一種鴨病毒性肝炎滅活疫苗及其製備方法

2023-12-09 03:43:46

專利名稱：：一種鴨病毒性肝炎滅活疫苗及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種鴨病毒性肝炎滅活疫苗及其製備方法，屬於獸醫生物製品
技術領域：
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背景技術：
：鴨病毒性肝炎(DuckViralH印atitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(或稱鴨病毒性肝炎病毒)(Duckh印atitisvirus,DHV)引起的雛鴨的一種高度致死性、傳播迅速的病毒性疾病，其特徵是病程短促，臨床表現角弓反張，病變主要為肝臟腫大並有出血斑點。DVH不僅引起雛鴨發病，死亡率高，而且使成年鴨呈隱性感染，向外排毒，成為病原的傳播者。在疾病嚴重爆發時，雛鴨死亡速度驚人，對該病如果不進行及時的控制，會給養鴨業帶來極大的經濟損失。鴨肝炎病毒的病毒顆粒無囊膜，屬於微RNA病毒科。病毒粒子呈二十面體對稱，直徑2040nm，在電子顯微鏡下從肝臟超薄切片上觀察到34nm的顆粒，目前對於鴨病毒性肝炎的分子生物學的研究相對較少。鴨肝炎病毒有3個血清型，即I、II、III型，3個血清型都可引起鴨病毒性肝炎，但是目前普遍存在的鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒I型引起的。據報導，n型病毒與i型病毒無抗原相關性；m型病毒與i型病毒之間無抗原關係。郭玉璞等根據病毒中和實驗和血清被動保護實驗結果，證實我國流行的DHV病原為I型鴨肝炎病毒。DHV-I型對外界環境的抵抗力特別強，可耐受乙醚、碳氟化合物、氯仿、胰酶及30%的甲醇和硫酸錢的處理，具有一定的熱穩定性，在37"C條件下可存活21d，56。C加熱23h才能使其完全失活，一些常用消毒劑對該病毒滅活效果也不明顯。I型鴨病毒性肝炎，Levine和Hofstad於1945年在美國首次發現該病(Levine，P.P.，andM.S.Hofstad.1945.Duckdiseaseinvestigation.AnnuRepNewYorkStateVetCollIthaca,pp.5556)，1950年，Levine和Fabricant在紐約長島首次用雞胚分離出I型鴨肝炎病毒(Levine,P.P，andJ.Fabricant.1950.Ahitherto-undescribedvirusdiseaseofducksinNorthAmerica.CornellVet40:7186)。1954年，AsplinJ艮道了英國爆發流行病毒性肝炎(Asplin，F.D.1965.Duckhepatitis:vaccinationagainsttwoserologicaltypes.VetRec77:1529-1530)，隨後德國、加拿大、法國、日本等國相繼報導了DHV的流行。在我國，1963年，黃均建最早於上海報導了DVH的發生(黃均建等.小鴨病毒性肝炎研究.1963.上海農科院畜牧獸醫研究所單行本)，1980年，北京大學王平等報導了北京地區DVH的流行(王平等.北京小鴨病毒性肝炎的研究(一)診斷與防治，北京大學自然科學學報.1980.1:56-74)。目前我國還沒有商品化的鴨病毒性肝炎疫苗。近年來，不斷有使用I型鴨病毒性肝炎弱毒疫苗或高免卵黃抗體進行預防或治療無效的鴨群爆發疑似鴨病毒性肝炎，使得防制鴨肝炎病毒感染的難度不斷增大。
發明內容本發明的目的是利用本發明人由野外分離到的一株擁有優良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株作為生產疫苗的病毒株，接種到易感雞胚上，收穫胚液，滅活後乳化，製成-種安全、有效的鴨病毒性肝炎疫苗，有針對性的防制鴨肝炎病毒感染。1疫苗生產用毒株(1)病毒來源本發明製備所用的生產病毒是一株鴨病毒性肝炎I型病毒，由本發明人從野外發病鴨體內分離到，命名為鴨肝炎病毒(DuckH印atitisvirus，DHV)QL株(2009年07月15日本株病毒(DHVQL株)已送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.3202)。(2)DHVQL株病毒株特性1)病毒形態DHVQL株病毒病毒粒子呈二十面體對稱，直徑2040nm，在電子顯微鏡下從肝臟超薄切片上觀察到34nm的顆粒。2)分子生物學鑑定從組織毒提取RNA，經反轉錄後，根據Genbank發表的DHV全基因序列設計的一對特異性引物Pl:5'-ACAGGAGCCAAGGGTTAT-3，；P2:5'-GCCAGGTGGTTGATGTM-3'進行RT-PCR擴增，，將擴增後的產物經酶切顯示出序列大小為488bp的目的條帶，鑑定為DHV陽性。3)血凝性DHVQL株病毒對雞、豚鼠、兔、豬紅細胞均不凝集。4)對鴨胚的半數感染量(EIDso)經測定DHVQL株病毒3代組織的毒EID5。為107°EID5。/0.2ml。5)對雛鴨的致病力測定DHVQL株病毒3代組織毒對雛鴨的致病力測定結果顯示當攻10"EIDs。時，可以使雛鴨100/100發病，即最小感染量(MID)為105°EID5。；半數感染量(瓜。)為10:"3;半數致死量(LD5。)為10278。6)穩定性將DHVQL株經尿囊腔內接種910日齡無特異性病原(SPF)雞胚傳10代，每0.2ml病毒含量均在10"EID5。以上，則DHVQL株在10代以內是穩定的，可以作為疫苗生產用種毒。7)免疫原性為了DHVQL株的疫苗研究，進行了免疫原性試驗，結果顯示DHVQL株E2E10代均具有良好的免疫原性。8)特異性將毒種稀釋至10"EID5。/0.2ml，與等量抗鴨肝炎病毒特異性血清混合，室溫放置l小時後，接種SPF雞胚10個，觀察120小時。在24120小時內不引起特異性死亡，且至少存活8個。2鴨病毒性肝炎滅活疫苗的製備步驟為-生產用種毒製備一制苗用毒液的製備一孵育與觀察一收穫一滅活一乳化—配苗一分裝一28。C保存。1)生產用種毒製備將毒種用滅菌生理鹽水稀釋至l(T3，尿囊腔內接種910日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，接種後96小時，置04'C冷卻424小時，收穫胚液，選擇無細菌生長、病毒含量》106°EID5。/0.2ral的胚液作為生產用毒種。2)制苗用毒液的製備選擇發育良好、910日齡的易感雞胚作為制苗用材料。取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作10—2稀釋，尿囊腔內接種910日齡非免疫雞胚，每胚0.2ral，接種後密封針孔，置3637。C繼續孵育。3)孵育與觀察雞胚接種後每日照蛋1次，24小時以前死亡的雞胚棄去。以後每46小時照蛋1次，死亡的雞胚隨時挑出，置28。C保存，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置於28。C冷卻424小時。4)收穫將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然後以無菌手術剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊腔膜及羊膜(謹防卵黃破裂)，吸取胚液。對每個雞胚在吸取胚液前均應注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何汙染可疑者，棄去不用。每若干個雞胚分為一組，吸取胚液放於同一滅菌的容器內，每組抽樣，應無細菌生長，28'C保存。5)滅活將檢驗合格的雞胚液分別進行滅活，加入甲醛至總量的0.2%。然後在37'C滅活40小時(以瓶內溫度達到37卩開始記時)，期間振搖34次。滅活後2『C保存。6)乳化按常規方法製備油佐劑疫苗(參見《中國獸藥典》)。油相製備取注射用白油94份，加司本-806份，混合後，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相製備取滅菌吐溫-804份，加入滅活胚液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相2份放於乳化缸內，開動電機慢速轉動攪拌，同時緩慢加入水相l份，加完後再以10000r/min攪拌25分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。7)分裝定量分裝，加蓋密封，28'C保存。3鴨病毒性肝炎滅活疫苗的檢驗方法(1)物理性狀外觀應為為乳白色乳狀液。劑型為油包水型(W/0)。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴於冷水中，應呈油滴狀，不擴散。粘度用lml吸管(出口內徑為1.2mm)，吸取25。C左右的疫苗，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，應不超過8秒。穩定性在37'C左右條件下放置21日或將疫苗5ml加入離心管，經3000r/min離心15分鐘，應不破乳。不符合規定者判為不合格。(2)無菌檢驗按《中國獸藥典》規定進行，應為無菌生長。(3)安全檢驗用37日齡的櫻桃谷鴨10隻，各頸部皮下注射疫苗lml，觀察14日，應不出現由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應。(4)效力檢驗用l日齡左右的櫻桃谷鴨10隻，各皮下注射疫苗0.3ml，21日時，連同條件相同的對照鴨5隻，各腿部肌肉注射1(TEID5。強毒，觀察7日，應全部健活。(5)甲醛、硫柳汞含量測定按《中國獸藥典》的規定方法進行測定，其甲醛溶液量(40°/。甲醛)不應超過0.2%;汞類防腐劑殘留量應不超過0.01%。本發明的優點本發明是利用本發明人由野外分離得到的一株擁有優良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株作為生產疫苗的病毒株，接種到易感雞胚上，收穫胚液，滅活後乳化，製成一種安全、有效的鴨病毒性肝炎疫苗。本發明有針對性的防制鴨肝炎病毒感染，擬補了市場上的空白，為控制養殖場鴨病毒性肝炎的擴散提供了條件。實施例以下實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例1DHVQL株病毒種子病毒的純淨性檢驗1)無菌檢驗T.G、G.P小管和G.A斜面培養基均未觀察到菌落。2)支原體檢驗在觀察期內，未發現小瓶和小管培養物顏色出現明顯變化，移植的液體培養物在固體培養基上無"煎蛋"狀支原體菌落。3)外源病毒檢驗兩組雞胚7日內全部存活，剖檢胎兒發育正常，絨毛尿囊膜無病變，雞胚液無血凝性。DHVQL株病毒中未見細菌、黴菌和支原體生長，無外源病毒汙染，證明其是純淨的。實施例2疫苗製備1毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水稀釋至10—3，尿囊腔內接種910日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，接種後96小時，置04'C冷卻424小時，收穫胚液，選擇無細菌生長、病毒含量>l(TEID5。/0.2ml的胚液作為生產用毒種。2制苗用毒液的製備選擇發育良好、910日齡的易感雞胚作為制苗用材料。取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作10—2稀釋，尿囊腔內接種910日齡非免疫雞胚，每胚0.2ml，接種後密封針孔，置3637。C繼續孵育。3孵育與觀察雞胚接種後每日照蛋l次，24小時以前死亡的雞胚棄去。以後每46小時照蛋1次，死亡的雞胚隨時挑出，置28。C保存，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置於28。C冷卻424小時。4收穫將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然後以無菌手術剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊腔膜及羊膜(謹防卵黃破裂)，吸取胚液。對每個雞胚在吸取胚液前均應注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何汙染可疑者，棄去不用。每若干個雞胚分為一組，吸取胚液放於同一滅菌的容器內，每組抽樣，應無細菌生長，28'C保存。5滅活將檢驗合格的雞胚液分別進行滅活，加入甲醛至總量的0.2%。然後在37'C滅活40小時(以瓶內溫度達到37C開始記時)，期間振搖34次。滅活後28。C保存，應不超過一個月。6乳化油相製備取注射用白油94份，加司本-806份，混合後，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相製備取滅菌吐溫-804份，加入滅活胚液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相2份放於乳化缸內，開動電機慢速轉動攪拌，同時緩慢加入水相l份，加完後再以10'000r/min攪拌25分鐘，在終止攪拌前加入P/。硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。7分裝定量分裝，加蓋密封，28'C保存。實施例3疫苗的成品檢驗(1)物理性狀外觀應為為乳白色乳狀液。劑型為油包水型(W/0)。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴於冷水中，應呈油滴狀，不擴散。粘度用lml吸管(出口內徑為1.2mm)，吸取25'C左右的疫苗，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，應不超過8秒。穩定性在37。C左右條件下放置21日或將疫苗5ml加入離心管，經3000r/min離心15分鐘，應不破乳。不符合規定者判為不合格。(2)無菌檢驗按《中國獸藥典》規定進行，應為無菌生長。(3)安全檢驗用37日齡的櫻桃谷鴨10隻，各頸部皮下注射疫苗lml，觀察14日，應不出現由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應。(4)效力檢驗用1日齡左右的櫻桃谷鴨10隻，各皮下注射疫苗0.3ml，21日時，連同條件相同的對照鴨5隻，各腿部肌肉注射105°EID5。強毒，觀察7日，應全部健活。(5)甲醛、硫柳汞含量測定按《中國獸藥典》的規定方法進行測定，其甲醛溶液量(40%甲醛)不應超過0.2%;汞類防腐劑殘留量應不超過0.01%。實施例4鴨病毒性肝炎滅活疫苗的安全性試驗本發明人利用鴨肝炎病毒QL株研製出鴨病毒性肝炎滅活疫苗，我們對其進行了安全性試驗的研究。1各種劑量對不同日齡櫻桃谷雛鴨的安全性試驗將3個批次(0704001、0704002、0704003)的疫苗，頸部皮下接種1日齡、3日齡、5日齡櫻桃谷鴨雛鴨，每組10隻，0.3ml/只。接種後觀察14天內，所有雛鴨接種部位未出現腫脹，未見全身不良反應。2單劑量重複使用的安全性試驗將0704001批次的疫苗頸部皮下接種3日齡櫻桃谷雛鴨種鴨各10隻，每周1次，每次0.3ml，重複3次；頸部皮下接種30周齡種鴨10隻，每周1次，每次0.5ml，重複3次。最後1次接種後2周，鴨接種部位未出現腫脹，也未見全身不良反應。3—次超劑量接種的安全試驗將3個批次(0704001、0704002、0704003)的疫苗，分別頸部皮下注射接種IO只3日齡雛鴨，1ml/只；10隻種鴨2ml/只。超劑量接種的10隻3日齡雛鴨和IO只種鴨，接種後觀察14天，所有鴨未接種部位未出現腫脹，未見全身不良反應。4疫苗對產蛋鴨生產性能的影響試驗取0704001批疫苗，將處於產蛋高峰期的28周齡產蛋鴨100隻分為2組，每組50隻，其中1組每隻肌肉注射疫苗0.5ml，另外1組每隻肌肉注射疫苗lml，另取50隻同條件的鴨作為對照，肌肉注射生理鹽水，每隻0.5ml，同條件下飼養，觀察2周，免疫鴨只對疫苗的應激反應很小，採食正常，精神良好，產蛋量和和體重未受影響，與對照組相比，各種生產性能指標無明顯差異。具體結果見表L表l疫苗對產蛋高峰期蛋鴨的影響tableseeoriginaldocumentpage10以3批疫苗進行安全性檢驗，頸部皮下或肌肉注射1日齡、3日齡和5日齡雛鴨，2周後觀察，接種部位無腫脹，無全身不良反應；以0.3ml/只劑量連續3次接種3日齡鴨和以0.5ml/只劑量連續3次接種28周齡種鴨，接種後，接種部位無腫脹，無全身不良反應，說明疫苗對鴨只是安全的。以lnil/只劑量接種3日齡鴨和以2ml/只劑量連接種28周齡種鴨，接種後，接種部位無腫脹，無全身不良反應，說明超劑量接種疫苗對鴨只是安全的。以0.5ml劑量和lml劑量免疫處於產蛋高峰期的蛋鴨，觀察結果表明，疫苗對鴨的應激反應小，對其體重產蛋量沒有影響。實施例5鴨病毒性肝炎滅活疫苗效力試驗本發明人利用鴨肝炎病毒QL株研製出3批(0704001、0704002、0704003)鴨病毒性肝炎滅活疫苗，經過實驗室安全試驗證明，疫苗對鴨是安全的，在此基礎上我們又對其進行了免疫效力試驗的研究。1.對雛鴨的效力試驗將i日齡櫻桃谷鴨分為IO個組，每組10隻，其中1組作為對照。取3個不同批號的疫苗，每批疫苗分3個注射劑量，頸部皮下注射O.lml/只、0.3ml/只和0.5ml/只，21曰時，連同對照鴨10隻，各肌肉注射106°EID5DHVQL株強毒，觀察14日，0.lml劑量組攻毒保護在8/10以上，0.3ml劑量組和0.5ml劑量組攻毒保護均為10/10，對照組10/10發病或死亡，具體結果見表l。2.對種鴨的效力試驗將產蛋前1個月左右的櫻桃谷鴨分為10個組，每組10隻，其中1組作為對照。取3個不同批號的疫苗，每批疫苗分3個注射劑量，頸部皮下注射0.5ml/只、lml/只和1.5m1/只。將種鴨生產時，將孵出的鴨蛋孵化至雛鴨7日齡時，連同對照鴨所孵7日齡雛鴨，每組均為10隻，各肌肉注射105°EID5。QL株強毒，觀察14日，0.5ml劑量組攻毒保護均在8/10以上，lml劑量組和1.5ml劑量組攻毒保護均為10/10，對照組10/10發病或死亡，具體結果見表2。表2鴨病毒性肝炎滅活疫苗效力試驗結果疫苗批號雛鴨效力試驗種鴨效力試驗疫苗劑量鴨數攻毒劑量EID50攻毒保護數疫苗劑量鴨數攻毒劑量EID50攻毒保護數07040010.1ml101058/100.5ml101058/100.3ml1010510/101,0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/1007040020.1ml101058/100.5ml101059/100.3ml1010510/101.0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/1007040030.1ml101059/100.5ml101058/100.3ml1010510/101.0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/10對照組/101050/10/101050/10就次力試驗表明，以O.lml劑量免疫l日齡櫻桃谷雛鴨，攻毒保護率在80%以上，以0.3ml劑量和0.5ml劑量進行免疫，攻毒保護率為100%,對照組全部發病或死亡，保護率為O;以0.5ml劑量免疫產蛋前l個月左右的櫻桃谷種鴨，所孵雛鴨攻毒保護率在80%以上，以1.Oml劑量和1.5ml劑量進行免疫，，所孵雛鴨攻毒保護率為100%，對照組全部發病或死亡，保護率為O。序列表齊魯動物保健品有限公司—種鴨病毒性肝炎滅活疫苗及其製備方法2<170〉118DNA人工序列對人工序列的描述鴨肝炎病毒PCR引物P11ACAGGAGCCAAGGGTTAT18218DNA人工序列對人工序列的描述鴨肝炎病毒PCR引物P22GCCAGGTGGTTGATGTAA18權利要求1.一種鴨病毒性肝炎滅活疫苗，其特徵是將本疫苗含有保藏號為CGMCCNo.3202的經滅活的鴨病毒性肝炎病毒。2.—種鴨病毒性肝炎滅活疫苗的製備方法，其特徵是將保藏號為CGMCCNo.3202的生產用種毒，用滅菌生理鹽水作10—2稀釋，經尿囊腔內接種910日齡的易感雞胚，每胚0.2ml，密封針孔，37X:繼續孵化96h，置於28'C冷卻424h，無菌收穫吸取胚液，將檢驗合格的雞胚液加入甲醛至總量的0.2%，然後在37'C滅活40h，按常規法製備成油佐劑滅活疫苗。全文摘要本發明涉及一種鴨肝炎滅活疫苗及其製備方法。是利用本發明人由野外分離得到的一株擁有優良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒CGMCCNo.3202株作為生產疫苗的病毒株，接種到易感雞胚上，收穫胚液，滅活後乳化，製成一種安全、有效的鴨病毒性肝炎疫苗。本發明有針對性的防制鴨病毒性肝炎病毒感染，擬補了市場上的空白，為控制養殖場鴨病毒性肝炎的擴散提供了條件。文檔編號A61K39/29GK101612397SQ20091015792公開日2009年12月30日申請日期2009年7月17日優先權日2009年7月17日發明者徐龍濤,李秀娟,蕾王,禚寶山申請人:齊魯動物保健品有限公司