用於治療、預防或延遲腫瘤發生的方法和組合物的製作方法

2023-12-08 20:06:56 3

專利名稱：用於治療、預防或延遲腫瘤發生的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療、預防或延遲腫瘤發生的方法和組合物。所述方法包括給予抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。
背景技術：
不少人患有良性或惡性腫瘤。此外，還有一些人是腫瘤高危個體。例如，數次大規模流行病學研究表明，胰島素樣生長因子(IGF-1)濃度趨近正常值範圍高端的個體發生諸如乳房癌、結腸癌和/或前列腺癌等多種惡性腫瘤的危險性較高。而且，有報導稱肢端肥大個體發生某些類型的腫瘤尤其是結腸癌的危險性較高。
已知可採用包括諸如伊立替康(Irinotecan)等喜樹鹼類在內的抗腫瘤藥物來治療多種腫瘤。然而，治療腫瘤更有效的方法和組合物仍然是人們的迫切需求。
發明概述本發明目的之一是提供用於治療、預防和/或延遲腫瘤發生的方法和組合物。
上述目的是由本發明方法和組合物實現的。本發明內容之一是治療、預防或延遲腫瘤發生的方法。該方法包括給予個體抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。
實施方式之一，本發明提供了治療、預防或延遲腫瘤發生的方法，這些方法包括給予個體鹽酸伊立替康和聚乙二醇(PEG)修飾的人生長激素，所述PEG修飾的人生長激素包含約4-5個共價結合的PEG分子，每個PEG分子的平均分子量約為5,000Da。
另一實施方式中，本發明提供了消減腫瘤重量或體積的方法，這些方法包括給予個體抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。
另一實施方式中，本發明提供了包含抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑的組合物。
本發明的方法和組合物可用於治療、預防和/或延遲腫瘤的發生。某些實施方式還能夠治療和/或預防腫瘤的轉移。以下將更為詳細地闡述本發明的實施方式、目的和優點。


圖1A-1D如實施例所述給BALB/c小鼠注射鼠結腸癌細胞系CT-26後單獨給予載體，Pegvisomant，伊立替康，和聯合給予Pegvisomant和伊立替康對於脾腫瘤體積以及對肝轉移數量和質量的作用。
詳細說明本發明涉及治療、預防或延遲腫瘤發生的方法，以及消減腫瘤重量或體積的方法。這些方法包括給予個體抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。本發明還涉及包含抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑的組合物。
本發明中，「個體」指患有腫瘤或腫瘤高危動物，所述動物包括人、其它哺乳動物或嚙齒類動物。腫瘤高危個體包括但不限於具有獲得性或遺傳性基因變異的個體，具有腫瘤發生傾向性的個體，例如肢端肥大個體。本發明中，「治療」指消減腫瘤的重量和/或體積，預防和延遲則指在給予抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑後能夠防止或延遲臨床認定的腫瘤發生或顯現。本發明實施方式之一中，所述腫瘤是惡性腫瘤，包括但不限於結腸癌、乳房癌、前列腺癌或其中數種。另一實施方式中，所述腫瘤是良性的，包括但不限於腦膜瘤。
本發明發現聯合給予抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑比單獨給予抗腫瘤藥物更有效。
本領域技術人員知道許多可治療、預防或延遲腫瘤發生的抗腫瘤藥物。實施方式之一中，所述抗腫瘤藥物包含喜樹鹼，例如喜樹鹼衍生物伊立替康或其藥學上認可的鹽或酯。有關伊立替康可參見Miyasaka等的美國專利4,604,463，它是治療結腸癌等腫瘤的一種常用藥。鹽酸伊立替康是一種半合成喜樹鹼衍生物，提取自諸如喜樹(camptotheca acuminats)的一種生物鹼，是拓樸異構酶-1的抑制劑。伊立替康的化學名稱為鹽酸(4S)-4，11-二乙基-4-羥基-9-((4-哌啶子基哌啶子基)羰基氧基)-1H-吡喃並(3』，4』，6，7)中氮茚並(1，2-b)喹啉-3，14(4H，12H)二酮。其結構式為 伊立替康有市售商品，例如其鹽酸鹽，例如Pharmacia的Camptosar。
其他已知抗腫瘤藥物也可用於本發明方法和組合物。例如，已知可用多種藥物來治療腫瘤，這些藥物也在本發明範圍內也被認為是抗腫瘤藥物，它們包括但不限於蒽環類抗生素，例如阿黴素和表柔比星，紫杉烷類，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(docetaxel)，埃坡黴素(epothilone)類，其他烷化劑，例如環磷醯胺，鉑類藥物，例如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑，氟嘧啶類，例如5-FU和capcitidine，抗代謝藥，例如甲氨蝶呤，SERM類，芳香酶抑制劑，LHRH激動劑和拮抗劑，雌莫司汀，核苷還原酶抑制劑，例如吉西他濱(gemcytabine)，EGFR拮抗劑，抗血管生成藥。
生長激素受體拮抗劑中所述的生長激素(GH)包括野生型或重組人生長激素，或表現出生長激素活性的它們的變體。已知人生長激素(hGH)是分子量為22,000Da的垂體激素，已知其具有多種生物作用，包括線性生長(體質形成)，哺乳，巨噬細胞的活化和胰島素樣致糖尿效應，等等。Chawla，Annu.Rev.Med.，34519(1983)；Edwards等，Science，239769(1988)；Isakasson等.，Annu.Rev.Physiol.47483(1985)；Thorner等.，J.Clin.Invest.，82745(1988)；Hughes等.，Annu.Rev.Physiol.，47469(1985)。這些生物學效應來自hGH與特異性細胞受體之間的相互作用。
HGH屬於一個相似激素家族，這族激素包括胎盤催乳素，催乳素以及生長激素的其他遺傳和物種變異體。hGH的特殊之處在於它表現出廣泛的物質特異性，能夠與克隆的體質形成受體或催乳素受體結合。已經能夠令hGH的克隆基因在大腸桿菌中表達為分泌形式，Chang等.，Gene.，55189(1987)，其DNA和胺基酸序列已有報導，Goeddel等.，Nature，281544(1979)；Gray等.，Gene，39247(1985)。已通過同系物掃描誘變和丙氨酸掃描誘變鑑定了hGH的受體和抗體表位，Cunningham等.，Science，2431330(1989)；Cunningham等.，Science，2441081(1989)；WO97/11178。
hGH與其受體(hGHbp)胞外域形成的激素-受體複合物是已知的，Wells等.，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，22329(1993)。高清晰度結構及突變分析和結構分析顯示一分子hGH利用激素上的不同位點，位點1和位點2，先後與兩分子受體分子結合，Cunnigham等.，Science，2441081(1989)；Cunnigham等.，Science，254821(1991)；De Vos等.，Science，255306(1991)。
除了GH廣泛的物種特異性之外，已知包括GH本身和GH-激發肽，胰島素樣生長因子1(IGF-1)，在內的GH軸系能夠刺激正常組織和腫瘤組織的生長。而且，人腫瘤生長，不論是實體性的還是血液性的，一般都能夠通過改變GH軸系來調節，至少在實驗室環境中是如此。
已知許多hGH的天然和重組突變體或變異體適合用作生長激素受體。這可參見例如Kostyo等，Biochem.Biophys.Acta，925314(1987)；Lewis等，J.Biol.Chem.，2532679(1978)；Tokunaga等，Eur.J.Biochem.，153445(1985)；WO91/05853；WO/92/09690；WO92/19736；WO92/20029；WO97/11178。本發明中，「變(異)體」既包括hGH的天然衍生物也包括其重組衍生物，其中，hGH的一個或多個胺基酸被取代或缺失，但條件是這些衍生物仍具有hGH活性。在一具體實施中，本發明方法採用了WO97/11178中所述的hGH變體B2036。
hGH變體B2036內含有以下取代H18D，H21N，G12OK，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S，I179T。
據WO97/11178所述，雖然在相同位置上的其它取代也可以，但引入G120K取代可生成一個更好的候選拮抗劑。G120被任何胺基酸取代都會產生一個拮抗劑，較好的取代是賴氨酸，精氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸或穀氨酸。K168A和K172R取代的目的是減少激素-受體位點I結合界面的可PEG化位點。相反，G120K取代增加了一個可供PEG化的賴氨酸，但同時造成了有效的位點2阻抑。據推測，B2036還可以通過其120位上甘氨酸的復原而進一步改進，這樣可產生一種候選激動劑，與852d之類其它變體相比，該激動劑有望降低在人體內的抗原性。
用於在大腸桿菌內表達B2036的載體是pMY233。質粒pMY233的前身是眾所周知的pBR322，且與hGH生產質粒pHGH4R(Chang等，Gene，55189(1987))非常相似，只是B2036編碼序列替代了hGH編碼序列。pMY223編碼對四環素的抗性，但不同於pBR322的是它對β-內醯胺類抗生素(青黴素，氨苄青黴素等)敏感。
以下顯示的是pMY223編碼的B2036變體與野生型人生長激素在胺基酸序列上的差異，以及在這些差異位點的密碼子。
野生型的胺基酸胺基酸編號B2036的胺基酸 B2036密碼子His 18AspGACHis 21AsnAACGly 120 LysAAGArg 167 AsnAACLys 168 AlaGCGAsp 171 SerAGCLys 172 ArgAGGGlu 174 SerAGC
Ile 179 Thr ACC關於B2036的其它信息，例如其生產方式，可參見WO97/11178。
實施方式之一中，生長激素受體拮抗劑是一種聚乙二醇(PEG)修飾的生長激素。本發明中，「聚乙二醇修飾的」，「PEG修飾的」和「PEG化的」都表示一分子生長激素與一個或多個聚乙二醇基團共價結合。
生長激素受體拮抗劑可與一個或多個聚乙二醇基團共價結合或偶聯。由此形成實際分子量大於非修飾生長激素的生長激素偶聯物。本發明中，「實際分子量」指通過例如質譜法(例如基質輔助的雷射吸收離子化質譜)測得的分子量)。例如，hGH變體偶聯物的實際分子量通常至少約30kD，多為約30-55kD，更多的是約40-50kD。通常，hGH變體偶聯物的實際分子量不超過100kD。
聚乙二醇可與生長激素分子上包括賴氨酸在內的一個或多個胺基酸殘基偶聯。除聚乙二醇之外還可採用一種或多種其它水溶性直鏈或支鏈聚(烯化氧)聚合物，但以單用聚乙二醇為佳。PEG的平均分子量約為500-30,000Da，尤其是1,000-25,000Da，甚至4,000-20,000Da。實施方式之一中，PEG化採用平均分子量約5,000Da(後文表示為「PEG(5000)」)的PEG進行。另一實施方式中，PEG化採用平均分子量約20,000Da的PEG進行。
實施方式之一中，調整反應條件以儘可能產生偶聯1-6分子聚乙二醇的生長激素，另一更特定的實施方式中，調整反應條件以儘可能產生偶聯4-5分子左右聚乙二醇的生長激素。另一實施方式中，調整反應條件以儘可能產生與1分子PEG偶聯的生長激素。在這些不同實施方式中，可採用支鏈PEG。
市售的可用於本發明的PEG製劑是那些根據平均分子量出售的非均質製劑。例如PEG(5000)製劑通常含有分子量略有差異但僅相差±500Da的分子。
現有文獻中記載有多種蛋白質PEG化的方法。例如Davis等的美國專利4,179,337描述了多種激素和蛋白質與PEG和聚丙二醇偶聯來生產具有生理活性的非免疫原性組合物。通常，一分子具有至少一個末端羥基的PEG與偶聯劑反應，形成具有末端活性基團的活化PEG。然後，該活性基團與蛋白質的α-胺和ε-胺反應形成共價鍵。方便起見，可用一個非活性化學基團，例如甲氧基，將PEG的另一段「封閉」，從而減少PEG與蛋白質形成交聯複合物。
就hGH和hGH變體的PEG化來說，活化的PEG能夠在不破壞位點1結合活性的條件下與變體反應。對作為激動劑的hGH變體來說，位點2的結合活性必須保留。而且，對作為激動劑或拮抗劑的hGH變體來說，一般應避免會在偶聯物內引入毒性連接基團的活化PEG。合適的活化PEG可用多種常規方法來產生。例如，PEG的N-羥基琥珀醯亞胺酯(M-NHS-PEG)可根據Buckman等在Makromol.Chem.，1821379(1981)中所述的方法，由PEG-單甲基醚(可購自UnionCarbide)與N，N』-二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)反應製得。此外，可將PEG的末端羥基轉化為氨基，例如先與亞硫醯溴反應形成PEG-Br，然後經過量氨氨解而形成PEG-NH2。PEG-NH2可用標準偶聯劑，例如Woodward’sK試劑與生長激素偶聯。此外，可將PEG的末端-CH2OH基團轉化為醛基，例如用MnO2氧化。醛基可採用例如氰基氫硼化物等試劑通過還原反應與蛋白質偶聯。
或者，本發明所用活化PEG也可向許多供應商購買。例如，ShearwaterPolymers，Inc.(Huntsville，AL)除甲氧基-PEG的琥珀醯亞胺基羧酸酯(「SC-PEG」)和甲氧基-PEG琥珀醯亞胺丙酸酯(「SPA-PEG」，後文表示為「M-SPA-PEG」以表明其含有甲氧基封閉基團)之外還出售M-NHS-PEG(「SCM-PEG」)。ShearwaterPolymers出售一種含有兩條10,000Da支鏈的支鏈PEG。
可對本發明所用生長激素的PEG化程度進行調節以相對於非PEG化生長激素延長其循環半壽期，提高其理化穩定性和/或提高傳遞(例如肺給藥途徑)後生長激素的生物利用度。
生長激素的PEG化位點也在一定程度上受限於不同伯胺的反應活性。例如，B2036(K41)位點1激素-受體結合界面內的賴氨酸與N-SPA-PEG(5000)的反應性較低。這樣，中度PEG化，即每個變體分子結合約4-6個PEG的B2036保留了在位點1結合hGH受體的能力，儘管在該結合界面有一個潛在的PEG化位點。
可用標準誘變技術來改變生長激素內賴氨酸的數量。這樣，根據賴氨酸被其它胺基酸取代的程度，本發明的hGH變體可比野生型hGH含有更多或更少的潛在PEG化位點。B2036變體含有9個潛在PEG化位點，比野生型hGH少一個。此外，取代賴氨酸的胺基酸可改變潛在PEG化位點的位置。例如，B2036中，K168A和K172R取代減少了激素-受體位點1結合界面上的可PEG化位點。以其它胺基酸取代G120破壞了hGH在位點2的結合，使得該分子變成一個hGH拮抗劑。將以賴氨酸取代這一位置的甘氨酸在位點2增加了一個潛在的PEG化位點，這可能會影響該位點的其它結合。還可以通過調節反應條件來改變PEG化程度和位點，例如調節活化PEG與蛋白質的相對濃度以及pH。所需PEG化程度的適宜條件可憑經驗確定。
hGH變體例如B2036的PEG化可用多種常規方法進行。此類市售商品之一是Pegvisomant。實施例之一中，hGH變體以H-SPA-PEG(5000)PEG化。簡而言之，室溫下，向hGH變體的水溶液中邊攪拌邊加入固體SPA-PEG(5000)。通常，所述水溶液加有緩衝劑，所述緩衝劑的pK接近於反應進行的pH(一般約為pH4-10)。適合在pH7.5進行PEG化的緩衝劑包括例如HEPES，磷酸鹽，硼酸鹽，Tris-HCl，EPPS和TES。如有必要可對pH進行連續監控和調節。反應持續約1-2小時。然後，對反應產物進行疏水性相互作用層析，從游離H-SPA-PEG(5000)和各種PEG化hGH變體的高分子量複合物中分離出PEG化hGH變體。當未封閉的PEG在其分子兩端都發生反應從而引起hGH變體分子交聯時就會產生高分子量複合物。疏水性相互作用層析過程的條件應使游離M-SPA-PEG(5000)通過層析柱，PEG化hGH變體的交聯複合物在所需形式即偶聯一個或多個PEG基團的hGH變體之後洗脫。合適的條件取決於交聯複合物與所需偶聯物之間的相對大小，此類條件的確定對本領域技術人員來說輕而易舉。含有所需偶聯物的洗脫液可通過超濾來濃縮，並通過滲濾來脫鹽。
所得製劑是每分子hGH變體具有3-6個PEG基團的PEG-hGH變體偶聯物的異質混合物。實施方式之一中，該混合物經進一步純化可得到較為均一的PEG化hGH變體製劑。更具體地說，對混合物進行陽離子交換層析，使得PEG化hGH變體根據PEG化程度而分離。
條件應使含有較多PEG基團即PEG化程度較高的hGH變體在梯度中較早洗出。以這種方式可獲得主要包含一種或兩種形式PEG化hGH變體的混合物。本發明中，PEG化hGH變體的「形式」指含有特定數量PEG基團的PEG-hGH變體偶聯物。所以，PEG化hGH變體的不同「形式」表示同樣的hGH變體含有不同數量的PEG基團。實施例之一得到一種主要含兩種形式PEG化hGH變體的混合物，即每分子hGH變體含4個或5個PEG的偶聯物(後文稱「PEG-4/5hGH變體製劑」)。然後可對該混合物進行濃縮、脫鹽和製劑化，以供服用。
本發明所用的含PEG化hGH變體的組合物既可以是異質的，即含有多種PEG-hGH變體形式，也可以是均質的，即僅含一種PEG-hGH變體形式。通常，一種或兩種形式的PEG-hGH變體偶聯物佔所述組合物的至少70％，較好的是佔至少80％，更好的是至少90％。
雖然生長激素受體拮抗劑的PEG化形式適用於本發明，但本發明方法和組合物的範圍也包括使用生長激素受體拮抗劑的非PEG化形式。
本發明技術人員會認識到，許多方法可用於抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑的給藥。本發明實施方式之一中，抗腫瘤藥物是通過非腸胃途徑、局部或全身性給藥的。另一實施方式中，生長激素受體拮抗劑是通過肺傳遞途徑、非腸胃途徑、局部或全身性途徑，或以上多種途徑聯用來給藥的。非腸胃途徑給藥的實例包括但不限於皮下、肌內、靜脈、動脈和腹膜內給藥。非腸胃給藥可通過靜脈或皮下的連續輸液(使用微型泵，例如滲透壓泵)或注射進行。實施方式之一中，生長激素受體拮抗劑和/或抗腫瘤藥物以皮下方式給藥。給藥既可以採用一次性大劑量製劑也可以採用存緩釋儲型製劑。生長激素受體拮抗劑還可以以液體或固體形式通過肺途徑給藥。這樣的實施方式適合採用生長激素受體拮抗劑的PEG化形式。一具體實施方式
中，PEG化生長激素的形式是一種微精液體氣溶膠，其中液滴或顆粒的直徑約1-3微米。該液體氣溶膠是由生長激素受體拮抗劑的液體製劑形成的，該液體製劑則由冷凍乾燥粉末再生而得。而且，本領域技術人員可看出，生長激素受體拮抗劑和抗腫瘤藥物可以同時給藥也可以分開給藥。
抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑按照治療有效量給予個體。本領域技術人員可以看出，所述化合物的劑量和給藥方案取決於諸如抗腫瘤藥物的效力、給藥方式、患者年齡和體重、疾病嚴重程度等諸多因素。這些都屬於本領域技術人員的常規技能，參考有關各組分的現有文獻即可確定最適劑量。
本發明中，「藥學上認可的」指某些特性和/或物質就藥理學/毒理學來看能夠為患者所接受，或就組成、製劑、穩定性、患者接受度和生物利用度來看能夠為製藥領域藥劑師所接受。
抗腫瘤藥物的劑量通常根據體表面積(BSA)(m2)來確定。選用BSA而非體重作為計算基準的理由有二。首先，BSA已被證明可更準確地就某些藥物的活性和毒性進行跨物種比較。第二，BSA與心輸出的關聯更密切，心輸出決定著流向肝和腎的血流量，因而影響著藥物的排除。一般說來，平均BSA大致為男性1.9m2，女性1.6m2，九歲兒童1.07m2，十歲兒童1.14m2，11-12歲兒童1.33m2。本領域技術人員可以看出，以上只是泛舉，具體數值可用常規方法測定。劑量的範圍可以是例如每次約50-500mg/m2，給藥方案的設計則屬於本領域技術人員的常規技能。
作為一更具體的實施例，可進行90分鐘/次靜脈輸注125mg/m2伊立替康，每周1次，連續4周後停藥2周。然後，每6周(4周治療2周停藥)重複以上過程。後續劑量可以20-50mg/m2的階進幅度調高至1500mg/m2或降低至50mg/m2，具體由主治醫師根據患者對治療的耐受性確定；另一種方案是90分鐘/次靜脈輸注350mg/m2伊立替康，每3周一次。
總的來說，作為組合物，藥學上認可的生長激素受體拮抗劑非腸胃給藥總量的範圍以患者體重為基準約為每劑1μg/kg/天至10mg/kg/天，雖然，如前所說，這是就治療而言的。通常，所述劑量約為0.01-10mg/kg/天，人用劑量一般約為0.01-1mg/kg/天。如果連續給藥，生長激素受體拮抗劑的給藥速度通常約為1-50μg/kg/小時，所述連續給藥包括每天1-4次注射或用微型泵連續輸液。也可採用靜脈輸液袋。
實施例本實施例表明，生長激素受體拮抗劑Pegvisomant與抗腫瘤藥物伊立替康聯合給藥與單用相比可顯著提高伊立替康的治療效果。用注射到BALB/c小鼠脾內的CT-26細胞(小鼠結腸癌細胞系)評價了Pigvisomant和伊立替康各自單用和兩者聯用的效果。該模型能夠評價對原發性腫瘤(脾內)和對肝轉移的作用。
生長激素受體拮抗劑pegvisomant包含人生長激素的一種PEG修飾的191胺基酸殘基類似物，即B2036，其含有平均約5-5個聚乙二醇分子，每個聚乙二醇分子的平均分子量約為5,000Da。B2036蛋白的設計目的是通過如前所說改變hGH骨架內的胺基酸殘基使之成為hGH受體的拮抗劑。由於PEG關聯的B2036蛋白的胺基酸殘基數與hGH相同，可將該PEG關聯的該蛋白質看做PEG關聯的hGH的模型變體。
細胞培養物/動物將CT-26細胞(小鼠結腸癌細胞系)培養在含10％胎牛血清的DMEM中，直至約50％鋪滿率。加入胰蛋白酶令貼壁細胞從組織培養瓶的表面脫離。然後，用Hank’s緩衝鹽水溶液洗滌細胞並製成懸浮液。本實施例採用5-8周齡的BALB/c小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。開始時，通過左脅腹切開術露出脾臟。將CT-26細胞直接注入脾臟(1×104活細胞，總體積0.05ml)。用創口夾閉合切口。這是一種同繫結腸癌模型，這樣，不需要對動物宿主進行免疫抑制。
治療如下治療小鼠僅給予載體(生理鹽水)，每日一次皮下給予pegvisomant(3.35，5.0或10.0mg)，伊立替康(接種後第7，14和21天，100mg/kg)和生理鹽水，或伊立替康和pegvisomant。另一實驗中，每日兩次皮下給予2μg奧曲肽。用結核菌素注射器和25號針頭在切口對側脅腹進行注射。
腫瘤的獲得第24天將小鼠殺死。測定原發腫瘤(脾)，轉移腫瘤負荷(肝重)和肝轉移的平均數量。用標準t-試驗進行治療組之間的比較。與載體相比的P＜0.05；與載體加伊立替康相比的P＜0.05。
血清IGF-I試驗酸-乙醇萃取後用放射性免疫試驗(RIA)測定小鼠血清IGF-I。簡而言之，血清/萃取混合物在室溫下孵育2小時，離心，按1∶200稀釋上清液用於分析。用多克隆兔抗體(Nicohls Institute，San Juan Capistrano，CA)通過RIA測定IGF-I濃度。用重組人IGF-I(Amersham International，Bucks，UK)創建試驗標準。
RNA-PCR進行半-定量聚合酶鏈反應(PCR)測定獲得的腫瘤樣本中的IGF-I和IGF-II信使RNA的相對量。每一反應使用1μg總量的RNA。進行逆轉錄。用以下PCR引物對中的下遊引物作為基因特異性引物進行逆轉錄IGF-I 上遊5』-ATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCC-3』下遊5』-CTGGGTCTTGGGCATGTCGGTGTG-3』PCR產物大小401IGF-II 上遊5』-GGAGACAGTCCGCGGGACG-3』下遊5』-GATGGTACTACATTGCAG-3』PCR產物大小227β-肌動蛋白上遊5』-GACAGGATGCAGAAGGAG-3』下遊5』-CTAGAAGCATTTGCGGTG-3』PCR產物大小200用一末端標記引物進行PCR(25輪)，通過丙烯醯胺凝膠電泳從游離放射性標記引物中分離出產物。用磷光成像儀測定各樣品中目標信使的量。為了校正加樣差異，將各樣品的值根據β-肌動蛋白進行歸一化。
圖1A-1D顯示了4個治療組，即生理鹽水、pegvisomant(5.0mg/天)、伊立替康(100mg/天，接種後第7，14和21天)和pegvisomant+伊立替康，對脾內原發腫瘤和對肝轉移數及質量的作用。具體地說，圖1A顯示血清IGF-I濃度；圖1B顯示肝重(g)；圖1C顯示原發腫瘤體積(ccs)；圖1D顯示4組的肝轉移數。Pegvisomant增強了伊立替康的作用，尤其是在抑制肝內轉移性疾病方面。
將動物殺死，採集血清，分析IGF-I濃度(μ/L)，其平均值±標準差如下(生理鹽水)87.6±9.1，(Pegvisomant)50±5.3，(伊立替康)128.6±5.9，(pegvisomant+伊立替康)53±2.9。無腫瘤小鼠體內的基線值約為200(μ/L)。生理鹽水組的低值可能表明動物在臨死前處於嚴重的疾病晚期。
10個接受pegvisomant+伊立替康治療的動物中，只有4個發生肝轉移。這隻相當於安慰劑組或伊立替康治療組發生轉移動物數量的50％。鑑於肝轉移性疾病是最難處理的情況之一，並且是造成結腸癌死亡的重要原因之一，pegvisomant/伊立替康聯合治療降低此類轉移的能力具有重大的臨床意義。
本實施例證明，將生長激素受體拮抗劑例如pegvisomant與抗腫瘤藥物例如伊立替康聯用對三種已知GH和/或IGF-I響應性腫瘤的動物模型具有顯著的抗腫瘤效果。
以上描述各種實施方式的目的僅限於對本發明進行闡述，不可作為本發明的全部實施方式，也不是要將本發明限定為所述具體形式。許多替換、調整和改變對本領域技術人員來說是顯而易見的。所以，本發明應包括所有以上論述過的以及符合本發明構思和屬於權利要求所述廣義範圍內的其它替換、調整和改變。
權利要求
1.一種治療、預防或延遲腫瘤臨床發生的方法，包括給予個體抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。
2.如權利要求1所述的方法，所述腫瘤是惡性腫瘤。
3.如權利要求2所述的方法，所述惡性腫瘤選自結腸癌，乳房癌，前列腺癌或以上多種。
4.如權利要求1所述的方法，所述腫瘤是良性腫瘤。
5.如權利要求4所述的方法，所述良性腫瘤是腦膜瘤。
6.如權利要求1所述的方法，所述抗腫瘤藥物包含喜樹鹼或其藥學上認可的鹽或酯。
7.如權利要求1所述的方法，所述抗腫瘤藥物包含伊立替康或其藥學上認可的鹽或酯。
8.如權利要求1所述的方法，所述生長激素受體拮抗劑包含人生長激素。
9.如權利要求1所述的方法，所述生長激素受體拮抗劑包含重組人生長激素或其變體。
10.如權利要求9所述方法，所述生長激素受體拮抗劑包含B2036。
11.如權利要求1所述的方法，所述生長激素受體拮抗劑包含PEG修飾的生長激素。
12.如權利要求1所述的方法，包括給予個體鹽酸伊立替康或其藥學上認可的鹽或酯和聚乙二醇即PEG修飾的人生長激素，所述PEG修飾的人生長激素含有約4-5個共價結合的PEG分子，每個PEG分子的平均分子量約為5,000Da。
13.一種組合物，包含抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。
14.如權利要求13所述的組合物，所述抗腫瘤藥物包含喜樹鹼或其藥學上認可的鹽或酯。
15.如權利要求13所述的組合物，所述抗腫瘤藥物包含伊立替康或其藥學上認可的鹽或酯。
16.如權利要求13所述的組合物，所述生長激素受體拮抗劑包含人生長激素。
17.如權利要求13所述的組合物，所述生長激素受體拮抗劑包含重組人生長激素或其變體。
18.如權利要求17所述的組合物，所述生長激素受體拮抗劑包含B2036。
19.如權利要求13所述的組合物，所述生長激素受體拮抗劑包含PEG修飾的生長激素。
20.一種消減腫瘤重量或體積的方法，包括給予個體抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。
21.如權利要求20所述的方法，所述腫瘤是惡性腫瘤。
22.如權利要求21所述的方法，所述惡性腫瘤選自結腸癌，乳房癌，前列腺癌或以上多種。
23.如權利要求20所述的方法，所述腫瘤是良性腫瘤。
24.如權利要求23所述的方法，所述良性腫瘤是腦膜瘤。
25.如權利要求20所述的方法，所述抗腫瘤藥物包含喜樹鹼或其藥學上認可的鹽或酯。
26.如權利要求20所述的方法，所述抗腫瘤藥物包含伊立替康或其藥學上認可的鹽或酯。
27.如權利要求20所述的方法，所述生長激素受體拮抗劑包含人生長激素。
28.如權利要求20所述的方法，所述生長激素受體拮抗劑包含重組人生長激素或其變體。
29.如權利要求28所述的方法，所述生長激素受體拮抗劑包含B2036。
30.如權利要求20所述的方法，所述生長激素受體拮抗劑包含PEG修飾的生長激素。
全文摘要
本發明涉及用於治療、預防或延遲腫瘤發生的方法，該方法包括給予抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。本發明還涉及用於消減腫瘤重量或體積的方法，包括給予抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑。本發明還涉及一種包含抗腫瘤藥物和生長激素受體拮抗劑的組合物。
文檔編號A61K45/06GK1649627SQ03809258
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月25日 優先權日2002年4月26日
發明者K·弗蘭德 申請人:法赫馬西亞及普強有限公司