預防和治療性傳播疾病－i的藥劑的製作方法

2023-12-09 01:25:36

專利名稱：預防和治療性傳播疾病－i的藥劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及性傳播疾病的預防和治療，更具體涉及具有萘基二磺酸末端基團的樹狀體(dendrimer)作為局部應用藥劑在預防和治療這些疾病中的用途。
背景技術：
估計HIV，HSV及其他病毒與微生物病原體引起的性傳播疾病(STD)的全球發病率和死亡率為全世界數億人。控制STD傳播的一個措施是使用局部應用的女性/男性控制的陰道或直腸的殺微生物劑以滅活相關的病原體。因此，發展預防和治療STD的陰道內或直腸內應用的新型的、安全的、局部的殺微生物劑是新藥開發的重要目標。
國際專利申請No.PCT/AU95/00350(WO95/34595)和PCT/AU99/00763(WO 00/15240)，這裡引入它們的內容作為參考，揭示了一類新的多價藥劑-樹狀體，它是包有明確的多陰離子或陽離子表面基團的高度分支的大分子，已經顯示出了一定範圍的抗病毒和抗微生物活性及極低的毒性。不象大多數抗病毒藥物的小分子結構，這些樹狀體是一種多價的、高度分支的大分子化合物，通過重複反應順序而形成，開始於一起始核心分子，後續的層或級以連續的「世代」加入以構建三維的、高度有序的多聚體化合物。樹狀體具有以下的特點i.起始核心可以有一個或多個反應位點且呈點樣或具有顯著的大小以實現樹狀體的最終拓撲結構；ii.分支的重複單元的層連到起始核心；iii.功能性的末端基團(例如含陰離子或陽離子的部分)任選通過連接基團連到樹狀體的表面。
這些大分子化合物由具有多個分支或樹樣結構的單體結構單元合成，分子的外表面攜帶有多個功能性基團，其導致被生物受體識別。
樹狀體的製備是公知的，並在美國專利Nos.4,289,872和4,410,688(描述的樹狀體基於賴氨酸單元層)，以及美國專利Nos.4,507,466，4,558,120，4,568,737和4,587,329(描述的樹狀體其於其它單元包括聚醯胺型胺或PAMAM樹狀體)中以舉例的方式進行描述。
在抗病毒和抗微生物的測試中，這些樹狀體結構的一個亞組出人意料地表現出對抗廣譜的性傳播疾病相關微生物的異常活性，這使得它們成為發展預防和治療性傳播疾病的陰道或直腸殺微生物劑的選擇藥劑。
發明概述根據本發明，提供了式I，II或III的化合物或其可藥用鹽


其中R代表式IV的基團 合適的可藥用的鹼加成鹽包括但不限於金屬鹽例如鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅鹽，以及由有機胺製得的有機鹽，有機胺如N，N′-二苄基-乙二胺、氯普魯卡因、，二乙醇胺、乙二胺、二環己基胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普魯卡因，季銨類如膽鹼，以及硫鎓(sulphonium)和磷鎓鹽。
本發明特別優選的化合物是這裡稱為SPL-7013，SPL-7304和SPL-7320的化合物，它們的結構分別由聚賴氨酸樹狀體，聚醯胺型胺(PAMAM)樹狀體，和聚甲基吖丙啶樹狀體支架構成，活性表面基團由32個萘基二磺酸基團組成，為鈉鹽。通過醯胺-亞甲基氧鍵連到32個末端基團，每個萘基二磺酸功能性表面基團連到分支的樹狀體支架上。
本發明還提供了一種預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的局部藥物組合物，它包含以上式I，II或III的化合物或其可藥用鹽，以及至少一種可藥用的局部用的載體或稀釋劑。
在另一方面，本發明還提供了一種預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的方法，包括局部給予患者有效量的以上式I，II或III的化合物或其可藥用鹽。
在另一方面，本發明提供了以上式I，II或III的化合物或其可藥用鹽在製備預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的局部應用的藥物中的用途。
本發明的詳細描述式I，II和III的化合物及其可藥用鹽是新的化合物，它們已出人意料地表現出對抗廣譜的性傳播疾病相關病原體的異常活性。
如上所述，化合物SPL-7013，SPL-7304，和SPL-7320是本發明優選的化合物，並已發現其表現出顯著的抗病毒活性，尤其是對抗最為常見的性傳播疾病的病毒和微生物媒介。
SPL-7013表現出廣譜的抗病毒活性，其高效地對抗幾種最為重要的陰道或直腸性傳播疾病的媒介並具有極低的細胞或動物毒性。已在體外細胞試驗和體內動物(小鼠)模型試驗中確定了其對抗生殖器皰疹病毒-2(HSV-2)的高活性以及在體外細胞試驗中對抗皰疹病毒-1(HSV-1)與人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的高活性。它還表現出對生殖器疣的病原體人乳頭瘤病毒(HPV)和對非特異性尿道炎的細菌媒介沙眼衣原體有活性。在細胞試驗中，SPL-7103還表現出對抗對目前應用的基於修飾核苷的抗病毒劑耐藥的皰疹病毒-2病毒株的活性。另外，SPL-7304和SPL-7320表現出對抗HSV-1，HSV-2，HIV-1和HIV-2的高活性。而且SPL-7013，SPL-7304和SPL-7320在CD4依賴性和CD4非依賴性HIV傳播測試中有活性，並且對阻止HIV-1的附著和融合是有效的。所有的化合物都表現出不抑制多種有益的乳桿菌的生長。另外，SPL-7013，SPL-7304和SPL-7320表現出能有效地預防HIV-1 RoJo或SIV 89.6pd感染人外周血單核的細胞(PBMCs)。
因此，這些化合物作為旨在應用於陰道或直腸黏膜以保護性對抗性傳播感染的局部殺微生物劑在預防和治療性治療性傳播疾病中是有用的。
本發明還提供了一種預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的局部藥物組合物，它包括如上所述的式I，II或III的化合物或其鹽，以及至少一種可藥用的局部載體或稀釋劑。
這種組合物的配製對於本領域技術人員而言是熟知的。合適的可藥用載體和/或稀釋劑包括任何和所有常規溶劑，分散介質，填充劑，固體載體，水溶液，包衣，抗菌劑和抗真菌劑，等滲劑，及吸收增強劑或延遲劑，活性增強劑或延遲劑以及諸如此類。這些介質和試劑用於藥學活性物質在本領域是熟知的，並且在Remington’sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing Company，賓夕凡尼亞，美國)中以舉例的方式有所描述。除了與活性成分不相容的任何常規載體和/或稀釋劑，在本發明的藥物組合物中都可以考慮使用。附加的活性成分包括有著抗病毒或抗微生物活性的藥劑也能摻入本發明的組合物中。
特別有利的是將組合物配製成劑量單位形式以易於給藥與劑量均一。這裡使用的劑量單位形式指的是物理上分離的單位，適合作為用於待治療人類對象的單元劑量；每個單位包含經計算可產生所需的治療效果的預定量的活性成分，以及所需要的藥用載體和/或稀釋劑。本發明的新劑量單位形式的規格決定於和直接取決於(a)活性成分的獨特特點和有待獲得的特定的治療效應，以及(b)將這種活性成分配成用於特定治療的工藝所固有的限制。
如前所述，本發明還提供了一種通過局部給予患者有效量的上述的式I，II或III的化合物或其鹽而預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的方法。另外，本發明提供了上述式I，II或III的化合物或其鹽在製備用於這種預防性或治療性治療性傳播疾病的局部應用的藥物中的用途。
多種局部給藥途徑都是可行的。所選擇的特定的方式當然將取決於所治療的特定病症以及預防或治療效力所需的劑量。一般來說，本發明的方法可以使用醫學上可接受的任何給藥方式實施，意思是任何產生本發明活性成分的預防性或治療性水平而不引起臨床不可接受的副作用的方式。這種給藥方式包括陰道，直腸和經皮途徑。對於局部，特別是陰道或直腸給藥的合適製劑包括溶液，懸浮液，凝膠，洗劑和乳霜，以及獨立單位如栓劑和微膠囊化的懸浮液。其他給藥系統可包括持續釋放給藥系統，它能提供本發明活性成分的緩慢釋放，包括持續釋放凝膠，乳霜，栓劑，或膠囊。許多類型的持續釋放給藥系統都是可行的。這些包括但不限於(a)侵蝕系統，其中活性成分包含在基質之中；(b)彌散系統，其中活性成分通過聚合物控速滲透。
本發明的活性成分按預防或治療有效量給藥。預防或治療有效量意思是至少部分獲得預期效果，或延遲所治療的特定病症的發生，抑制它的進展，或完全停止它的發生或進展的必需劑量。當然這種量將取決於所治療的特定病症，病症的嚴重程度和個體患者參數包括年齡，身體健康狀況，體型，體重和同時進行的治療。這些因素對於本領域的普通技術人員是熟知的，並且僅通過常規試驗就可加以確定。通常優選使用最高劑量，即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。然而，那些本領域的普通技術人員將明白，出於醫學原因、心理原因或事實上任何其他原因，可給予較低劑量或可耐受劑量。
通常地，以預防或治療致病狀態所確定的間隔，活性成分的陰道內或直腸內劑量將從每天約0.01mg/kg到每天1000mg/kg。最初可以給予小劑量(0.01-1mg)，之後增加劑量直至每天約1000mg/kg。當以這種劑量對象的反應不足時，可以給予對象甚至更高的劑量(或通過不同的、更局部化的給藥途徑給予有效的更高劑量)至患者耐受所允許的程度。每天多個劑量可預計獲得適宜的化合物全身水平。
在特別優選的方面，本發明提供了SPL-7013，SPL7304或SPL7320作為在預防和治療病毒性和微生物性性傳播疾病中有用的廣譜的陰道或直腸殺微生物劑的用途。SPL-7013，SPL7304和SPL7320是水溶性的並可以以溶液形式使用，或在合適的載體中配成凝膠、洗劑、乳霜或栓劑或微膠囊化的在含水或非水溶劑中的懸浮液的形式，結合其活性的增強劑或延緩劑，增強或延緩其局部應用吸收的試劑，或增強與陰道/直腸上皮或黏膜層粘附的試劑。
在本說明書和隨後的權利要求書的全文中，除非上下文另外要求，措詞「包含/包括(comprise)」或其變體如「包含/包括(comprises)」或「包含/包括(comprising)」，應理解為指包括一個或多個所述的步驟或整數或整數組，但不除外任何其他的一個或多個步驟或整數或整數組。
本發明的其它特點將體現於下面的實施例，其旨在舉例說明而不是限制本發明。
實施例1A.製備BHAlyslys2lys4lys8lys16TFA321.N，N′-二-t-Boc-L-賴氨酸(DBL)將L-賴氨酸.HCl(1.83kg；10mol)溶解於氫氧化鈉(880g；22mol)的水溶液(20L)中，並用叔丁醇(15L)稀釋所獲得的溶液。將二碳酸二叔丁基酯(4.48kg；20.5mol)在1小時內逐滴加入，在這段時間內，反應混合液成為乳狀和溫熱的(30-35℃)。將混合物攪拌過夜以獲得澄清的溶液。用石油醚(40-60℃)(2×10L)提取該溶液，並用飽和碳酸氫鈉溶液(3×4L)提取有機相。將合併的水層冰浴冷卻，並用1M KHSO4溶液小心地酸化到pH 2。然後用乙醚(4×16L)提取混濁的混合物，用水(2×8L)洗滌合併的有機層，乾燥(MgSO4)以及在溫度小於30℃的浴中濃縮，生成一定量的N，N′-二-t-Boc-L-賴氨酸，為非常粘的油。
2.N，N′-二-t-Boc-L-賴氨酸4-硝基苯基酯(DBLONp)氮氣氛下將二環己基碳二亞胺(DCC)(2-06kg；10mol)的乙酸乙酯溶液(5L)逐滴加入到在乙酸乙酯(15L)中的二-t-Boc-L-賴氨酸(DBL)(3.46kg；10mol)和4-硝基苯酚(NpOH)(1.39kg；10mol)的冰冷攪拌溶液中。在添加完成後，使混合物溫到室溫並攪拌過夜。然後過濾所得到的白色懸浮液，濃縮濾液得到黃色的固體殘餘物。殘餘物從乙醚中重結晶得到白色固體的N，N′-二-t-Boc-L-賴氨酸4-硝基苯基酯(產率約60％)。更多的產物之後能從母液中分離得到。
3.BHAlys.2HCl將DCC(41.2g；0.2mol)的無水二氯甲烷溶液(200ml)加入到冰冷的DBL(69.2g；0.2mol)和二苯甲基胺(BHA)(36.65g；0.2mol)的二氯甲烷溶液(600ml)中。於0℃攪拌混合物30分鐘，然後在室溫下攪拌3小時。過濾所獲得的懸浮液，濾液的tlc(石油醚/EtOAc，9∶1)顯示無起始原料。用5％HCl，水，飽和碳酸氫鈉和水洗滌濾液；然後乾燥(MgSO4)並濃縮得到泡沫。
在室溫下將三氟乙酸(TFA)(400ml)加入到攪拌中的所述泡沫的無水二氯甲烷溶液(200ml)中。最初有劇烈的氣體放出，其在約15分鐘後停止；tlc(EtOAc)顯示無原料存在。再攪拌溶液2小時，然後濃縮得到褐色的油。將該油溶解在無水乙腈(600ml)中，漩渦加入溶解在無水乙醇(約360ml)中的HCl氣體飽和溶液。白色的固體馬上開始結晶，混合物在室溫下靜置1小時以完成結晶。過濾混合物，用無水乙腈洗滌固體，然後乾燥得到白色粉末的BHAlys.2HCl(產率約80％)。
4.BHAlyslys2Boc4將三乙胺(39.5ml；0.283mol)加入到攪拌著的BHAlys.2HCl(54.4g；0.14mol)的無水DMF(300ml)溶液中。當加入DBLONp(262g；0.56mol)時，形成白色懸浮液，攪拌15分鐘。混合物迅速變成黃色，攪拌3小時，加入三乙胺以保持混合物的pH值在8-9。
然後將反應混合物緩慢地加入到大量的劇烈攪拌的水中，混合物攪拌過夜。過濾收集沉澱，用水(3X)洗滌並乾燥得到黃色的固體。將該固體粉末化，然後用乙醚連續洗滌，直到乙醚用NaOH水溶液處理後不顯示黃色為止。剩餘的固體乾燥得到白色粉末的BHAlyslys2Boc4(產率約70％)。
5.BHAlyslys2lys4Boc8將三氟乙酸(600ml)加入BHAlyslys2Boc4(116g；0.12mol)的無水二氯甲烷溶液(600ml)中，立即有劇烈的氣體放出。攪拌溶液2小時，濃縮得到粘性的油。將油溶於無水DMF(500ml)，用三乙胺將溶液pH值調整到8-9。
然後加入DBLONp(460g；0.99mol)，室溫下攪拌黃色溶液2天，定期用三乙胺調節pH值保持pH值在8以上。將反應物沉澱到水中，如上所述進行操作，得到白色粉末的BHAlyslys2lys4Boc8(產率約100％)。
6.BHAlySlyS21ys4lys8Boc16將三氟乙酸(1L)加入到BHAlyslys2lys4Boc8(200g；0.106mol)的無水二氯甲烷溶液(1L)中，立即有劇烈氣體放出。攪拌溶液2小時，濃縮得到粘油。將油溶解在無水DMF中，用三乙胺將溶液pH值調整到8-9.然後加入DBLONp(782g；1.67mol)，室溫下攪拌黃色溶液2天，定時用三乙胺調整pH值保持pH值在8以上。將反應物沉澱到水中，如上所述進行操作，得到白色粉末的BHAlyslys21ys41ys8Boc16(產率約100％)。
7.BHAlyslys2lys4lys8lys16Boc32將三氟乙酸(1.6L)加入到BHAlyslys21ys41ys8Boc16(300g；0.081mol)的無水二氯甲烷混合物(800ml)中，立即有劇烈氣體放出。攪拌溶液2小時，濃縮得到粘油。將油溶解在無水DMF(1.2L)中，用三乙胺將溶液pH值調整到8-9.然後加入DBLONp(1030g；2.21mol)，室溫下攪拌黃色溶液2天，定時用三乙胺調整pH值保持pH值在8以上。將反應物沉澱到水中，如上所述進行操作，得到白色粉末的BHAlyslys2lys4lys8lys16Boc32(產率約100％)。
8.BHAlyslys21ys41ys8lys16TFA32將三氟乙酸(168ml)一次性加入叔丁氧羰基(Boc)保護的聚賴氨酸核心BHAlyslys2lys4lys8lys16Boc32(20g)的二氯甲烷懸浮液(350ml)中，環境溫度下攪拌反應物14個小時。將反應混合物真空濃縮，溶解在水(200ml)中，凍幹得到灰白色固體的BHAlyslys21ys41ys8lys16TFA32(17.5g，83％)。
B.製備SPL 7013(i)二鈉-[1-(氧亞甲基-羧乙基)-3，6-萘-二磺酸]將1-羥基-3，6-萘-二磺酸二鈉(100g)溶解在二甲亞碸(250ml)中，並一次性加入二異丙基乙胺(60ml)。在30分鐘的時間內加入溴乙酸乙酯(38ml)，在室溫除溼下攪拌反應物14個小時。將反應物緩慢地傾入乙酸乙酯(2L)中以得到油性的殘餘物/膠。潷掉上清，加入額外的乙酸乙酯(1.5L)。將殘餘物研碎數次然後用丙酮洗滌得到褐色固態的二鈉-[1-(氧亞甲基-羧乙基)-3，6-萘-二磺酸](97g，78％)。
(ii)1-(氧亞甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸將NaOH水溶液(134ml)一次性加入到500ml的二鈉-[1-(氧亞甲基-羧乙基)-3，6-萘-二磺酸](97g)水溶液中。室溫下攪拌反應物14小時，然後將反應物通過IR120(酸形式)柱。冷凍乾燥收集的級分得到褐色固態的1-(氧亞甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸(67g，83％)。
(iii)BHAlyslys2lys4lys8lys16[NH-CO-CH2O-3，6-萘基-(SO3Na)2]32-SPL 7013將1-(氧亞甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸(47.85g)溶解在DMF(500ml)中，並一次性加入二異丙基乙胺(115ml)。將上述溶液加入到通過將六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-磷鎓(PyBOP；72g)一次性加入到BHAlyslys21ys41ys8lys16TFA32(15.95g)的DMF(650ml)溶液中而製備成的溶液中。用DMF(100ml)漂洗滴液漏鬥。室溫下攪拌反應混合物14個小時，然後用水(10L)稀釋。將溶液泵過1微米厚(depth)的濾器，並通過含10kD膜的Pall Filtron裝置(Pall Gelman)。將所得溶液通過IR120(鈉形式)柱，泵過0.22微米厚濾器並冷凍乾燥得到灰白色固態的SPL-7013，產率75％。30℃，檢測波長設定為240nm，ODS-EC 15cm×4.6mm HPLC柱上停留時間＝15分鐘。利用詳細描述如下的梯度洗脫，以每分鐘1ml的流速洗脫樣本。
其中溶劑A＝在0.01M NH4OAc中的0.015M TBAH，(pH 7.0)，溶劑B＝在MeOH中的0.015M TBAH。
SPL7013的質譜分析表明分子量為16，580±2道爾頓。對SPL7013分子式C583H577N63Na64O287S64預計的平均分子量是16，581.53。
C.SPL 7304的製備按相似的方法，通過PyBOP偶聯1-(氧亞甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸與聚醯胺型胺(PAMAM)樹狀體，generation 3(Starburst，Sigma-Aldrich Pty.Ltd.，Australia)製備SPL7304。
D.SPL 7320的製備按相似的方法，通過PyBOP偶聯1-(氧亞甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸與聚甲基吖丙啶三十二烷胺(dotriacontaamine)樹狀體，generation4.0(DAB-Am-32，Sigma-Aldrich Pty.Ltd.，Australia)製備SPL7320。
實施例2SPL 7013，SPL 7304和SPL 7320的生物活性A.抗人免疫缺陷病毒的活性使用的人免疫缺陷病毒株是HIV-1(IIIB)1和HIV-2(ROD)2。平行地進行抗逆轉錄病毒活性和細胞毒性測定。這些試驗基於已經被HIV感染然後暴露於不同濃度的試驗化合物的MT-4細胞的存活。在MT-4細胞增殖5天後，通過基於四氮唑比色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)方法在96孔微板上定量活細胞的數目3。
在所有的這些檢測中，病毒輸入(病毒感染複數，MOI)是50％細胞培養感染劑量(CCID50)的0.01或100倍。50％抗病毒抑制濃度(EC50)定義為保護50％病毒感染的細胞對抗病毒的致細胞病性所需要的化合物濃度。50％細胞毒性濃度(CC50)定義為將模擬感染的(mock-infected)細胞的存活減少50％所需要的化合物濃度。＞符號用於表示仍發現無細胞毒性的化合物測試的最高濃度。幾次獨立試驗的平均EC50和CC50值如上述定義表示。通常，各數值不偏離EC50和CC50值上下2倍以上。SI為抗病毒選擇性指數CC50/EC50。
表HIV活性
IIIB＝HIV-1ROD＝HIV-2EC90＝減少病毒噬斑90％的有效濃度(i)CD4依賴性和CD4非依賴性HIV傳播抑制試驗，HIV附著和融合，以及乳桿菌屬生長抑制的方法細胞和病毒HIV-1IIIB，和HeLa CD4 LTR β-gal，GHOST X4/R5，及HL2/3細胞系獲自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Bethesda，MD)，並按推薦的進行保存。ME 180細胞獲自美國典型培養物保藏中心(Manassas，VA)。
測試材料的處理和保存除非主持者指定了可供選擇的溶劑和貯存條件，化合物通常溶解在100％DMSO中，並貯存在-80℃直到測試。在製備成組織培養基中的工作溶液之前，冷凍的原液在室溫下融化，在37℃預溫15分鐘並渦旋。在化合物稀釋和處理的所有階段，通過不透明的遮蓋以及通過在不透明或琥珀色的組織培養器中進行貯存和稀釋來保護化合物避光。另外，通過減少實驗室內50％的所有螢光照明來控制室內和組織培養層流罩超靜臺的光暴露。在最高測試濃度的最終DMSO濃度為0.25％。
CD4-非依賴性HIV傳播抑制測試將ME180細胞，一種CD4陰性、X4陽性的宮頸上皮細胞系維持在補充10％胎牛血清、穀氨醯胺和抗生素的RPMI 1640中。在測定前24小時，將ME180細胞用胰蛋白酶消化，洗滌和接種在96孔平底微量板中，密度為每孔2×103細胞。在測試當天，用新鮮製備的絲裂黴素C(200μg/ml)在37℃處理被HIV-1的SK1臨床分離株慢性感染的H9細胞(H9-SK1)60分鐘。該絲裂黴素C濃度足以導致細胞死亡但允許病毒傳播發生。在絲裂黴素C處理後，用組織培養基洗H9-SK1細胞3次。將測試化合物加入到ME180單層，隨後加入2×104H9-SK1細胞。將ME180細胞與H9-SK-1細胞以及測試材料共培養4小時，用PBS洗滌ME180單層3次以去除H9-SK1細胞。在測試開始後的24和48小時，再次用PBS洗孔3次以確保去除H9-SK1細胞，在無測試材料的培養基中繼續培養。在共培養後六天，收集上清，用ELISA評價p24抗原表達。用XTT染料還原法評估細胞存活。在第一個測試中被判定為有活性的化合物添加或不添加粘蛋白進行再次測定。通過添加200μg/ml的豬粘蛋白(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)到傳播反應而在有粘蛋白存在下進行測試。如上所述實施傳播間隔和不置換粘蛋白或化合物的洗滌。所有的測定一式三份進行，測試材料1/2Log10系列稀釋。
CD4-依賴性HIV傳播抑制測試實施CD4依賴性HIV傳播抑制測試，基本上如CD4非依賴性傳播測試所述，除了使用CD4陽性的GHOST(3)X4/5細胞系。這個細胞系來源於HOS(人骨肉瘤)細胞系，它是HIV共同受體和CD4表達陰性的。通過非選擇性的逆轉錄病毒載體和帶有潮黴素選擇性標記的HIV-2 LTR hGFP構建體將該細胞系改造為表達T4(CD4)，R5和X4。如上CD4非依賴性HIV抑制測試所述，處理和培養細胞系，除了本測試中使用的是2.5×104GHOST(3)X4/R5和5×102絲裂黴素C處理過的H9/SK-1細胞。如上所述進行化合物的添加，絲裂黴素C處理以及傳播後的洗滌以除去H9/SK-1細胞，以使兩個抗病毒測試可比。在感染後24小時評價病毒複製，3次洗滌後，用ELISA測定細胞結合的p24，以確保在CD4存在下的單輪感染。化合物毒性和細胞存活用XTT染料還原法測定。
在第一個測試中被判定為有活性的化合物添加或不添加粘蛋白進行再次測定。通過添加在組織培養基中的200μg/ml豬粘蛋白(SigmaChemical Co.，St Louis，MO)到傳播反應來進行有粘蛋白存在的測試。如上所述實施傳播間隔和不置換粘蛋白或化合物的洗滌。所有的測試一式三份進行，測試材料1/2Log10系列稀釋。
乳桿菌試驗捲曲乳桿菌和詹氏乳桿菌獲自美國典型組織培養物保藏中心，並生長在乳桿菌MRS肉湯中(Difco，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。該培養基允許乳桿菌在厭氧條件下有效生長。製備桿菌原種並於-80℃下將其凍存於15％甘油中以用於敏感性檢測。為了評價化合物對捲曲乳桿菌和詹氏乳桿菌生長的影響，用來自甘油細菌原種貯存的穿刺針接種10ml MRS培養基。培養物放置在Gas Pak CO2袋中37℃下溫育24小時。第二天將乳桿菌培養物稀釋到670nm波長下OD值0.06。將化合物稀釋並置入96孔平底板中，加入乳桿菌。將分別為1.25U/ml和1.25μg/ml高測試濃度的商購的青黴素/鏈黴素溶液作為陽性對照。板再次被放置在Gas Pak CO2袋中37℃溫育24小時，通過用moleculardevices讀板機在490nm測定的光密度確定細菌的生長。所有的測定一式三份進行，從高測試濃度作6次1/2log稀釋。
病毒附著測定本測定設計為檢測與細胞相互作用及阻斷病毒附著的化合物，和/或與形成的附著/融合複合物相互作用的化合物。
用HeLa CD4 LTRβ-gal細胞進行附著測定。與所需的選擇抗生素一起常規培養HeLa CD4 LTRβ-gal細胞。在測定開始前24小時，細胞被胰蛋白酶消化，計數，將1×104細胞放置在0.2cm孔中無選擇抗生素的培養基中。在第24小時除去培養基，將含化合物的培養基放置於細胞並在37℃下溫育15分鐘。然後將已知滴度的HIV IIIB株添加到培養孔中，繼續溫育1小時。在溫育結束時，用培養基洗滌培養孔3次並繼續培養40到48小時。
在測定結束時，除去培養基，按照生產商的使用說明(TropixGal-screenTM，Bedford Mass)通過化學發光測定β-半乳糖苷酶的表達，通過單一步驟的化學發光方法，利用單一溶液裂解細胞和測定β-半乳糖苷酶活性。在姐妹板上用XTT染料還原法監測化合物毒性。所有的測試一式三份進行，測試材料1/2log10系列稀釋。1小時的病毒吸附間隔是足夠短的，使得需要磷酸化成為其有活性的三磷酸形式(AZT-TTP)的AZT在該測定中是無活性的。
融合測定
融合測定評價化合物阻斷細胞與細胞融合的能力，該融合由HIV-1 Env和單獨細胞上表達的CD4介導。本測定對於gpl20/CD4相互作用的抑制劑和X4共同受體抑制劑都是敏感的。首先，將5×103HeLa CD4 LTRβ-gal細胞放置在微量板孔中，並溫育過夜。第二天除去培養基，將HeLa CD4 LTRβ-gal細胞在含測定化合物的新鮮培養基中37℃下溫育1小時。隨後加入5×103HL2/3細胞，繼續溫育40到48小時。在40到48小時，用化學發光(Tropix Gal-screenTM，Tropix，Bedford，MA)檢測β-半乳糖苷酶表達。在姐妹板上用XTT染料還原法監測化合物毒性。所有的測定一式三份進行，測試材料1/2log10系列稀釋。
P24抗原ELISAELISA試劑盒購自Coulter Electronics，根據生產商的指導進行對上清或細胞結合的p24抗原的檢測。對於細胞結合的p24，通過在25到50μl Coulter供應的病毒裂解緩衝液中裂解孔內容物而產生溶胞產物，1輪凍/融後對其進行檢測。全部p24抗原測定在樣本系列稀釋後進行以保證吸光度在標準p24抗原曲線的線性範圍內。用生產商提供的標準物和指導生成標準曲線。利用Molecular Devices Vmax platereader在450nm通過分光光度分析得到數據。利用Molecular DevicesSoft Max軟體包從光密度值計算出最終的濃度，並表示為pg/ml p24抗原。
細胞存活和化合物細胞毒性的XTT染色通過測定含細胞與化合物但不含病毒的複製微量板中四氮唑染料XTT(2，3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四氮唑氫氧化物)的還原來確定測試材料的TC50值。在代謝活性細胞中的線粒體酶NADPH氧化酶將XTT代謝為可溶性甲產物，這允許快速定量分析細胞存活和化合物細胞毒性。每天製備XTT溶液，為1mg/ml的PBS貯液。吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液製備為15mg/ml的PBS溶液，並貯存在-20℃避光。在使用前即刻將PMS用PBS按1∶100稀釋並且每毫升加入40μl的XTT溶液以製備成XTT/PMS原液。將50微升的XTT/PMS加入到板的每個孔中並將板在37℃溫育4小時。4小時溫育是經驗性確定的，以使得每個測定指定數目的細胞的MTS染料還原在線性反應範圍內。用板密封器(adhesive plate sealer)取代板蓋，密封的板倒轉幾次以混合可溶性甲產物，並用Molecular Deviees Vmax 96孔板規格的分光光度計在450nm讀板。
數據分析將硫酸葡聚糖(陽性)和葡聚糖(陰性)用作CD4依賴性和CD4非依賴性HIV傳播抑制測定的對照。將磺酸染料芝加哥天藍用作為附著和融合測定的陽性對照4。商購的青黴素(10,000U/ml)鏈黴素(10.0mg/ml)溶液用作乳桿菌敏感性測定的陽性對照。對於每種化合物，適當地通過線性回歸計算IC50(抑制病毒複製或傳播50％的濃度)，ID50(抑制乳桿菌50％生長的濃度)，TC50(造成細胞存活減少50％的濃度)及治療指數(TI∶TC50/IC50或ID50)。
CD4依賴性和CD4非依賴性傳播測定的結果
乳桿菌屬測試的結果
1青黴素和鏈黴素的起始濃度分別為1.25U/ml和1.25μg/ml。
附著和融合抑制測定的結果
(ii)SPL7013，SPL7304和SPI7320抗HIV-1 RoJo及SIV 89.6pd的活性方法病毒人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)株RoJo是一種低傳代兒科分離株，來自Southern Researeh Institute(SRI)的實驗室。SHIV 89.6pd獲自SRI的Mark Lewis，原種生長在人PBMCs中用於進行抗病毒測定。
PBMC的分離和促增生(blasting)利用ficou hypaque梯度分離從正常肝炎和HIV陰性供體中獲得外周血單核的細胞(PBMCs)。簡而言之，抗凝血用不含Ca++和Mg++的Dulbecco′s磷酸緩衝鹽水(PBS)1∶1稀釋，在50ml離心管中鋪層到14ml的淋巴細胞分離介質上。離心管600xg離心30分鐘。輕輕地從所得界面吸出分成條帶的PBLs，隨後通過低速離心用PBS洗滌2遍。將單核的細胞計數，通過臺盼藍染料排斥測定存活，並將細胞按1×106細胞/mL重懸在補充15％FBS(熱滅活)，2mM L-穀氨醯胺，100U/mL青黴素，100μg/mL鏈黴素，和10μg/mL慶大黴素及2μg/mL植物凝血素(PHA)的RPMI 1640培養基中。在37℃，5％CO2培養細胞48到72小時。溫育後，離心收集細胞，洗滌並重懸在補充15％FBS(熱滅活)，2mM L-穀氨醯胺，100U/mL青黴素，100μg/mL鏈黴素，和10μg/mL慶大黴素及20U/mL重組IL-2(R D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640中。在培養基中包含IL-2是為了維持由PHA促有絲分裂刺激啟動的細胞分裂。細胞在IL-2中培養72小時，然後用於病毒攻擊。
PBMC測定將已經用PHA和IL-2促增生的來自最少兩個供體的人外周血單核的細胞計數，用臺盼藍染料排斥測定存活，並等比例混合。使用合併的供體以最小化在個體供體之間觀察到的變異，這種變異來自於初級淋巴細胞群的HIV感染以及對PHA和IL-2的總體反應方面的量和質的差異。將細胞按1×106細胞/mL重懸在補充15％胎牛血清(熱滅活)，2mM L-穀氨醯胺，100U/mL青黴素，100μg/mL鏈黴素，和10μg/mL慶大黴素及重組IL-2(20U/mL，R D Systems，Minneapolis，MN)但不含酚紅的RPMI 1640中。然後將50微升的細胞按SouthernResearch Institute的Infectious Disease Research department制定的標準格式分布到96孔圓底微量培養板的內60個孔中。每板含有細胞對照孔(只有細胞)，病毒對照孔(細胞加病毒)，和試驗孔(藥物加細胞加病毒)。將系列稀釋的化合物加入到微量板中，隨後加入適當的預先滴定的HIV-1或SHIV-1株。所有樣本測定一式三份，複製板不含病毒用於確定化合物毒性。
每孔的終體積是200μl。將測定物在潮溼大氣，37℃，5％CO2溫育6天，之後收集上清用於RT活性的分析，利用MTS染料還原分析姐妹板的細胞存活。還在顯微鏡下觀察孔並記錄下任何的異常。
細胞存活的MTS染色在測定結束時，用可溶性的基於四氮唑的染料MTS(CellTiterReagent Promega，Madison，WI)對測定板進行染色，以確定細胞存活和定量化合物毒性。代謝活性細胞的線粒體酶將MTS代謝為可溶性的甲產物，這允許快速定量分析細胞存活和化合物細胞毒性。該試劑為單一穩定溶液，在使用前無需製備。在PBMC測定終末，每孔中加入20μl MTS試劑，在37℃溫育4小時。用板密封器取代板蓋，密封的板倒轉幾次以混合可溶性的甲產物，並用Molecular DevicesVmax讀板機在490nm分光光度法讀板。
逆轉錄酶測定在無細胞的上清中測定逆轉錄酶活性。將氚標記胸苷三磷酸(NEN)(TTP)以5Ci/mL重懸在蒸餾水中。製備Poly rA和oligo dT原液並保存在-20℃。每天製備新鮮的RT反應緩衝液，它由125μl1.0M EGTA，125μl dH2O，110μl 10％SDS，50μl 1.0 M Tris(pH 7.4)，50μl1.0M DTT，和40μl 1.0M MgCl2組成。按2份TPP，1份poly rAoligodT和1份反應緩衝液的比例將這三種溶液混合在一起。將10微升的該反應混合物置入圓底微量板中，加入15μl含病毒的上清並混合。將板溫育在37℃的水浴中，且用固體支持物以防止板浸沒，溫育60分鐘。反應後，將反應體積點到DE81紙上，在5％磷酸鈉緩衝液中洗5次，每次5分鐘；在蒸餾水中洗2次，每次1分鐘；在70％乙醇中洗2次，每次1分鐘，然後乾燥。將Opti-Fluor O加到每個標本，利用Wallac 1450 Microbetaplus液體閃爍計數器定量摻入的放射性。
數據分析提供了IC50(抑制病毒複製50％)，TC50(細胞存活減少50％)，與治療指數(TI，IC50/TC50)。將AZT用作各測定的相關的陽性對照化合物。
以下的表中總結了實施的抗病毒評價的結果
化合物在PBMCs中抗病毒活性的總結
B.抗皰疹病毒HSV-1和HSV-2的活性(i)病毒噬斑減少測定一般方法測定中使用的是HSV標準株G(HSV-2)和F(HSV-1)。6孔板的病毒輸入是100pfu/孔。在病毒生成減少測定中使用HSV敏感細胞系Vero細胞。將一種上皮細胞系Hela-229細胞用於細胞毒性測定。
通過改良的噬斑減少試驗確定化合物的抗病毒作用。
用PBS洗滌匯合的細胞，隨後用HSV(100pfu/孔)在37℃下感染1小時，每10分鐘傾斜1次。除去病毒接種物後，用PBS洗滌感染的細胞，並用含0.5％甲基纖維素的培養基(等體積的1％甲基纖維素與2X培養基混合)覆蓋細胞。對於HSV-2感染，細胞在37℃下溫育2天，而HSV-1感染則溫育3天。當噬斑足夠大時，用10％福馬林固定細胞10分鐘。隨後用0.5％結晶紫染色噬斑10分鐘。用自來水洗滌去除染料並在通風櫥中乾燥。然後計數噬斑。
所有的數據來自於一式兩份試驗。將測試孔的平均噬斑計數與對照孔的平均噬斑計數進行比較。
計算EC50(令接種物噬斑計數減少50％的濃度)。在相同的細胞系中平行地進行抗病毒活性和細胞毒性測定。50％細胞毒性濃度(CC50)定義為將模擬感染細胞存活減少50％所需的化合物濃度。
感染前處理方法從6孔板中匯合的Vero細胞去除培養基，並用1ml PBS洗滌。每個孔中加入1ml含濃度為0，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，和30μg/ml化合物的培養基，在37℃溫育1小時。
在細胞與樹狀體預溫育後，然後用100pfu/孔的HSV-1或HSV-2感染細胞。將感染物在37℃下溫育1小時，每10分鐘傾斜1次。除去接種物後，用1.5ml的用2×培養基稀釋的0.5％甲基纖維素覆蓋感染細胞用於噬斑測定。
處理感染的細胞用PBS洗滌匯合的Vero細胞。然後用100pfu/孔的HSV-1或-2在37℃下感染細胞1小時。去除病毒接種物後，用PBS洗滌感染的細胞1次，並用含濃度為0，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30和100μg/ml樹狀體的0.5％甲基纖維素覆蓋細胞。在37℃溫育細胞2天(HSV-2)或3天(HSV-1)用於噬斑測定。
樹狀體的細胞毒性通過泵從24孔板中匯合的Hela-229細胞中去除培養基。然後用1ml PBS洗滌細胞1次。在每個孔中加入含濃度為0，100，500和1000μg/ml樹狀體的培養基。將細胞在37℃培養箱中溫育2天。在培養結束時，去除培養基並用PBS洗滌細胞。隨後在每個孔中加入500μl的0.01％中性紅(在PBS中)，37℃溫育30分鐘。然後去除染料，用每孔1ml的PBS洗滌細胞2次。在每個孔中加入500μl 50％乙醇和1％冰醋酸的PBS溶液並在室溫下120-150rpm輕輕搖晃下溫育15分鐘以提取染料。將來自每孔的100μl提取的染料加入到96孔板中，用ELISA讀板機讀出550nm的吸光度。
抗HSV-1和HSV-2活性的表
PT＝感染前處理INF＝處理感染的細胞(ii)皰疹病毒-2，在動物模型中的效力在小鼠(MS品系)模型中測定SPL-7013在預防生殖器HSV試驗中的效力。在HSV-2感染前20秒，將15μl的100mg/ml或10mg/ml劑量的化合物滴入16隻動物的陰道中。與對照相比，SPL-7013在所有測試動物中預防了感染和疾病。將相同數目的對照感染小鼠在3天內總死亡率作為測試的終點。
小鼠中HSV-2生殖道感染和疾病處理的表
所有動物在感染前20秒進行處理C.人乳頭瘤病毒(HPV)，人上皮細胞攝取的抑制評價化合物抑制人乳頭瘤病毒樣顆粒結合及攝取進人上皮細胞系的能力。
化合物以6個稀釋度範圍進行測試，作為6b型人乳頭瘤病毒的乳頭瘤病毒螢光染料標記的病毒樣顆粒(VLPs)的結合及攝取的抑制物。在SPL-7013存在下使VLPs結合併被攝取入上皮細胞。用流式細胞儀測定結合與攝取，對結合的抑制表示為相對於在缺乏抑制物下觀察到的結合的百分比。在兩個獨立的測定中進行試驗。
方法細胞人表皮樣癌細胞系A431購自美國典型培養物保藏中心，第30代(CRL-1555，Batch F-13530)，並保存在含10％FCS的DMEM中。
根據標準的操作程序培養和純化6b型人乳頭瘤病毒VLPs。顆粒用螢光染料標記。
將化合物重新溶解在無菌水中使濃度達到5mM，在-20℃下冷凍之前新鮮地用於第一次測定。然後將化合物融化用於第二次測定。
攝取測定用10ml PBS/EDTA(0.05％)在37℃下洗滌T75瓶中的A431細胞5分鐘，然後用2ml胰蛋白酶在37℃下進一步處理5分鐘。往細胞中加入DMEM/10％FCS(10ml)，在室溫下1000xg離心細胞5分鐘，然後按3×105細胞/ml重懸在15ml管中的完全培養基中。在37℃培養細胞2小時且每20分鐘倒轉1次以允許細胞表面蛋白的重表達。
在室溫下1000xg離心細胞5分鐘，按3×105細胞/100μl重懸於無血清的DMEM中，並將100μl的懸液置入1.5ml管中。將含以下6個稀釋度的化合物的10μl PBS加入到細胞中100μM，10μM，1.0μM，100nM，10nM，1.0nM。
在加入標記的VLPs(200ng)之前，將細胞與化合物在37℃溫育30分鐘。只將VLPs加入到細胞中作為陽性對照，細胞中加入VLPs但在冰上溫育作為陰性對照。混合細胞並在37℃溫育2小時。用1mlPBS洗滌細胞1次，並用FACS緩衝液固定(PBS/4％低聚甲醛)。用Coulter FACS機器進行分析。
分析利用WinLisT分析結果。首先用前向/側向散射分析細胞大小，並分選活細胞。生成該分選的平均螢光強度(MFI)並用於進一步的分析。攝取報告為相對於單獨VLPs(100％)及與VLPs溫育於冰上的細胞(0％)所觀察到的結合的百分比。
結果SPL-7013，在1μM觀察到了對攝取的最大抑制(26％攝取)，在更高的濃度沒有進一步的抑制。該化合物在1μM和10nM仍顯示攝取抑制。在該點後隨著SPL-7013濃度降低病毒攝取增加。
D.沙眼衣原體感染SPL-7013在動物模型中的效力。
在沙眼衣原體感染前20秒，用15μL的100mg/ml SPL-7013溶液滴註上或下生殖道處理雌性小鼠(MS品系)。下生殖道感染定義為培養在攻擊後3天或6天採集的陰道拭子標本分離到病原體。對於上生殖道感染的定義為培養在攻擊後10天收集的上生殖道組織分離到病原體。用磷酸緩衝液PBS處理的小鼠作為對照。
對小鼠中沙眼衣原體生殖道感染的效應受保護未發生感染的動物組oup 動物數目 時間下生殖道(％) 上生殖道(％)組1.
SPL-7013 16 -20秒 8(50％)a8(50％)PBS 15 -20秒 1(7％)2(13％)組2.
SPL-7013 16 -20秒 6(38％) 8(50％)aPBS 16 -20秒 1(7％)1(6％)本領域技術人員懂得可以對這裡寬泛描述的發明在不偏離本發明的精神和範圍的前提下進行變更和改進，除了那些特別描述的。應理解本發明延伸到包括所有這些變更和改進。
參考文獻1.Popovic，M.；Sarngadharan，M.G.；Read，E；Gallo，R.C.從AIDS和AIDS前期患者中檢測、分離和連續產生致細胞病變的逆轉錄病毒(HTLV-III).「Detection，isolation，and continuous prodnction ofcytopathic retroviruses(HTLV-III)from patients with AIDS andpre-AIDS.」Science(1984)，224497-500.
2.Clavel，E；Guyader，M.；Guetard，D.；Salle，M.；Montagnier，L；Alizon，H.2型人免疫缺陷病毒的分子克隆和多態性。「Molecularcloning and polymorphism of the human immunodeficiency virus type2.」Nature(1986)，324691-695.
3.Pauwels，R.；Balzarini，J.；Baba，M.；Snoeck，M.R.；Schols，D.；Herdewijn，R；Desmyter，J，De Clercq，E.檢測抗HIV化合物的快速和自動化的基於四氮唑的比色測定法。「Rapid and automatedtetrazolium-based colorimetric assay for the detection of anti-HIVcompounds.」J.Virol.Metlzods(1988)，20309-321.
4.Clanton et al.，J.AIDS.(1992)，5771.
權利要求
1.式I，II或III的化合物或其可藥用鹽 其中R代表式IV的基團
2.根據權利要求1的化合物，其中所述可藥用鹽選自金屬鹽例如鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅鹽，以及與有機胺形成的有機鹽，有機胺如N，N′-二苄基乙二胺、氯普魯卡因、，二乙醇胺、乙二胺、二環己基胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普魯卡因，或季銨類如膽鹼，以及硫鎓和磷鎓鹽。
3.本文的化合物SPL-7013或其可藥用鹽。
4.本文的化合物SPL-7304或其可藥用鹽。
5.本文的化合物SPL-7320或其可藥用鹽。
6.一種預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的局部用藥物組合物，它包括根據權利要求1到5任一項的化合物，以及至少一種可藥用的局部的載體或稀釋劑。
7.一種預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的方法，它包括局部給予患者有效量的根據權利要求1到5任一項的化合物。
8.根據權利要求7的方法，其中所述疾病是陰道或直腸性傳播疾病，選自HSV-1，HSV-2，HIV-1，HIV-2和HPV感染，以及沙眼衣原體感染。
9.根據權利要求1到5任一項的化合物用於製備預防性或治療性治療人類患者的性傳播疾病的局部用藥物的用途。
全文摘要
具有萘基二磺酸末端基團的聚賴氨酸、聚醯胺型胺或聚甲基吖丙啶樹狀體作為局部應用的藥劑在預防或治療性傳播疾病中的用途。
文檔編號A61K31/785GK1503816SQ02807728
公開日2004年6月9日 申請日期2002年3月28日 優先權日2001年3月30日
發明者B·R·馬特斯, B R 馬特斯, G·赫蘭, 綻, P·卡勒拉斯, 翰德森, S·A·翰德森, 歐克菲, D·F·歐克菲 申請人:星藥有限公司