用於診斷感染的螢光化合物、其製備方法和應用的製作方法

2023-06-23 03:46:26 3

專利名稱：用於診斷感染的螢光化合物、其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及藥物組合物，其用於臨床診斷傳染病(優選眼科疾病)、以及用於鑑定 微生物。
背景技術：
對於某些危害眼睛之疾病的預防及正確治療要求對可引發該器官感染的各種微 生物進行鑑定。如不儘早進行診斷和治療，很多此類眼部感染會對患者的視力造成嚴重的 影響。因此在某些情況下有必要對直接感染該器官之病原體進行檢測，從眼睛提取易感染 組織的代表性小樣本組織碎片(活檢)或對與所述組織接觸之生理液(在此情況下即眼 淚)進行分析。對樣品中微生物進行檢測的常用方法經常是基於獲得能增加可能病原體數 量的培養物，以輔助隨後的鑑定。培養階段需要1到4天的長時間，此期間內不可使用專門 針對感染的藥品對患者進行治療，以免漏掉造成感染的病原體。然而此段較長的等待培養 時間會對受感染器官產生極為嚴重的不良後果，因此應該儘可能使用能縮短正確診斷所需 時間的替代檢測方法。另一方面，為預防此類傳染病，將那些與眼睛長時間接觸的物品(如隱形眼鏡和 相應清洗液)在高度清潔的條件下進行保存和使用以確保無菌是非常重要的。與上述方法 類似，要獲得這些眼用物品本身或其保存環境是否被汙染的可靠信息，通常需要藉助費力 的微生物培養方法。在此情況下，這種以細胞培養為基礎的現有診斷技術的複雜性限制了 其應用頻率和應用範圍，從而導致使用者的感染風險增加。此外，基於使用螢光標記化合物直接添加到懷疑存在微生物之介質中，已經開發 了螢光型檢測傳染性微生物的替代技術。如果將螢光標記化合物導入傳染性微生物中，有 可能通過使用各種螢光顯示設備(如顯微鏡和流式細胞儀)檢測出感染微生物的存在及 其形態(Kawamoto, F. , Rapiddiagnosis of malaria by fluorescence microscopy with light microscopeand interference filter. Lancet 1991，337，200—202)。由於這些設備 可以識別微弱的螢光強度，因此原則上可以用很少的細胞進行正確的診斷，這就在一定程 度上縮短了診斷時間。然而，因螢光標記物缺乏特異性，直接使用螢光標記物檢測眼部感染 的方法受到了很大的限制，這是由於傳統螢光標記與眾多眼科致病微生物的親和力和其與 健康眼之細胞和組織的親和力非常相似，使得用螢光標記對相應病原體進行區分出現了困 難。本發明目的在於使用一種簡單且經濟的方法來提高螢光標記物對感染機體的親 和力。這種新方法是通過將螢光標記物附著在一類具有相對簡單分子結構的化合物上來實 現的，這些化合物對病原體表現出遠高於它對健康眼細胞的親和力。這些化合物在本發明 中用於將螢光標記選擇性導入病原體，它們屬於烷基磷脂類，其中包括例如米替福新(MT)、 依地福新(ET)和伊莫福新(IM) (Croft, S. L ；Engel, J.，Miltefosine-discovery ofthe antileishmanial activity of phospholipid derivatives. Trans R Soc TropMed Hyg 2006,100 Suppl 1，S4_8)。
米替福新(MT)現用於乳腺癌皮膚轉移瘤的治療，在市場上以商品名MILTEX 銷售。此外因MT表現出很強的抗寄生蟲活性，在哥倫比亞、印度和德國其以商品名 IMPAVIDOaentaris股份有限公司)而被應用於人利什曼病的治療(Soto，J. ；Soto, P.， Miltefosine :oral treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther 2006, 4，(2)，177-85)。最近MT開始被用於犬利什曼病的治療，商品名為MILTEFORAN(Virbac)。 此外，已經發現MT對其他原生動物也有細胞毒活性，如毛滴蟲CTrichomonas) (BIaha, C ；Duchene, M. ；Aspock, H. ；ffalochnik, J. , Invitro activity of hexadecylphospho choline (miltefosine)againstmetronidazole-resistant and—susceptible strains of Trichomonas vaginalis. J Antimicrob Chemother 2006,57, (2),273-8)>
個生 H^ E (Entamoeba histolytica) (Seifert, K. ；Duchene, Μ. ；Wernsdorfer, W. H.； Kollaritsch, H. ；Scheiner, 0. ；ffiedermann, G. ；Hottkowitz, T. ；Eibl, H. , Effects of miltefosine and other alkylphosphocholines on human intestinalparasite Entamoeba histolytica. Antimicrob Agents Chemother 2001,45, (5),1505-10)、 自由生活的阿米巴原蟲(如棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)或納氏蟲(Naegleria sp.)) (Schuster, F. L ；Guglielmo, B. J. ；Visvesvara, G. S. , In-vitro activity of miltefosine and voriconazole on clinical isolates offree-living amebas Balamuthia mandrillaris, Acanthamoeba spp. , andNaegleria fowleri. J Eukaryot Microbiol 2006,53, (2),121-6 ；ffalochnik, J. ；Duchene, M. ；Seifert, K. ；Obwaller, Α. ；Hottkowitz, T. ；ffiedermann, G. ；Eibl, H. ；Aspock, H. , Cytotoxic activities of alkylphosphocholines againstclinical isolates of Acanthamoeba spp. Antimicrob Agents Chemother 2002，46，(3)，695-701)，對人類以及其他人類病原體有致病作用，包 括真菌、酵母菌(Obando，D. ；Widmer, F. ；Wright, L. C ；Sorrel 1, Τ. C Jolliffe, K. Α.， Synthesis, antifungal and antimicrobial activity of alkylphospholipids. Bioorg Med Chem 2007,15, (15),5158-65 ；Widmer, F. ；Wright, L. C ；Obando, D. ；Handke, R.； Ganendren, R. ；Ellis, D. H. ；Sorrell, Τ. C. , Hexadecylphosphocholine (miltefosine) has broad-spectrum fungicidalactivity and is efficacious in a mouse model of cryptococcosis. AntimicrobAgents Chemother 2006,50, (2), 414—21)禾口 月市炎鏈球菌 (Streptococcuspneumoniae)(Llull, D. , Rivas, L. , Garcia, Ε. In vitro bactericidal activityof the antiprotozoal drug miltefosine against Streptococcus pneumoniaeand other pathogenic streptococci. Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51， (5) :1844-8)。對於MT在上述生物體內發揮其細胞毒作用的詳細作用機制，我們還知之甚 少。針對一些特定寄生蟲的最新研究表明，這種構造可能是多靶標類型的，因為MT在上 述寄生蟲的細胞內濃度很高，在利什曼蟲中達到了毫摩爾/升範圍的值(Luque-Ortega， J. R. ；Rivas, L.，Miltefosine(hexadecylphosphocholine)inhibits cytochrome c oxidase in Leishmaniadonovani promastigotes. Antimicrob Agents Chemother 2007， 51，(4),1327-32 ；Saugar, J. M. ；Delgado, J. ；Hornillos，V. ；Luque-Ortega，J. R.； Amat-Guerri, F. ； ActinR9 Α. U. ；Rivas, L，Synthesis and BiologicalEvaluation of Fluorescent Leishmanicidal Analogues οfHexadecylphosphocholine(Miltefosine)as Probes of AntiparasiteMechanisms. J Med Chem 2007，50， (24)，5994—6003)。 @ 一假設還得到了利什曼原蟲中出現MT耐藥菌株現象的支持，因為只有在藥物特異性轉運 到寄生蟲體內存在功能缺陷時才會產生上述耐藥菌株Geifert，K. ；Perez-Victoria, F. J. ；Stettler, Μ. ；Sanchez-Canete, Μ. P. ；Castanys，S. ；Gamarrο, F. ；Croft，S. L, Inactivation of the miltefosine transporter，LdMT，causes miltefosine resistance that is conferred to the amastigotestage of Leishmania donovani and persists in vivo.Int J Antimicrob Agents2007，30，(3)，229-35 ；Perez-Victoria, F. J.； Sanchez-Canete, Μ. P. ；Seifert，K. ；Croft, S. L ；Sundar, S. ；Castanys, S. ；Gamarrο, F.， Mechanisms ofexperimental resistance of Leishmania to miltefosine !Implications forelinical use. Drug Resist Updat 2006，9，(1-2)，26-39 ；Perez-Victoria, F. J.； Sanchez-Canete, Μ. P. ；Castanys, S. ；Gamarrο, F.，Phospholipidtranslocation and miltefosine potency require both L. donovanimiltefosine transporter and the new protein LdRos3 in Leishmaniaparasites.J Biol Chem 2006，281，(33)， 23766-75 ；Perez-Victoria, F. J. ；Gamarrο, F. ；Ouellette，Μ. ；Castanys, S.，Functional cloning of themiltefosine transporter. A novel P-type phospholipid translocase fromLeishmania involved in drug resistance.J Biol Chem 2003，278，(50)， 49965-71)。這些特異性運載蛋白屬於氨基磷脂類轉位酶家族，但是這種轉運蛋白的準確 鑑定僅僅在以下生物中實現杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovmi)(鑑定為LdMT3) (Perez-Victoria, F. J. ；Gamarro, F. ；Ouellette，Μ. ；Castanys, S.，Functional cloning of the miltefosinetransporter. A novel P-type phospholipid translocase from Leishmaniainvolved in drugresistance. J Biol Chem 2003，278，(50)，49965-71)以 ^ Sl S # # (Saccharomyces cerevisiae) ( ^ ^ ^ Lem3) (Hanson, P. K. ；Malone, L.； Birchmore, J. L. ；Nichols，J. W.，Lem3p is essential for the uptake andpotency of aIkylphosphocholine drugs，edelfosine and miltefosine.J BiolChem 2003，278， (38)，36041-50)。在利什曼原蟲中轉運蛋白突變解釋了利什曼蟲中米替福新和依地福新 抗藥性的出現，並隨之產生對放射性米替福新導入寄生蟲中的抑制；此外在喪失Lem3功 能的釀酒酵母菌中出現了對導入螢光磷脂NBD-PC的抑制，這與依地福新抗藥性表型有關， 是由於藥物導入缺陷造成的，儘管這種作用尚未經實驗測試(Hanson，P. K. ；Malone, L； Birchmore, J. L ；Nichols, J. W. , Lem3p is essential for theuptake and potency of alkylphosphocholine drugs,edelfosine andmiltefosine. J Biol Chem 2003,278, (38), 36041-50)。從與本發明相關的前期研究得出的結論可以總結如下i)MT和其他類似的烷基 磷脂可選擇性進入低等真核生物和轉化細胞中；ii)這些藥物的致死作用與大量藥物進入 細胞內有關；iii)MT抗藥性機制已經在多種類型寄生蟲中鑑定，這是由於藥物在這些寄生 蟲體內積累的缺陷而造成的。近期印度和尼泊爾開始在內臟感染利什曼病的患者身上大量使用MT，尤其是 針對那些已對含銻藥物治療產生耐藥性的患者(Sundar, S. ；Chatterjee, M.，Visceral leishmaniasis-current therapeutic modalities. Indian J Med Res 2006,123, (3),345-52)；一些南美洲國家將該方案應用於犬利什曼病的治療(Soto, J. ；Soto, P.，Miltefosine :oral treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther 2006, 4，(2)，177-85)。由於醫院在這種治療上很難正確控制藥量，可以預計將很快出現對MT 產生耐藥性的寄生蟲。動物模型實驗表明，耐藥性寄生蟲(由於MT轉運蛋白缺陷)與 對藥物敏感的寄生蟲有相同的毒力(Seifert, K. ；Perez-Victoria, F. J. ；Stettler, Μ.； Sanchez-Canete, Μ. P. ；Castanys, S. ；Gamarro, F. ；Croft, S. L. , Inactivation of the miltefosine transporter, LdMT, causes miltefosineresistance that is conferred to the amastigote stage of Leishmaniadonovani and persists in vivo. Int J Antimicrob Agents 2007,30, (3), 229-35) 因此，獲得快速可控的試劑和方法(正如本發 明中提出的)能對耐藥性菌株的出現做到早期檢測和應對。另一方面，目前針對眼睛中棘阿米巴原蟲(Acanthamoeba)(在有不良衛生習慣的 隱形眼鏡使用者中有特別高發病率的阿米巴感染)的早期診斷，是在先排除了皰疹和真菌 感染的可能性之後進行的，上述診斷過程的延誤隨後有時可能對視力造成不可逆轉的損 傷(Hammersmith, K. Μ. , Diagnosis and management of Acanthamoeba keratitis. Curr OpinOphthalmol 2006，17， (4)，327-31)。基於同樣的原理，還可將本發明所述化合物應用到對隱形眼鏡護理液、清洗液以 及移植角膜之保存介質的質量檢測上。最近，由於隱形眼鏡護理液被鐮刀菌汙染造成的 事故給一大批患者造成了嚴重後果，並使生產商蒙受了巨大經濟損失(Chang，D. C5Grant, G. B. ；0' Donnell, K. ；Wannemuehler, K. A. ；Noble-Wang, J. ；Rao, C. Y. ；Jacobson, L M.； Crowell, C. S. ；Sneed, R. S. ；Lewis, F. Μ. ；Schaffzin，J. K. ；Kainer, Μ. Α. ；Genese，C. Α.； Alfonso，Ε. C ；Jones，D. B. ；Srinivasan，Α. ；Fridkin，S. K. ；Park，B. J.，Multistate outbreak of Fusarium keratitis associated with useof a contact lens solution. JAMA 2006,296, (8) ,953-63 ；Centers forDisease Control and Prevent ion (CDC)， Update :Fusariumkeratitis-United States,2005-2006. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2006，55，(20)，563-4)。自由生活的原生動物群體組成了可用來檢測水質和環境汙染的生物 (Martin-Cereceda, Μ. ；Perez-Uz, B. ；Serrano, S. ；Guinea, Α. , Dynamicsof protozoan and metazoan communities in a full scale wastewatertreatmentplant by rotating biological contactors. Microbiol Res 2001,156, (3)，225-38)，因此，可利用本發明的 化合物，通過螢光類似物的積累和導入，從而對這些生物進行檢測和顯示。先前的一些研究中已經合成和使用過烷基磷脂的螢光類似物1.-先前已製備相似化合物(依地福新)的類似物，其用苯基四烯 (feniltetraeno)基團進行標記，並注意到該標記基本上不改變藥物的生物活性 (Quesada, E. ；Delgado, J. ；Gajate, C ；Mollinedo, F. ； Acufia, Α. U. ；Amat-Guerri, F., Fluorescent phenylpolyene analogues of the etherphospholipid edelfosine for the selective labeling of cancer cells. J MedChem 2004,47, (22),5333-5)。2.-已經製備了用諸如苯基四烯或苯基三烯炔(feniltrienino)基團進行標記的 MT類似物，其保持了原藥的抗寄生蟲活性，並且還能特異性進入對藥物敏感的利什曼原蟲 寄生蟲株中，但不能進入有耐藥性的寄生蟲株中(Saugar，J. Μ. ；Delgado, J. ；Hornillos, V. ；Luque-Ortega, J. R. ；Amat-Guerri, F. ； Acufia, Α. U. ；Rivas, L, Synthesis andBiologicalEvaluation of Fluorescent Leishmanicidal Analogues ofHexadecylphosp hocholine(Miltefosine)as Probes of AntiparasiteMechanisms. J Med Chem 2007,50, (24),5994-6003)。3.-已將戊烷脒DB-99的螢光類似物用於非洲錐蟲病中對含砷藥物治療有耐藥性 ；其月中(Stewart, Μ. L ；Krishna, S. ；Burchmore, R. J. ；Brun, R. ；de Koning, H. P. ；Boykin, D. W. ；Tidwell, R. R. ；Hall, J. Ε. ；Barrett, Μ. P. , Detection of arsenical drug resistance inTrypanosoma brucei with a simple fluorescence test. Lancet 2005,366, (9484)，486-7)。在布氏錐蟲中(引起上述感染的微生物)，戊烷脒和DB99通過 與含砷藥物相同的轉運蛋白進入到寄生蟲體內。因此，這種轉運蛋白的缺失和功能障礙會 抑制戊烷脒和DB-99的內化，因此也抑制其螢光標記物的內化，並且出現了含砷藥物耐藥 性的表型。

發明內容
發明簡述本發明的一個方面涉及用於區分性鑑定微生物的螢光化合物(後面將其稱為本 發明的化合物)，它包括烷基磷脂類似物和具有高度光穩定性並發射可見光譜區波長之光 的螢光基團。本發明中所用的術語「烷基磷脂類似物」是指通過合成獲得的一種化合物，其結構 與烷基磷脂的結構相似。如本發明所用，術語「烷基磷脂」是指結構中包含與親水性部分 相綴合之親脂性部分的化合物，其中所述親脂性部分由碳和氫原子之線狀或環狀組合構成 (烷基部分)，所述親水性部分由酯化或游離的磷酸基構成(磷脂)。例如但不限制本發明 的範圍，所述烷基磷脂包括十六烷基磷酸膽鹼(米替福新，MT)，1-0-十八烷基-2-0-甲 基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(依地福新，EF)和I-S-十六烷基-2-甲氧基甲基-消旋-甘 油-3-磷酸膽鹼(伊莫福新，IM)。烷基磷脂類似物的實例是示例性的，不限制本發明的範 圍，全-(E)-13-苯基十三烷-6,8,10,12-四烯基磷酸膽鹼和全_(E)-13-苯基十三烷-8， 10，12-三烯-6-炔基磷酸膽鹼。本發明中所用的術語「微生物」是指任何的原生動物、阿米巴原蟲、真菌、酵母 和細菌，例如但不限制本發明的範圍，其屬於下組利什曼原蟲(Leishmania sp)、布氏錐 蟲(Trypanosoma brucei)、克氏||1 蟲(Trypanosoma cruzi)、毛蟲(Trichomonas sp·)、 溶組織性內阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲 (Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、鍵刀菌(Fusarium sp.)、梨 ^HIMii (Tetrahymena pyriformis)禾口 BEilEimuthiEi J^jil0本發明中所用的術語「螢光基團」，是指發射可見光譜區波長之光並具有高 度光穩定性的螢光基團，例如但不限制本發明的範圍，其中包括硼二吡咯亞甲基類 (borodipirrometenos)、口佔噸類(xantenos)、羅丹明類、花青類(cianinas)、沙星類 (oxacinas)、口卜啉類、香豆素類禾口多環烴類(hidrocarburos policiclicos),它們可以具有 或不具有取代基。本發明的一個更具體方面涉及本發明的化合物，其中所述烷基磷脂類似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。
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本發明的一個更具體方面涉及本發明的化合物，其中所述烷基磷脂類似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的類似物。本發明的一個具體方面涉及本發明的化合物，其中所述螢光基團是取代或未取代 的硼二吡咯亞甲基類(BDP)。本發明的一個具體方面涉及本發明的化合物，其中所述烷基磷脂衍生物是米替福 新，並且所述螢光基團是取代或未取代的BDP。本發明的一個更具體方面涉及本發明的化合物，其是BDP-MT或肚-BDP-MT。本發明的一個具體方面涉及獲得本發明化合物的方法，其包括以下步驟i)由二乙醯基醇(dicetoalcohol)和乙醯乙酸乙酯獲得相應的取代α-H-吡咯，ii)使所述α -H-吡咯與適當的α -甲醯吡咯縮合，iii)使由此形成的二吡咯亞甲基化合物與三氟化硼乙醚反應，iv)引入磷酸膽鹼基團。本發明的另一個具體方面涉及本發明化合物在製備用於微生物鑑定方法的藥物 組合物的用途。本發明的另一個具體方面涉及診斷性藥物組合物(以下稱為本發明的診斷性藥 物組合物)，其包含本發明的化合物，例如化合物BDP-MT或肚-BDP-MT。最後，本發明的一個具體方面是本發明的診斷性藥物組合物的用途，其中本發明 的藥物組合物用於微生物鑑定方法中。本發明的另一個更具體方面涉及本發明的診斷性藥物組合物用於生物樣品的體 外診斷方法中的用途，其中所述生物樣品來自帶有傳染性疾病的人或獸醫學個體，例如但 不限制本發明的範圍，所述傳染性疾病屬於下組角膜炎、利什曼病、非洲和美洲錐蟲病、肺 炎鏈球菌肺炎、阿米巴病、滴蟲病和黴菌病。本發明的另一個更具體的實施方案涉及本發明藥物組合物的用途，其中所述 傳染性疾病是由微生物引起，例如但不限制本發明的範圍，所述微生物屬於下組利什 曼原蟲(Leishmania sp)、布氏維蟲(Trypanosomabrucei)、克氏維蟲(Trypanosoma cruzi)、^itil& (Trichomonas sp.) ,Μ^ ^ E (Entamoeba histolytica) Λ 阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、,廉刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜蟲(Tetrahymena pyriformis)禾口 Balamuthia本發明的另一個更具體實施方案涉及本發明診斷性藥物組合物的用途，其用於源 自眼睛的生物樣品的診斷方法中，例如所述樣品由角膜刮削獲得。本發明的另一個更具體實施方案涉及本發明診斷性藥物組合物的用途，其用於鑑 定既非人也非動物之樣品中微生物的方法中，例如在水、人工眼睛、隱形眼鏡、隱形眼鏡護 理液或角膜保存介質中。發明詳述本發明的基礎在於，發明人已經發現，生物活性的烷基磷脂類似物(例如化合物 BDP-MT或肚-BDP-MT)在其結構中含有發射可見光譜區波長為400-700nm之光的高度光穩 定性的焚光基團(Slavik, J. , FluorescentProbes in Cellular and Molecular Biology led. ；CRC Press =Boca Raton, FL, 2004 ；ρ 320)，它們很容易被導入微生物中，並且這種導入可通過常規螢光顯微鏡來檢測。因此，圖像診斷專家可以很容易地識別出是否存在能夠 導入上述化合物的微生物，如真菌、原生動物、甚至一些細菌如肺炎鏈球菌等。同時，一旦鑑 定其物種，所述專家就能夠推斷出對烷基磷脂治療的潛在耐藥性，這種耐藥性與化合物導 入缺陷以及對烷基磷脂細胞毒性之抗性的表型有直接關係。因此可以將螢光類似物加入到懷疑有微生物存在的培養基或組織中，以檢測是否 存在微生物。例如，將含有所述化合物的藥物組合物直接施加到角膜上。如果確實如此，所 述螢光類似物會迅速標記出這些微生物，以便用常規顯微鏡觀察對微生物進行視覺鑑定。 此外，如果所述生物含有原始藥物MT的特異性轉運蛋白，將會在微生物內觀察到迅速出現 螢光。相反，如果所述生物對MT有耐藥性，在相同條件下則不能在寄生蟲體內觀察到螢光 的出現。用這種方式即能獲得可迅速簡單地診斷這些微生物是否存在和/或是否存在對原 藥MT之耐藥性的方法。更具體來說，例如作為本發明的具體實例，已經合成並生物學測試了一系列的MT 螢光類似物，其特徵在於其將硼二吡咯亞甲基螢光基團(BDP)引入了所述化合物的脂肪鏈 中(見實施例)。當將上述類似物添加到存在棘阿米巴營養體和真菌菌絲的生理介質中時， 所述類似物將會迅速被導入上述兩種微生物體內，使其恰當顯現，以便隨後根據其形態特 徵進行有效的個體鑑定。該方法將有助於對眼中微生物進行區分性診斷，因為有可能將所 述化合物以滴眼液形式施加到眼睛以直接進行觀察。此外，上述方法還可用於診斷生物組 織或生理液樣品(如角膜碎屑)中是否存在微生物，或者用於檢驗移植角膜保存液體或隱 形眼鏡清潔護理液。下面提到的是這些化合物的可能應用，基於迄今為止已經實施並在現有技術中總 結的研究1.-快速可靠地診斷視覺疾病，如由真菌或阿米巴(棘阿米巴)感染引起的角膜 炎。2.-快速可靠地診斷人工眼睛(隱形眼鏡等)、隱形眼鏡護理液或角膜保存介質是 否被汙染(首先要檢測上述介質中是否存在病原微生物)。3.-快速診斷患者或動物(狗)是否感染了抗寄生蟲藥米替福新的耐藥性利什曼 菌株，檢測來自上述病患的生理液體(包括外周血)、組織活檢和樣品中是否存在有耐藥性 的寄生蟲。4.-快速診斷環境衛生程度，對與環境相關的水體系中的自由生活原生動物進行鑑定。5.-基於這些螢光類似物在不同器官和實驗動物組織中的區分性鑑定，使用生物 成像技術，在細胞研究和動物實驗中，對米替福新以及類似烷基磷脂的藥理學和生物學性 質，進行宏觀和分子水平的研究。因此，本發明的一個方面涉及用於區分性鑑定微生物的螢光化合物(隨後將稱為 本發明的化合物)，它包括烷基磷脂類似物物和具有高度光穩定性並發射可見光譜波長區 之光的螢光基團。本發明中所用的術語「烷基磷脂類似物」是指通過合成獲得的一種化合物，其結構 與烷基磷脂的結構相似。如本發明所用，術語「烷基磷脂」是指結構中包含與親水性部分 相綴合之親脂性部分的化合物，其中所述親脂性部分由碳和氫原子之線狀或環狀組合構成(烷基部分)，所述親水性部分由酯化或游離的磷酸基構成(磷脂)。例如但不限制本發明 的範圍，所述烷基磷脂包括十六烷基磷酸膽鹼(米替福新，MT)，1-0-十八烷基-2-0-甲 基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(依地福新，EF)和I-S-十六烷基-2-甲氧基甲基-消旋-甘 油-3-磷酸膽鹼(伊莫福新，IM)。烷基磷脂類似物的實例是示例性的，不限制本發明的範 圍，全-(E)-13-苯基十三烷-6,8,10，12-四烯基磷酸膽鹼和全_(E)-13-苯基十三烷-8， 10，12-三烯-6-炔基磷酸膽鹼。本發明中所用的術語「微生物」是指任何的原生動物、阿米巴原蟲、真菌、酵母 和細菌，例如但不限制本發明的範圍，其屬於下組利什曼原蟲(Leishmania sp)、布氏錐 蟲(Trypanosoma brucei)、克氏||1 蟲(Trypanosoma cruzi)、毛蟲(Trichomonas sp·)、 溶組織性內阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲 (Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、鍵刀菌(Fusarium sp.)、梨 ^HIMii (Tetrahymena pyriformis)禾口 BEilEimuthiEi J^jil0本發明中所用的術語「螢光基團」，是指發射可見光譜區波長之光並具有高 度光穩定性的螢光基團，例如但不限制本發明的範圍，其中包括硼二吡咯亞甲基類 (borodipirrometenos)、口佔噸類(xantenos)、羅丹明類、花青類(cianinas)、沙星類 (oxacinas)、口卜啉類、香豆素類禾口多環烴類(hidrocarburos policiclicos),它們可以具有 或不具有取代基。本發明的一個更具體方面涉及本發明的化合物，其中所述烷基磷脂類似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。本發明的一個更具體方面涉及本發明的化合物，其中所述烷基磷脂類似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的類似物。本發明的一個具體方面涉及本發明的化合物，其中所述螢光基團是取代或未取代 的硼二吡咯亞甲基類(BDP)。本發明的一個具體方面涉及本發明的化合物，其中所述烷基磷脂衍生物是米替福 新，並且所述螢光基團是取代或未取代的BDP。本發明的一個更具體方面涉及本發明的化合物，其是BDP-MT或肚-BDP-MT。本發明的一個具體方面涉及獲得本發明化合物的方法，其包括以下步驟i)由二乙醯基醇和乙醯乙酸乙酯獲得相應的取代α-H-吡咯，ii)使所述α -H-吡咯與適當的α -甲醯吡咯縮合，iii)使由此形成的二吡咯亞甲基化合物與三氟化硼乙醚反應，iv)引入磷酸膽鹼基團。本發明的另一個具體方面涉及本發明化合物在製備用於微生物鑑定方法的藥物 組合物的用途。本發明的另一個具體方面涉及診斷性藥物組合物(以下稱為本發明的診斷性藥 物組合物)，其包含本發明的化合物，例如化合物BDP-MT或肚-BDP-MT。最後，本發明的一個具體方面是本發明的診斷性藥物組合物的用途，其中本發明 的藥物組合物用於微生物鑑定方法中。本發明的另一個更具體方面涉及本發明的診斷性藥物組合物用於生物樣品的體 外診斷方法中的用途，其中所述生物樣品來自帶有傳染性疾病的人或獸醫學個體，例如但不限制本發明的範圍，所述傳染性疾病屬於下組角膜炎、利什曼病、非洲和美洲錐蟲病、肺 炎鏈球菌肺炎、阿米巴病、滴蟲病和黴菌病。本發明的另一個更具體的實施方案涉及本發明藥物組合物的用途，其中所述 傳染性疾病是由微生物引起，例如但不限制本發明的範圍，所述微生物屬於下組利什 曼原蟲(Leishmania sp)、布氏維蟲(Trypanosomabrucei)、克氏維蟲(Trypanosoma cruzi)、^itilg (Trichomonas sp.) ,M^RiH Ητ|< E (Entamoeba histolytica) Λ 阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、,廉刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜蟲(Tetrahymena pyriformis)禾口 Balamuthia本發明的另一個更具體實施方案涉及本發明診斷性藥物組合物的用途，其用於源 自眼睛的生物樣品的診斷方法中，例如所述樣品由角膜刮削獲得。本發明的另一個更具體實施方案涉及本發明診斷性藥物組合物的用途，其用於鑑 定既非人也非動物之樣品中微生物的方法中，例如在水、人工眼睛、隱形眼鏡、隱形眼鏡護 理液或角膜保存介質中。


圖1.-通過中間體1至5，合成螢光類似物BDP-MT和K-BDP-MT。圖2.-杜氏利什曼原蟲前鞭毛體中米替福新耐藥性的差異性檢測(MH0M/ET/67/ L82菌株)。MT敏感型(WT)(上行)或耐藥性(R40)(底行)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體在
下與7.5μΜ BDP-MT —起孵育2小時，用牛血清蛋白(BSA)將其清洗三次，然後用激發 波長為488nm、檢測波長範圍為502-555nm的共聚焦顯微鏡進行觀察。圖3.-用BDP-MT對兩種不同形式的卡氏棘阿米巴(Acanthamoebacastellanii) 進行差異性染色。卡氏棘阿米巴的包囊(a)和營養體(b)在32°C下與5μΜ BDP-MT—起 孵育15分鐘，用BSA溶液(10mg/ml)進行清洗，然後用激發波長為488nm、檢測波長範圍為 502-555nm的共聚焦顯微鏡進行觀察。圖4.-用BDP-MT對鐮刀菌和兩種形式之卡氏棘阿米巴同時進行差異性染色。卡 氏棘阿米巴的營養體(a)和包囊(b)、連同鐮刀菌的菌絲(c)與5 μ MBDP-MT 一起孵育15分 鍾，隨後用BSA溶液進行清洗，然後用激發波長為488nm、檢測波長範圍為502-555nm的共聚 焦顯微鏡進行觀察。圖5.-用ET-BDP-MT對鐮刀菌和兩種形式之卡氏棘阿米巴同時進行差異性染色。 卡氏棘阿米巴的營養體(a)和包囊(b)、連同鐮刀菌的菌絲(c)與5 μ MEt-BDP-MT在30°C 下一起孵育15分鐘，隨後用BSA進行清洗，然後用帶有CCD相機和480-520nm發射波長濾 光片的螢光顯微鏡觀察螢光。圖6.-用BDP-MT對梨形四膜蟲(作為自由活動的原生動物)染色。梨形四膜蟲 與5 μ M BDP-MT 一起孵育4小時，然後用2%多聚甲醛清洗並固定，以避免其在成像過程中 移動。最後用激發波長為488nm、發射檢測範圍為502-555nm的共聚焦顯微鏡觀察梨形四膜 蟲的細胞。實施例實施例1.結構中添加可見光區螢光基團的兩種米替福新類似物的製備BDP-MT和 K-BDP-MT。從相應的吡咯開始，通過相似的兩步法方法，獲得這兩種相似的包含硼二吡咯亞 甲基類(BDP)生色團的螢光類似物(圖1)。從而，在三氯氧磷存在下，使得α-H-吡咯3 與2-甲醯-3，5-二甲基-IH-吡咯縮合或者與2-甲醯-3，5-二甲基-4-乙基-IH-吡咯 縮合(MacDonald反應)。在三乙胺存在下，通過與三氟化硼乙醚反應，所形成的相應吡咯 亞甲基在原位轉化為各自相應取代的BDP染料4和5。在最後的合成步驟中，在三甲基胺 存在下通過與2-氯-1，3，2- 二氧磷雜環戊烷-2-氧化物反應從而引入磷酸膽鹼基團。如 下獲得前體化合物在碳酸鉀和冠醚18-冠-6存在下，使得乙醯丙酮與11-溴-1-十一烷 醇在丙酮中通過單烷基取代作用來獲得所述二乙醯基醇；乙氧羰基吡咯2由以下兩步形 成1)乙醯乙酸乙酯用亞硝酸酸鈉處理，幻在1存在下，所得的羥亞胺化合物用鋅/乙酸還 原(Johnson-Knorr合成)。通過用水/乙醇中氫氧化鈉處理使得2脫羧基從而獲得所述 α -H-吡咯3。2-甲醯-3，5- 二甲基-IH-吡咯是一種商業產品，而對應的2_甲醯-4-乙 基-3，5-二甲基-IH-吡咯是在二甲基甲醯胺中通過用三氯氧磷使2，5-二甲基-3-乙 基-IH-吡咯(kriptopirrol)甲醯化而獲得的。實施例2.通過引入BDP-MT螢光類似物來診斷是否存在對米替福新藥物敏感或有 耐藥性的利什曼寄生蟲。杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的MH0M/ET/67/L82菌株和米替福新耐藥菌株由Simon Croft教授(倫敦熱帶衛生與醫學院，倫敦，英國)提供，並按照常用方法培養在沈！下在 添加10%滅活胎牛血清、慶大黴素、青黴素和2mM穀氨醯胺的RPMI培養基中培養。除了在培 養基中添加40μΜ MT以外，MT耐藥菌株與對MT敏感的親本菌株生長條件相同。在靜止狀 態下收集以上兩種寄生蟲，用不含酚紅的RPMI 1640培養基清洗，並在加入7. 5 μ M BDP-MT 後，在^TC下在上述培養基中孵育2小時到2X IO6寄生蟲/mL的密度。接下來在不含脂肪 酸的lOmg/mL BSA存在下用所述培養基清洗三次，最後用激發波長為488nm、發射波長檢測 範圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進行活體檢測。從圖2中可以觀察到對藥物敏感的寄生蟲菌株出現強烈的細胞內螢光，然而在 耐藥寄生蟲菌株中由於摻入標記類似物BDP-MT較差，其細胞內螢光強度較弱。實施例3.通過BDP-MT區分性診斷眼部寄生蟲3. 1.卡氏棘阿米巴的包囊和營養體卡氏棘阿米巴的包囊和營養體是由的Carmen del人guila博士(馬德裡San Pablo CEU大學)提供的。營養體在27°C下在含5%胎牛血清的⑶C培養基中生長，然後 用不含胎牛血清的上述培養基清洗，並在相同培養基中在32°C的溫度下將營養體與5 μ M BDP-MT 一起孵育15分鐘，至7Χ IO5個營養體的密度。孵育之後，用含有10mg/mL BSA的 上述培養基來清洗營養體，然後用激發波長為488nm、發射檢測範圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進行活體觀察。由圖3可見卡氏棘阿米巴的營養體(寄生蟲的代謝活性形式)由於摻入了高量 的BDP-MT而顯示出了強烈的細胞內螢光標記。而在該圖的包囊中，螢光染色都集中在表面 上。由於上述實驗是用自由活動的微生物進行的，因營養體的移動，其在透射圖像和螢光圖 像中的位置會有細微的差別。3.2.卡氏棘阿米巴包囊和營養體以及鐮刀菌菌絲同時用螢光標記。
真菌鐮刀菌的菌絲維持在含Saboroud培養基的瓊脂糖中。在32°C下在含有抗生 素且無胎牛血清的RPMI 1640培養基中進行細胞擴增。清洗之後，在BDP-MT 5 μ M存在下， 在不含酚紅的相同培養基中在32°C溫度下重懸菌絲15分鐘。然後用BSA清洗三次，使用激 發波長為488nm、發射檢測範圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進行 活體觀察。摻入BDP-MT之後，菌絲、營養體和包囊所有三種的螢光圖像觀察到與之前發生 很大區別，菌絲形態明顯被拉長，而體積相對較小的卡氏棘阿米巴營養體呈現出不規則的 形狀；上述兩種情況下都觀察到螢光類似物摻入到細胞中，而在卡氏棘阿米巴的包囊(基 本上呈球狀)中僅在其表面觀察到螢光標記，這與與之前實施例中描述的情形相同。實施例4.通過螢光類似物肚-BDP-MT診斷病原微生物的存在。以上所提到的使用BDP-MT化合物的病原體螢光標記技術同樣可以應用於其他類 似物，其中通過改變這些類似物中螢光基團的結構，使激發和發射波長出現在可見光譜中 其他不同區域。為了進一步說明這種擴展，本實施例中使用類似物肚-BDP-MT。與類似物 BDP-MT相比，該類似物中的激發和發射波長都發生了紅移。圖5中的三幅圖像包含了用 Et-BDP-MT染色後的代表性微生物實例，分別顯示了卡氏棘阿米巴營養體(A)、卡氏棘阿米 巴包囊(B)和鐮刀菌菌絲(C)。將上述三種微生物在5μ M肚-BDP-MT類似物存在下孵育 30分鐘進行標記。隨後使用含BSA lOmg/mL的培養基進行清洗，最後用螢光顯微 鏡上(帶有480-520nm發射光濾光器)偶聯的Leica DFC350FX CCD數位相機拍照。在上述三種微生物中均觀測到了與BDP-MT所得圖像類似的螢光圖樣；卡氏棘阿 米巴的營養體細胞內有螢光標記，相同微生物的包囊表面有螢光標記，鐮刀菌菌絲也已被 標記，這表明BDP-MT獲得的數據也可較容易地擴展應用到其它結構類似的化合物中。實施例5.用BDP-MT對自由活動的四膜蟲進行螢光標記。原生動物梨形四膜蟲的細胞在蛋白酶蛋白腖葡萄糖培養基(ProteasaP印tona Glucosa Medium)中擴增，通過離心收集細胞(密度為IO4個細胞/mL)。隨後與BDP-MT 5μΜ 一起孵育4小時，再用2%多聚甲醛清洗並固定30分鐘，最後用激發波長為488nm、發射檢 測範圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進行觀測。從圖6中可以觀察到，微生物中摻入了大量的螢光化合物，這樣就能夠進行鑑定 和定位，甚至在細胞濃度較低的地方也能如此。
權利要求
1.用於區分性鑑定微生物的螢光化合物，其特徵在於，其含有烷基磷脂衍生物和具有 高度光穩定性並發射可見光譜區波長之光的螢光基團。
2.根據權利要求1的螢光化合物，其特徵在於，所述烷基磷脂類似物是米替福新(MT)、 依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。
3.根據權利要求1的螢光化合物，其特徵在於，所述烷基磷脂類似物是米替福新(MT)、 依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的類似物。
4.根據權利要求1的螢光化合物，其特徵在於，所述螢光基團是具有高度光穩定性並 發射可見光譜波長區之光的螢光基團，其中包括但不限於具有或不具有取代基的硼二吡 咯亞甲基類、咕噸類、羅丹明類、花青類、沙星類、嚇啉類、香豆素類和多環烴類。
5.根據權利要求1至4任一項的螢光化合物，其特徵在於，所述螢光基團是以下通式所 表示的取代或未取代的硼二吡咯亞甲基類(BDP)
6.根據權利要求5的螢光化合物，其特徵在於，R1是氫或乙基。
7.根據權利要求1和2任一項的螢光化合物，其特徵在於，所述烷基磷脂類似物是米替 福新，並且所述螢光基團是以下通式所表示的取代或未取代的BDP
8.根據權利要求7的螢光化合物，其特徵在於，R1是氫(BDP-MT化合物)或乙基 (Et-BDP-ΜΤ 化合物)。
9.獲得螢光化合物的方法，其特徵在於包括以下步驟i)由二乙醯基醇和乙醯乙酸乙酯獲得相應的取代α-H-吡咯， )使所述α "H-吡咯與適當的α -甲醯吡咯縮合，iii)使由此形成的二吡咯亞甲基化合物與三氟化硼乙醚反應，iv)引入磷酸膽鹼基團。
10.根據權利要求1至8任一項的螢光化合物在製備用於微生物鑑定方法的藥物組合 物的用途。
11.診斷性藥物組合物，其特徵在於，包含根據權利要求1至8任一項的化合物。
12.根據權利要求11的診斷性藥物組合物，其特徵在於，包含以下至少一種化合物 BDP-MT 禾口 Et-BDP-MT。
13.根據權利要求11和12任一項所述的診斷性藥物組合物在用於鑑定微生物之方法 中的用途。
14.根據權利要求13的診斷性藥物組合物的用途，其用於生物樣品的體外診斷方法 中，所述生物樣品來自帶有傳染性疾病的人或獸醫學個體，例如但不限制本發明的範圍，所 述傳染性疾病屬於下組角膜炎、利什曼病、非洲和美洲錐蟲病、肺炎鏈球菌肺炎、阿米巴 病、滴蟲病和黴菌病。
15.根據權利要求14的診斷性藥物組合物的用途，其特徵在於，所述傳染性疾病由屬 於下組的微生物引起利什曼原蟲(Leishmania sp)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克 氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、毛滴蟲(Trichomonas sp.)、溶組織性內阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(Naegleria sp)、月市炎鏈球 菌(Streptococcus pneumoniae)、鍵刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜蟲(Tetrahymena pyriformis)禾口 Balamuthia 原蟲。
16.根據權利要求14的診斷性藥物組合物的用途，其用於源自眼的生物樣品的診斷方 法中，所述樣品例如由角膜刮削獲得。
17.根據權利要求13的診斷性藥物組合物的用途，其用於既非人也非動物之樣品中微 生物的鑑定方法中，例如在水、人工眼睛、隱形眼鏡、隱形眼鏡護理液或角膜保存介質中。
全文摘要
本發明涉及類似於烷基磷脂的新的螢光化合物，在其結構中含有高度光穩定的螢光基團並發射可見光譜波長範圍內的光。所述化合物容易導入微生物中，從而能夠通過螢光顯微鏡來檢測和鑑定所述微生物。所述新螢光化合物還可以快速且容易地診斷病原微生物的存在性，其特徵表現為它們對用烷基磷脂處理的抗性。
文檔編號C09K11/06GK102124076SQ200980121114
公開日2011年7月13日 申請日期2009年3月30日 優先權日2008年4月4日
發明者A·烏利塞斯·阿庫納費爾南德斯, 喬斯·瑪麗亞·紹加爾克魯斯, 喬斯·瑪麗亞·雷克霍伊西德羅, 卡芒·德爾阿吉拉德拉普恩特, 尤金伲亞·卡裡洛加列戈, 弗朗西斯科·阿馬特圭裡, 傑休斯·梅拉約洛韋斯, 瓦倫丁·奧尼略斯戈麥斯雷庫埃羅, 蘇珊娜·馬科斯塞萊斯蒂諾, 路易斯·伊格納西奧·裡瓦斯洛佩斯 申請人:聖巴布羅大學, 巴利亞多利德大學, 康斯喬最高科學研究公司