三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生長中的應用的製作方法

2023-12-08 16:54:06

專利名稱：三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生長中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及三氧化二鑭(La203)在天山雪蓮種 苗生根和壯苗中的應用。
背景技術：
天山雪蓮屬菊科(Compositae)菜薊族(Trib. Cynareae Less.)鳳毛 菊屬(&"ssw^a sA)植物，是我國高山地區民間常用的一類名貴中草藥。 雪蓮性溫、味微苦，具有散寒除溼、強筋助陽、抗炎鎮痛、收縮子宮等功能， 可治療風溼性關節炎、婦女小腹冷痛、陽痿、抗衰老及抑制癌細胞增生等。 其主要的活性成分是黃酮、生物鹼、多糖。但是隨著市場對雪蓮需求的不斷 增長，野生雪蓮遭到了毫無節制地掠奪性盜採，再加上天山雪蓮本身生長 緩慢、繁殖相當困難，致使野生雪蓮資源嚴重匱乏，已被列為國家二級野生 保護植物。為了保護野生天山雪蓮種質和滿足市場對雪蓮的需求，研究者開 展了天山雪蓮進行試管微繁殖和種植的工作。最先採用組織培養進行天山雪蓮快速繁殖的研究者是中國瓦 古巴諾娃 等人(瓦'古巴諾娃，劉傑龍，石玉瑚；新疆雪蓮的組織培養，"新疆農業科學"， 1990,(5): 221 222)，他們將獲得的無根植株放置在1/2 MS的瓊脂糖培養 基(活性炭0.5 %， 0.2mg/L IAA)上誘導根的產生從而獲得了完整的植株， 移栽成活率達到50%左右。中國樸日子等(樸日子，曹後男，陳豔秋，金英善， 宗成文；新疆雪蓮的離體培養及其快速繁殖，"延邊大學農學學報"，2003， 25(2) : 117 121)也採用了同樣的方式獲得了完整的植株，移栽成活率達到 72%。中國王子霞等(王子霞，林緯；植物組織培養簡報摘編，"植物生理學 通訊"，2002， 38(5): 460)通過天山雪蓮無菌苗子葉誘導獲得不定芽，將不定 芽移栽在含0. 5 %IM + 0. 1%活性炭的1/2 MS培養基上，經過一個月的培養 大部分長出2 4條根，獲得完整的植株，移栽成活率為50%。中國付春祥等 (付舂祥，金治平，楊睿，吳風燕，趙德修；新疆雪蓮毛狀根的誘導及其植 株再生體系的建立，"生物工程學報"，2004， 20 (3) : 366 341)通過毛狀 根途徑建立了天山雪蓮的再生體系。最近，中國科學院過程工程研究所徐春 明等(徐春明，趙兵，耿楠，王曉東，王玉春；植物激素和活性炭對新疆雪 蓮組培苗生根的影響，"中國農學通報"2006， 22(2) :41 43)研究了不同植 物激素和活性炭對新疆雪蓮組培苗生根的影響，結果表明活性炭可以提高 生根質量，最適添加量為lmg/mL。此時根長最長達25. 51mm,但沒有報導移 栽的情況。儘管都獲得了再生植株，但是繁殖效率均比較低，主要存在以下 幾方面的問題1〉以往的研究重點是組培過程中芽(或叢生芽)的誘導和增 殖，很少有研究報導關於天山雪蓮的生根，這是在組培苗生根和移栽方面的 研究一直未有很大進展的原因之一；2〉天山雪蓮根的誘導主要採用比較常規 的手段，即添加相關的生長劑IAA、 IBA或者NM來進行誘導，而對於長年生 長在2500米以上的天山雪蓮也許並不是最佳的誘導試劑；3〉天山雪蓮根的 誘導方式主要在無菌環境下進行，這種方式固然對根的生長提供了一個比較 有利的環境，但是當進行移栽時種苗由於不能適應外界的環境而造成大量死 亡，或者生長緩慢。4〉天山雪蓮屬於高山植物，它特殊的生長環境(高海拔、 高輻射、酷寒)使得它很難在異地生長，最突出的現象是生長緩慢。這樣使 得該品種不能得到大面積的推廣。因此，對天山雪蓮生根、移栽以及移栽後 的生長方面的研究顯得尤為重要。LaA是稀土元素的氧化產物。稀土元素(rare earths,簡稱RE)是鑭系及 鈧、鐿共17種元素的總稱。稀土元素在農業方面的應用研究在我國始於七十 年代初。通過多年實驗室實驗和實際大田試驗在理論上取得了一系列的重要 突破，並產生了很大的經濟效益。中國周正朝研究表明(周正朝，張系彪， 上官周平，植物對稀土元素的生理生態影響；"西北農業學報"，2004， 13 (2): 119 123)稀土元素影響植物的抗逆反應、光合作用和對金屬離子的吸收， 能夠提高作物的產量和品質、增強植物對土壤中N、 P、 K等營養元素的利用 和轉化效率，從而對植物的生理生態產生較大的影響。中國王國烘等(王國烘； 我國農業稀土化合物應用研究的進展，"熱帶作物研究"，1986 (3): 71 74認 為稀土離子能促進葉綠體蛋白質的合成或者是延緩葉綠體衰老，從而提高葉 綠素含量，此外稀土離子與葉綠體色素的結合，可能加強了光合色素對光的 捕獲能力，或者是提高了葉綠體中二磷酸核酮糖羧化嗨的羧化活性，從而提
高對C02的同化作用，最終表現為較高的光合能力。近來，以植物懸浮細胞為體系研究稀土元素對植物細胞生長和次生代謝產物生物合成影響方面的研究越來越多。中國袁曉凡等(袁曉凡，王謙，趙兵，王玉春；稀土元素對水母 雪蓮細胞生長及黃酮類化合物合成的影響，"過程工程學報"，2004， 4 (4): 325 329)將稀土元素添加到水母雪蓮懸浮細胞培養體系中，發現Ce和La 及混合稀土可促進雪蓮細胞的生長及黃酮類化合物的合成，其中以Ce效果最 佳。當初始濃度為0. 025 mol/L的Ce添加到改良的MS培養基中時，細胞生 物量和黃酮類化合物產量最高，分別可達17. 7 g/L及942 mg/L，分別是不添 加稀土元素的對照實驗的134. 4%和166.7%。中國趙建等(J. Zhao(趙建)， W.H. Zhu， Q. Hu. Promotion of indole alkaloid production in Catiiaranthus roseus cell cultures by rare earth elements, Biotechnology Letters, 2000， 22: 825 828) 在長春花細胞懸浮培養體系中分別添加Ce02、 Y203和NdCl3，顯著提高了H引 哚類生物鹼的積累，說明適量的稀土元素對植物次生代謝產物的生物合成有 一定的促進作用。類似的結果如中國吳江永(J.Y.Wu(吳江永)，C.GWang，X.G Mei. Stimulation of taxol production and excretion in Taxus spp cell cultures by rare earth chemical lanthanum, Journal of Biotechnology, 2001 ， 85: 67 73)、中 國楊盛昌(S.C. Yang(楊盛昌)；Possible involvement of NADPH oxidase in lanthanide cation-induced superoxide anion generation in BY-2 tobacco cell suspension culture. Journal of rare earths, 2006, 24: 243 247)。另夕卜，應用 稀土元素促進植物細胞形態發生方面的研究已有報導。楊漢民等(楊漢民， 杜琳；稀土元素對枸杞體細胞胚誘導頻率的影響；"中國稀土"， 1994， 12(2): 186 188)研究了稀土元素對枸杞體細胞胚胎誘導頻率的影響，結果表明混 合稀土元素的添加較大程度上提高了胚胎發生的頻率，可達到295.4%。中國 魯寬科等人(魯寬科，常振戰，陳寶衛，果德安，鄭俊華；稀土元素對植物 的激素樣作用，"北京醫科大學學報"，1997， 29 (4) :289 291)對稀土元 素的作用機理進行了研究，結果表明稀土元素有類似植物激素的作用，其作 用機制可能與鈣調蛋白有關。中國鄭志俠等(鄭志俠，黃碧霞，芮蕾，徐洛； 稀土元素對Ca在細胞中分布影響機制的探討，"稀土"， 2001, 22 (6) :27 31 )研究了稀土元素與Ca在植物細胞中的運轉和分布的影響，研究結果表明， 稀土元素和Ca競爭膜磷脂上的結合點，影響膜上的C,轉運機制，導致了Ca 在細胞中分布的改變，從而引起細胞生理生化的改變。關於稀土元素作用機 理方面的研究儘管已有報導，但仍然處於摸索階段。本發明在研究稀土元素與植物根形態發生和種苗生長生理的基礎上篩選出了高效組根生長試劑La203，該試劑對天山雪蓮根誘導和種苗的生長具有顯 著的促進作用。將此試劑應用於常規的組織培養過程，能夠快速、高效的誘 導高山植物——天山雪蓮無根苗的生根，並促進移栽過程中種苗的生長和提 高成活頻率。整個工藝簡單可行，既節省了原材料的使用量，又縮簡了雪蓮 試管苗操作步驟，容易實現雪蓮種苗的規模化生產，並為其它難生根植物的 快速繁殖和馴化工作提供了很好的借鑑。發明內容本發明的目的是提供三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生根中的應用。 本發明的再一 目的是提供三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生長中的應用。本發明巧妙的利用了 1^203促進細胞生長和分化的功能，快速實現了天山 雪蓮生根的誘導和移栽後種苗的健壯生長，與傳統的依賴於植物激素誘導生 根的途徑和分階段生根的方式相比，具有節省材料、節省試劑、節省人力、 縮短種苗的培育周期、生產效率高的優點，很容易在規模化生產中使用。本發明的三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生根和壯苗中的應用的具體實施方 案包括兩個途徑(如圖l、 2所示)，第一個途徑分為兩個階段瓶內生根和瓶 外馴化；第二個途徑是無根種苗或組培苗直接移栽、馴化。其步驟如下途徑一準備高壓滅菌的無菌支持培養基質，加入濃度為25 250微摩 爾每升的天山雪蓮根誘導試劑La^溶液；然後在無菌條件下取天山雪蓮的無 根或帶有少量根的組培苗插入到培養瓶內裝有製備好的培養基質中培養，培 養溫度25士2。C，光照強度為500 5000 Lux、光周期16小時，溼度剛開始 保持在80%以上， 一周後可降低溼度；生長一個月後，將生根的組培苗從培養 瓶中取出，用無菌水衝洗掉附著的培養基質，移栽在外界培養基質支持物上， 用1^203溶液澆灌，La必溶液濃度為50 500微摩爾每升，用遮蔭網遮蓋，並 保持培養空間溼度不低於50%。培養3 14天後，優選3 7天後，葉片噴灑 1^203溶液至液滴形成但不掉落為止丄3203溶液的濃度為10 150微摩爾每升， 以後每間隔3 14天，優選7天可再噴灑濃度為10 300微摩爾每升的LaA 溶液， 一個月後即可進行大田移栽。途徑二準備不經滅菌或者沒完全滅菌的支持培養基質，加入濃度為25 250微摩爾每升的天山雪蓮根誘導試劑1^203溶液；然後將天山雪蓮的無根組 培苗或者種籽實生苗插入製備好的培養基質中培養，培養溫度25士2X:，光照 強度為500 5000 Lux、光周期16小時，溼度剛開始保持在80%以上， 一周 後可降低溼度；培養3 14天後，優選3 7天後，葉片噴灑LaA溶液至液滴 形成但不掉落為止，La2(V溶液的濃度為10 150微摩爾每升，以後每間隔3 14天，優選7天可再噴灑濃度為10 300微摩爾每升的LaA溶液。所述的天山雪蓮(5"a歸勤a i/7Ko7worata Kar. et Kir. ex Maxim)的無 根或帶有少量根的種苗是由細胞再分化而來的無菌苗，或者是種子種植出來的種苗。所述的培養基質選自瓊脂、草炭、珍珠巖、蛭石、木屑、腐殖土中的一 種或一種以上的混合基質。所述的LaA溶液中可進一步加入蔗糖，製備成混合天山雪蓮根誘導試劑。所述的La^溶液中可進一步加入其它無機元素(鉀、鈣、鎂、鐵、磷、 銅、鈷、硼、鋅或它們的任意混合物)，製備成混合天山雪蓮根誘導試劑。所述的天山雪蓮根誘導試劑LaA溶液、U203與蔗糖的混合溶液、LaA 與鉀、鈣、鎂、鐵、磷、銅、鈷、硼、鋅元素或它們的任意混合溶液添加方 式為在培養基質中直接添加、對天山雪蓮根部澆灌或者葉片噴灑。本發明利用LaA促使天山雪蓮根的發生和苗生長，通過在無菌培養基質 上或者在外界培養基質支持物中加入一定劑量的LaA溶液，能夠促進天山雪 蓮種苗高效生根，並提高移栽成活率；同時通過葉面噴灑La203溶液能夠顯著 增加天山雪蓮組培苗的地上部分植株高度和葉片的數目，提高種苗的生長質 量，在短期內可獲得茁壯的天山雪蓮種苗。本發明適用於試管內生根或者試 管外直接生根，具有簡單、節省原材料、縮短生長周期、生產效率高的優點， 節省人力、物力，很容易在大規模生產中應用。不僅對天山雪蓮種苗的高效 生根提供了有效的途徑，而且為其它難生根的高山植物的人工生根體系的建 立提供了可借鑑的模式。


圖1.本發明途徑一的LaA促進天山雪蓮植株生根、壯苗工藝流程示意圖。 圖2.本發明途徑二的LaA促進天山雪蓮植株生根、壯苗工藝流程示意圖。
具體實施方式
實施例11、 配製200微摩爾每升La203溶液，添加瓊脂粉0.5%， 12rC滅菌17分 鍾。取生長狀態均一健壯的天山雪蓮無根組培苗(長2 cm)轉接到含有UA 的瓊脂培養基上，每個培養瓶轉接3 5棵，然後放置到溫度為25士2。C，光 照強度為4000 Liix、光周期16小時的培養室中培養。2、 培養35天後，生根頻率達到100%、平均每個苗上有6條根、平均根 長2.5cm，優於不添加La203溶液的培養基。將生根的種苗取出培養瓶，用自 來水衝洗掉附著的瓊脂，然後轉接到珍珠巖支持培養基質上，用濃度為200微 摩爾每升的LaA溶液澆灌根部，用遮蔭網遮擋，每隔一個小時噴灑自來水一 次，以空氣溼度不低於80%為佳。溫度25 ±2°C,光照強度為2500 Lux、光 周期16小時。3、 培養7天後，去掉遮蔭網，用濃度為200微摩爾每升的LaA溶液噴 灑葉面，以形成液滴但不往下滴水為止，調整每次噴灑自來水的間隔時間， 以空氣溼度不低於50%為佳。以後每次間隔一周噴灑濃度為100微摩爾每升 的La2(V溶液。 一個月後，種苗的成活率為85%。溫度25士2'C，光照強度為 4000Lux、光周期16小時。實施例21、 取優質草炭放置到培養瓶中(高度為培養瓶的2/5),然後加入濃度為 200微摩爾每升LaA溶液至不積水為止，121。C滅菌30分鐘。取生長狀態均 一健壯的天山雪蓮無根組培苗(長2 cm)轉接到含有La203的瓊脂培養基上， 每個培養瓶轉接3 5棵，然後放置到溫度為25 ±2°C,光照強度為4000 Lux、 光周期16小時的培養室中培養。2、 培養35天後，生根頻率達到95%、平均每個苗上有8條根、平均根長 2.9cm，優於不添加U203溶液的培養基。將生根的種苗取出培養瓶，然後轉接 到珍珠巖支持培養基質上，用濃度為200微摩爾每升的LaA溶液澆灌根部，
用遮蔭網遮擋，每隔一個小時噴灑自來水一次，以空氣溼度不低於80%為佳。 溫度25 ±2°C，光照強度為2500 Lux、光周期16小時。3、培養7天後，去掉遮蔭網，用濃度為200微摩爾每升的LaA溶液噴 灑葉面，以形成液滴但不往下滴水為止，調整每次噴灑自來水的間隔時間， 以空氣溼度不低於50%為佳。以後每次間隔一周噴灑濃度為100微摩爾每升 的La203溶液。 一個月後，種苗的成活率為88%。溫度25士2X:,光照強度為 4000Lux、光周期16小時。實施例31、 取珍珠巖草炭蛭石體積比為3: 1: 1的混合基質，用800倍的多菌靈滅菌，次日，取天山雪蓮無根組培苗(長2 cm)轉接到混合基質中，用 濃度為200微摩爾每升的La203溶液澆灌根部，用遮蔭網遮擋，每隔一個小時 噴灑自來水一次，以空氣溼度不低於80%為佳。溫度25±2°C，光照強度為 2500Lux、光周期16小時。2、 培養7天後，去掉遮蔭網，用濃度為200微摩爾每升的UA溶液噴 灑葉面，以形成液滴但不往下滴水為止，調整每次噴灑自來水的間隔時間， 以空氣溼度不低於50%為佳。以後每次間隔一周噴灑濃度為100微摩爾每升 的UA溶液。--個月後，種苗的成活率為72%，生根頻率為85%。溫度25土2 °C，光照強度為4000 Lux、光周期16小時。
權利要求
1.一種三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生長中的應用，其特徵是所述的三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生根和壯苗中應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵是所述的三氧化二鑭在天山雪 蓮種苗生根和壯苗中的應用是，在事先滅過菌的培養基質中，加入濃度為25 250微摩爾每升的天山雪蓮根誘導試劑LaA溶液；然後在無菌條件下取天山雪蓮的無根組培苗插入到培養瓶內裝有製備好的培養基質中培養，培養溫度25士2。C，光照強度為500 5000 Lux、光周期16小時，溼度剛開始保持在 80%以上；生長一個月後，將生根的組培苗從培養瓶中取出，用無菌水衝洗掉 附著的培養基質，移栽在外界培養基質支持物上，用La203溶液澆灌，LaA溶 液濃度為50 500微摩爾每升，用遮蔭網遮蓋，並保持培養空間溼度不低於 50% ;培養3 14天後，葉片噴灑LaA溶液至液滴形成但不掉落為止，La203 溶液的濃度為10 150微摩爾每升，以後每間隔3 14天再噴灑濃度為10 300微摩爾每升的La203溶液， 一個月後即可進行大田移栽。
3. 根據權利要求1所述的應用，其特徵是所述的三氧化二鑭在天山雪 蓮種苗生根和壯苗中的應用是，在沒有滅過菌或者沒有完全滅菌的培養基質 中，加入濃度為25 250微摩爾每升的天山雪蓮根誘導試劑1^203溶液；然後 將天山雪蓮的無根組培苗或者種籽實生苗插入製備好的培養基質中培養，培 養溫度25±2°C，光照強度為500 5000 Lux、光周期16小時，溼度剛開始 保持在80%以上；培養3 14天後，葉片噴灑1^203溶液至液滴形成但不掉落 為止，LaA溶液的濃度為10 150微摩爾每升，以後每間隔3 14天再噴灑 濃度為10 300微摩爾每升的La203溶液。
4. 根據權利要求2或3所述的用途，其特徵是所述的天山雪蓮的無根 或帶有少量根的種苗是由細胞再分化而來的無菌苗，或者是種子種植出來的 種苗。
5. 根據權利要求2或3所述的用途，其特徵是所述的天山雪蓮根誘導 試劑LaA溶液添加方式為在培養基質中直接添加、對天山雪蓮根部澆灌或者葉片噴灑。
6. 根據權利要求2或3所述的用途，其特徵是所述的培養基質選自瓊脂、草炭、珍珠巖、蛭石、木屑、腐殖土中的一種或一種以上的混合基質。
7. 根據權利要求5所述的用途，其特徵是所述的培養基質選自瓊脂、草炭、珍珠巖、蛭石、木屑、腐殖土中的一種或一種以上的混合基質。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，特別涉及三氧化二鑭在天山雪蓮種苗生根和壯苗中的應用。本發明利用La2O3促使天山雪蓮根的發生和苗生長，通過在無菌培養基質上或者在外界支持物中加入La2O3溶液，能夠促進天山雪蓮種苗高效生根，並提高移栽成活率；同時通過葉面噴灑La2O3溶液能夠顯著增加天山雪蓮組培苗的地上部分植株高度和葉片的數目，提高種苗的生長質量，在短期內可獲得茁壯的天山雪蓮種苗。本發明不僅對天山雪蓮種苗的高效生根提供了有效的途徑，而且為其它難生根的高山植物的人工生根體系的建立提供了可借鑑的模式。
文檔編號A01H4/00GK101161057SQ20061011373
公開日2008年4月16日 申請日期2006年10月13日 優先權日2006年10月13日
發明者劉春朝, 瓊 晏, 斌 郭 申請人:中國科學院過程工程研究所