浴2 1^11;加入90(^1液體培養基30(:，371:搖床200 rpm 60min使菌體復甦；培養結束後，常溫8000 rpm離心I min收集菌體；在超淨臺上吸去上清，剩餘約0.1 ml時，使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒塗布均勻；37°C過夜培養；挑取白色菌落，接種於LB液體+ Amp的培養基，37°C、180 rpm培養12 h後，提取質粒；進行酶切驗證後，再送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序進行測序驗證插入基因的正確性，最後獲得原核表達載體認&\-M_PybHLH。(8)PybHLH蛋白的原核表達:使用熱刺激法將重組質粒ρ6ΕΧ_4Τ-/>/ ^7轉化入大腸桿菌Rosetta (DE3)感受態細胞中，塗LB+Amp固體平板，挑取V-M-PybHLH的重組菌落於LB + Amp液體培養基中37°C、200 rpm振蕩培養過夜，按1:100的比例接種於相同的LB培養基上培養至0D600為0.6-0.8，加IPTG至終濃度為I禮，在16°C下培養0、2、4、6和8 h後收集菌液用於分析總蛋白；4°C、12 000 rpm離心I min,棄上清液,沉澱用100 μ ISDS 凝膠加樣緩衝液(Tris-HCl 50 mM,pH 6.8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚藍 0.1 % ;甘油10 %)重懸，煮沸5 min後，12 000 rpm離心I min，取20 μ I上清液進行SDS-PAGE檢測。用考馬斯亮藍R-250染色液(0.1 %考馬斯亮藍R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脫色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)進行脫色後，使用凝膠成像系統進行拍照；結果顯示插入有外源片段的重組質粒pGEX-4T-PybHLH經IPTG誘導後，在預期的蛋白分子量約98.9 kD (包括載體上GST蛋白)左右有I條蛋白條帶，而未誘導的轉化重組質粒和PGEX-4T-1對照質粒未出現這條蛋白帶(見圖4),表明重組質粒pGEX-4T_PybHLH在大腸桿菌Rosetta (DE3)中誘導表達了 PybHLH蛋白，超聲破碎後，SDS-PAGE檢測後，發現該蛋白主要在包涵體表達。(9) PybHLH蛋白純化:包涵體蛋白的割膠純化，具體內容如下:
1、重組蛋白的大量表達及包涵體的洗滌
a、最優條件大量表達重組蛋白，超聲波破碎；
b、離心12000rpm,4°C,30分鐘，收集沉澱；
c、3M尿素洗滌沉澱，離心12000rpm，4°C，20分鐘，加入適量8M尿素冰上溶解沉澱。2、透析袋電洗脫法純化蛋白
a、透析袋的預處理:剪取適當長度(10-20cm)的透析袋(截留範圍為8 000-12 000Da);置於大體積的2 %(ff/V)碳酸氫鈉和I mM EDTA(pH8.0)中，煮沸10 min ;蒸餾水徹底清洗透析袋；置於ImM EDTA(pH8.0)溶液中再次煮沸10 min ;冷卻後4 °C保存；
b、取已溶解的蛋白沉澱，加1/5體積5X蛋白上樣緩衝液進行SDS-PAGE電泳；
C、電泳結束後將膠放在0.25 M預冷的KCl中，4°C浸泡5分鐘使蛋白顯白色，蒸餾水衝洗蛋白膠，用刀片從SDS-PAGE電泳凝膠上切下目的蛋白，切成I mm X I mm X I mm的碎片，放入預處理好的透析袋中，注入2 ml SDS-PAGE電泳緩衝液，將透析袋前後封口 ；
d、電泳回收:在水平核酸電泳槽中加入適量SDS-PAGE電泳緩衝液，將裝有凝膠的透析袋置入其中，100 V電壓，4 °C電泳4-5 h，直至凝膠變透明，說明目的蛋白從凝膠中洗脫出來；
e、透析:洗脫完畢，吸出透析袋內溶液，SDS-PAGE檢測(以10μ I的BSA標準蛋白定量)電泳結果(見圖5)，鑑定後正確的蛋白溶液裝入乾淨的透析袋中，用預冷的IXPBS溶液(I X PBS (IL)KCl 0.2 g、NaCl 8 g、Na2HP04 1.42 g、KH2P04 0.27 g)添加尿素8M(96 g)、6 M(72 g)、4 M(48 g)、2 M(24 g)、0 Μ於 4 °C下分別透析 3-5 h，其間換透析液2-3次；純化後的蛋白溶液送抗體製備公司製備PybHLH蛋白特異性抗體，可用於PybHLH蛋白表達水平檢測及進行免疫沉澱(IP)、Far Western blotting和染色質免疫共沉澱(ChIP)試驗。實施例2 =PybHLH蛋白特異性抗體的Western blotting和轉基因菸草的檢測 為檢測PybHLH蛋白特異性抗體的有效性，使用PybHLH蛋白抗體檢測誘導的PybHLH原
核表達蛋白和轉基因菸草，具體過程如下:
本實施例使用的儀器為垂直蛋白電泳儀、PVDF膜(millipore), Sem1-Dry TransferCell(BIO-RAD)轉膜系統；
試劑為丙烯醯胺、二甲叉丙烯醯胺，10 %APS，TEMED, I X甘氨酸Buffer，I XPBS,I XPBT,脫脂奶粉，Whitman 3MM濾紙等SDS-PAGE和Western試驗試劑。、
A、PybHLH原核表達蛋白的Western blotting檢測
蛋白樣品製備:蛋白樣品和1/5體積5X蛋白上樣緩衝液(Tris-Cl (pH 6.8)250 mM,SDS 10 %，溴酚藍0.5 %，甘油50 %，β-巰基乙醇5 %)，95°C加熱5 min後置於冰上5_10min,常溫，13 000 rpm 離心 I min ；
一、SDS-PAGE
1、75 %酒精清洗玻璃膠板，組裝電泳裝置；按表I配製分離膠和濃縮膠，倒膠，小心用正丁醇或異丙醇覆蓋；
表1:分離膠和濃縮膠的配方
權利要求
1.雲南紅梨/基因，其特徵在於基因的核苷酸序列如SEQID N0:3所示或編碼如SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列的蛋白質。
2.權利要求1所述雲南紅梨基因的原核表達載體pGEX-4T-/^^yZ仏其特徵在於:該載體含有/基因，上遊有Ptac啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，Ptac啟動子的下遊有可被IPTG誘導的操作子序列，基因的N端含有GST標籤。
3.權利要求2的所述雲南紅梨基因的原核表達載體在製備雲南紅梨色素合成特異性調控蛋白PybHLH中的應用。
4.權利要求2的所述雲南紅梨PybHLH基因的原核表達載體在製備PybHLH特異性抗體中 的應用。
全文摘要
本發明公開了一種雲南紅梨花青素生物合成、毛狀體發生發育及鹽脅迫調控蛋白PybHLH基因及其原核表達載體，本發明利用RT-PCR技術從雲南紅梨雲紅梨1號紅色果皮中克隆PybHLH基因，然後構建了原核表達載體pGEX-4T-PybHLH，pGEX-4T-PybHLH載體在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進行表達PybHLH蛋白，純化後，獲得雲南紅梨PybHLH純化蛋白，本發明還將PybHLH基因原核表達載體應用在製備PybHLH特異性抗體中，獲得的PybHLH特異性抗體還用於研究蛋白質與蛋白質以及蛋白質與DNA的相互作用以及對PybHLH轉基因植物的檢測，本發明獲得的PybHLH特異性抗體中含有穀胱甘肽S轉移酶(GST)，獲得的PybHLH特異性抗體運用於FarWesternblotting和免疫共沉澱實驗研究蛋白質相互作用以及準確分離獲得與PybHLH相互作用的蛋白質和DNA片段。
文檔編號C07K16/16GK103146709SQ20131008570
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者李昆志, 崔道雷, 張曉東, 樊磊, 陳麗梅, 舒群, 蘇俊 申請人:昆明理工大學