妊娠特異性β的製作方法

2023-12-09 04:17:21 1

專利名稱：妊娠特異性β的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種診斷血球、單向免疫擴散板，具體地說是涉及妊娠特異性β1糖蛋白的診斷血球、單向免疫擴散板的製備方法和應用。
妊娠特異性β1糖蛋白(SP1)是由胎盤合體滋養層細胞分泌的，測定孕婦血中SP1的含量，能反映胎盤體積和功能的變化，目前多採用放射免疫法，雖測值可信，但由於放射性衰變和需要貴重的醫療設備，不易普及基層醫院。
本發明的目的是提供一種在孕晚期、足月或過期妊娠情況下，測定SP1值的診斷血球、單向免疫擴散板的製備方法和應用。
本發明中妊娠特異性β1糖蛋白(SP1)診斷血球、單向免疫擴散板的製備方法採用如下步驟1SP1的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產婦胎盤5-10個，應用組織搗碎機勻漿，加2倍體積生理鹽水攪拌20-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉澱，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉澱用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。
1.2 sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩衝液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分別收集洗脫液，應用SP1血球試劑檢查各管濃度，收集SP1高濃度管合併，用50％飽和硫酸銨沉澱，透析至無NH+。
1.3SP1偶聯sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產的sepharose4B10-40ml，經0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗後冰浴，加入新配製的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調PH值，使之維持在5-12左右，反應5-20分鐘，用布氏漏鬥抽乾，加入經0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的SP1抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩衝液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經紫外分光光度計測定280nmOD值，計算其偶聯率為78.2％。將合併的高濃度樣品5ml加入SP1抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩衝液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩衝液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集SP1高濃度區，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯sepharose4B親和層析柱製備與SP1抗體偶聯sepharose4B相同，其偶聯率為7.28％。將濃縮除鹽SP1樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩衝液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合併各管濃縮，凍幹為SP1純品。
2 SP1抗血清的製備選擇2kg雄性家兔，於雙後足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天後向淋巴結周圍多點注射，SP1抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml,(每千克體重50-400μgSP1抗原)。以後每間隔一周免疫一次，經5次免疫後，試血效價達到1∶64倍時(雙向瓊脂擴散法)，頸動脈放血分離血清。
3人「O」型紅細胞的醛化取健康男性「O」型紅細胞，經戊二醛、甲醛、丙酮醛處理後，配成10％醛化血球懸液。
4SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心後用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將SP1IgG稀釋成1-20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恆溫振蕩水浴下反應0.5-3小時，經含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩衝液洗去未結合IgG，配成1％血球懸液，生產出SP1凍幹診斷血球。
5將SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、200、400倍，於56℃滅活30分鐘，分別加入等體積的2.4％瓊脂液中，瓊脂液需煮沸10-40分鐘後，冷卻至40-70℃時方可混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑2.5mm，孔距1.2cm。
本發明製備的SP1的鑑定1．非特異性檢查應用非孕婦女血清6份，男性血清6份，分別加入SP1單向免疫板瓊脂孔內各5μl，放置37℃恆溫24小時判定結果，均無沉澱環出現，說明SP1單向免疫板無非特異性反應。
2．穩定性檢查將SP1單向免疫板存放4℃不同月份進行比較，每批均加入相同樣品各5μl，放置37℃恆溫24小時進行觀察，發現放置6個月以內的免疫板，其沉澱環大小和清晰度無差別，而放置7個月的免疫板，沉澱環清晰度略差，8個月放置的免疫板，沉澱環不清楚。由於免疫板放置時間過長，導致SP1抗血清失活。經觀察比較，免疫板使用期限應在6個月以內為宜，每批使用前，均用SP1標準進行質量檢查。通過對211例28-41孕周正常妊娠婦女血清測定，結果表明正常孕婦血清SP1值隨孕周增加，41孕周達到高峰並維持到分娩。本方法以各孕周平均值正負兩個標準差為各孕周正常範圍的下限值(警界值)。確定36-41孕周血清SP1≤100μg/ml為警界值，＞100μg/ml為正常值，以此對高危妊娠婦女進行觀察。
下面結合實施例詳細敘述本發明。
1 SP1的提純1.1飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產婦胎盤10個，應用組織搗碎機勻漿，加2倍體積生理鹽水攪拌30分鐘，離心4000r/min20分鐘，去沉澱，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，5000r/min20分鐘，棄上清，沉澱用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。
1.2sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規處理裝柱(2.5×100cm)用0.2mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩衝液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速60ml/h以每管5ml分別收集洗脫液，應用SP1血球試劑檢查各管濃度，收集SP1高濃度管合併，用50％飽和硫酸銨沉澱，透析至無NH+。
1.3SP1偶聯sepharose4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產的sepharose 4B30ml，經0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗後冰浴，加入新配製的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調PH值，使之維持在11左右，反應10分鐘，用布氏漏鬥抽乾，加入經0.1mol/LNaHCO3(PH9.0)透析的SP1抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩衝液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經紫外分光光度計測定280nmOD值，計算其偶聯率為78.2％。將合併的高濃度樣品5ml加入SP1抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩衝液(PH7.4)洗脫，流速30ml/h洗至280nmOD值＜0.02時，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩衝液(PH2.4)解吸附，流速60ml/h，收集SP1高濃度區，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。
1.4抗人全血抗體偶聯sepharose4B親和層析柱製備與SP1抗體偶聯sepharose4B相同，其偶聯率為7.28％。將濃縮除鹽SP1樣品5ml加入抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩衝液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合併各管濃縮，凍幹為SP1純品。
2 SP1抗血清的製備選擇2kg雄性家兔，於雙後足掌注射活卡介苗20mg,10天後向淋巴結周圍多點注射，SP1抗原加福氏完全佐劑2ml，(每千克體重150μgSP1抗原)。以後每間隔一周免疫一次，經5次免疫後，試血效價達到1∶64倍時(雙向瓊脂擴散法)，頸動脈放血分離血清。
3人「O」型紅細胞的醛化取健康男性「O」型紅細胞，經戊二醛、甲醛、丙酮醛處理後，配成10％醛化血球懸液。
4 SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心後用0.1mol/L醋酸鈉配成5％血球，將SP1IgG稀釋成10μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在45℃恆溫振蕩水浴下反應1.5小時，經含有1％兔血清的磷酸鹽緩衝液洗去未結合IgG，配成1％血球懸液，生產出SP1凍幹診斷血球。
5將SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、200、400倍，於56℃滅活30分鐘，分別加入等體積的2.4％瓊脂液中，瓊脂液需煮沸30分鐘後，冷卻至56℃時方可混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑2.5mm，孔距1.2cm。
本發明應用實施例如下取10μl孕婦血清用1ml鹽水稀釋成100倍等待檢測用，在V型微量血凝板上，從第1孔到第5孔各加樣品稀釋水25μl，取100倍稀釋的血清25μl加到第1孔，用微量加樣器從第1孔起依次做2倍稀釋到第4孔，第5孔為空白對照，凍幹SP1診斷血球用血球稀釋水2ml溶解並搖勻，4℃過夜放置後應用，取25μl稀釋血球從第1孔到第5孔各加25μl，震勻後放37℃,1小時取出判定結果。
判定標準孕婦血清中SP1能與SP1抗體致敏血球出現凝集反應(陽性)，反之，如血清中不含有或濃度較低，則不出現凝集(陰性)，依據出現血球凝集的血清最大稀釋倍數乘以致敏血球的敏感度(0.125μg/ml)，便可確定血清中SP1的濃度。
判定方法血球全部沉入孔底為陰性，根據凝集程度分為1-4各階段，凝集在2以上可判定為陽性。
計算公式血清中SP1含量(μg/ml)=血球凝集孔的血清稀釋倍數×診斷血球的敏感度(μg/ml)。
用毛細玻璃管取孕婦耳垂血0.1ml，分離出血清，用微量加樣器吸取5微升加入瓊脂孔內(注意不要溢出孔外)，加樣完畢後，蓋好塑料板，水平放人溫盒內，在37℃條件下擴散24小時觀察結果，分別記錄所測樣品的免疫沉澱環直徑(mm)，從標準曲線上可查出SP1值，即得該樣品的SP1含量。通過對211例28-41孕周正常妊娠婦女血清測定，結果表明正常孕婦血清SP1值隨孕周增加，41孕周達到高峰並維持到分娩。本方法以各孕周平均值正負兩個標準差為各孕周正常範圍的下限值(警界值)。確定36-41孕周血清SP1≤100μg/ml為警界值，＞100μg/ml為正常值，以此對高危妊娠婦女進行觀察。其中標準曲線的製備方法是在瓊脂板孔內分別加入3個不同濃度的SP1標準液，每孔加樣5μl，放入37℃恆溫24小時後觀察沉澱環直徑，發現SP1抗血清200倍稀釋後所做的瓊脂板，免疫沉澱環直徑比較清晰，其擴散環直徑分別為8.1mm、6.2mm、5.0mm，以標準含量為橫坐標，標準液免疫沉澱環直徑為縱坐標，繪製標準工作曲線。(參考德國Benring研究所的SP1標準)
權利要求
1.一種妊娠特異性β1糖蛋白診斷血球、單向免疫擴散板的製備方法，該方法包括以下步驟(1)SP1的提純(1.1)飽和硫酸銨鹽析正常足月分娩產婦胎盤5-10個，應用組織搗碎機勻漿，加2倍體積生理鹽水攪拌20-40分鐘，離心3000-6000r/min20分鐘，去沉澱，上清用50％飽和硫酸銨鹽析，4000-10000r/min20分鐘，棄上清，沉澱用生理鹽水溶解，以生理鹽水透析至無NH+。(1.2)sephadex G200柱層析取sephadex G20010克，按常規處理裝柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl緩衝液(PH8.0)平衡，取鹽析濃縮樣品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10m1分別收集洗脫液，應用SP1血球試劑檢查各管濃度，收集SP1高濃度管合併，用50％飽和硫酸銨沉澱，透析至無NH+。(1.3)SP1偶聯sepharose 4B親和層析取瑞典pharmacia公司生產的sepharose4B10-40ml，經0.5mol/LNaCl和冷蒸餾水淋洗後冰浴，加入新配製的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH調PH值，使之維持在5-12左右，反應5-20分鐘，用布氏漏鬥抽乾，加入經0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的SP1抗體攪拌4℃過夜，次日裝柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸鹽緩衝液洗至280nmOD值＜0.01為止，收集全部洗脫液，經紫外分光光度計測定280nmOD值，計算其偶聯率為78.2％。將合併的高濃度樣品5ml加入SP1抗體親和層析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩衝液(PH6-8)洗脫，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02時，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩衝液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集SP1高濃度區，用50％飽和硫酸銨濃縮除鹽。(1.4)抗人全血抗體偶聯sepharose4B親和層析柱製備與SP1抗體偶聯sepharose4B相同，其偶聯率為7.28％。將濃縮除鹽SP1樣品5ml加人抗人全血抗體親和層析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸鹽緩衝液(PH7.0)洗脫，洗速為30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合併各管濃縮，凍幹為SP1純品。(2)SP1抗血清的製備選擇2kg雄性家兔，於雙後足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天後向淋巴結周圍多點注射，SP1抗原加福氏完全佐劑0.5-4ml，(每千克體重50-400μgSP1抗原)。以後每間隔一周免疫一次，經5次免疫後，試血效價達到1∶64倍時(雙向瓊脂擴散法)，頸動脈放血分離血清。(3)人「O」型紅細胞的醛化取健康男性「O」型紅細胞，經戊二醛、甲醛、丙酮醛處理後，配成10％醛化血球懸液。(4)SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球離心後用0.1mol/L醋酸鈉配成1-10％血球，將SP1IgG稀釋成1-20μg/ml濃度與等量醛化血球混合，在20-60℃恆溫振蕩水浴下反應0.5-3小時，經含有0.1-3％兔血清的磷酸鹽緩衝液洗去未結合IgG，配成1％血球懸液，生產出SP1凍幹診斷血球。(5)將SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀釋成100、200、400倍，於56℃滅活30分鐘，分別加入等體積的2.4％瓊脂液中，瓊脂液需煮沸10-40分鐘後，冷卻至40-70℃時方可混合均勻鋪板。瓊脂厚度3.0mm，打孔直徑2.5mm，孔距1.2cm。
2.一種妊娠特異性β1糖蛋白診斷血球、單向免疫擴散板在判定胎盤功能方面的應用。
全文摘要
一種妊娠特異性β
文檔編號G01N33/53GK1289925SQ99113259
公開日2001年4月4日 申請日期1999年9月24日 優先權日1999年9月24日
發明者王曉東 申請人:吉林省計劃生育科學技術研究所