一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑盒和方法
2023-12-09 06:16:31
一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑盒和方法
【專利摘要】本發明公開了一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑盒和方法，屬於醫學生物【技術領域】。本發明通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的TNXB基因外顯子區32063600位置多態性位點的基因型，預測受試者對強直性脊柱炎的易感性。本發明的優點是：首次闡述了TNXB基因外顯子區32063600位置多態性位點與強直性脊柱炎的相關性，提供了一種預測強直性脊柱炎易感性的方法，該方法可用於強直性脊柱炎的預防、輔助診斷和治療，還可以用於新藥研發。
【專利說明】一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑盒和方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑盒和方法，更具體的說是通過測 定與AS相關基因 TNXB的多態性預測受試者對於強直性脊柱炎的易感性，該方法可用於疾 病的輔助診斷、治療和新藥開發，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis, AS)是一種自身免疫性疾病，多發於 16-40歲的青壯年，男女患病比例約為4?10:1。病變常首先發生於骶髂關節，少數重症患 者表現為整個脊柱強直。此外，部分患者伴有不同程度的髖關節、眼、肺、心血管、腎等脊柱 外病變。AS在白種人群中的發病率約為1 %?3 %，我國AS患病率約為0. 2-0. 6 %，其中 60%以上的患者伴有髖關節受累，致使20%以上AS患者殘疾，炎症主要累及關節囊、肌腱 和韌帶的骨附著點，導致局部關節粘連強直，活動受限。臨床上至今尚缺乏可明顯緩解和控 制疾病發展的藥物。AS屬多基因疾病，具有明顯的遺傳傾向，雖然通常認為遺傳與免疫因素 在AS發病中起主導作用，但確切的病因與發病機制仍不清楚。
[0003] 目前進行AS遺傳病因研究，多採用SNP作為基因組標誌的關聯分析方法，是有效 的，已得到證明。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在 人群中的頻率需>1 %，SNPs是雙等位基因標記，這種單鹼基變化中有70. 1 %為同型鹼基之 間的轉換：如G/A或T/C，29. 1%為發生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C(胞嘧啶）是人類基因 組中最易發生變化的位點，因為大多數是甲基化胞嘧啶，能夠自發脫氨基轉換為T(胸腺嘧 啶），SNP包含了已知多態性的80-90%，是最常見的遺傳變異。
[0004] 由於生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。 SNPs在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍，總數可達3百萬個。SNP以其密度高（平均 每Ikb就有1個）、代表性強（位於基因內部的SNP可能直接影響蛋白質結構或表達水平）、 遺傳穩定性好（同微衛星多態性比較而言）、易於自動化分析（因 SNP在人群中多為雙等位 基因標記，可簡單以"+/ -或1/0"直接分型）等特點成為很好的遺傳標誌。
[0005] 1973年，Brewerton等首先發現了與AS強相關的人類白細胞抗原-B27(HLA-B27)。 隨著研究的進展，與AS相關的其他易感基因如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介 素-I(IL-I)陸續被識別。
[0006] TNXB(tenascin XB，細胞粘合素 XB)基因位於6q2L 3,全長68220bp。該基因定位 於人類白細胞抗原III區域，與免疫反應及自身性免疫疾病發生發展等密切相關。
[0007] TNXB基因與AS相關聯的研究近些年尚無報導。
【發明內容】
[0008] 本發明的主要目的是提供一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑盒，包括PCR引物 和含有該引物的試劑盒。
[0009] 本發明的第二個目的是提供一種檢測強直性脊柱炎易感性基因的方法。
[0010] 為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：
[0011] 一種檢測強直性脊柱炎易感性的核酸序列，具有序列表SEQ ID No. 1所示的鹼 基序列，其32063600位置即是變異位點，以字母"R"標示出。該核酸序列為TNXB基因部 分序列。圖1為TNXB基因結構及其多態性變異位點的示意圖，附圖中包含有多個外顯子， 32063600標在TNXB基因外顯子區的相應位置。
[0012] 一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法，通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試 者的TNXB基因外顯子區32063600位置多態性位點的基因型，預測受試者對強直性脊柱炎 的易感性：TNXB基因外顯子區32063600位置的基因型為AA時，受試者的易感性最低；攜帶 G等位基因時，受試者的易感性升高。
[0013] 一組檢測強直性脊柱炎易感性的引物，引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示，長度分別為23bp和25bp，而且可以特異性地擴增出包含 有SEQ ID No. 1所示序列中32063600位置的產物。
[0014] 本發明提供了一種檢測強直性脊柱炎易感性的診斷試劑盒，其中含有本發明特異 性擴增TNXB基因外顯子區32063600位置的引物對和用於PCR擴增檢測的試劑盒的常規組 件、試劑、緩衝液等，本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。本發明試劑盒中的全 部組分、含量、來源和使用方法如下：
[0015] 一種檢測強直性脊柱炎易感基因的試劑盒，由以下試劑組成：
[0016] (1) 10 μ L 10XPCR 緩衝液；
[0017] (2) 2 μ L IOmMdNTP 混合液；
[0018] (3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0019] (4) 1 μ L Fl引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ;
[0020] (5) 1 μ L Rl引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ;
[0021] (6) 8 μ L 10 X LC-Green Plus 飽和螢光染料；
[0022] (7)2μ L寡核苷酸內參，由4種內參引物各0. 5μ L組成，濃度為lOpmol/μ L，其中 低溫寡核苷酸內參上遊引物F為SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內參下遊 引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參上遊引物F為SEQ ID NO. 6 所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參下遊引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；
[0023] (8) 64 μ L 純水。
[0024] 使用方法：
[0025] (I)PCR擴增：通過PCR擴增TNXB基因外顯子區部分片段，製備混合液：10XPCR反 應緩衝液 1 μ L，10mM/LdNTP0· 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 2 μ L，10pM/L 上遊引物 0· 1 μ L，10pM/L 下遊引物〇. 1 μ L，IOXLC-Green Plus飽和螢光染料0. 8 μ L，寡核苷酸內參0. 2 μ L(高、低 溫寡核苷酸內參上、下遊引物各0.05 μ L)(序列見表1)，基因組DNAl μ L，加純水至10 μ L。 PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性30s，69°C退火30s，72°C延伸4s，總共45個循 環，72°C總延伸2min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理：95°C 30s， 25°〇2!1^11，941：308,241：21^11。？〇?前於每一體系中加入2(^1^的石蠟油，以防止液體揮 發。
[0026] (2)基因型判定：將PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Light Scanner TMHR-I96 上進行HRM分析，用Light Scanner Call IT軟體對採集後的曲線進行分析，根據烙解曲線 的差異判定基因型。
[0027] TNXB基因外顯子區32063600位置多態性位點在製備診斷強直性脊柱炎的試劑中 的用途。
[0028] TNXB基因外顯子區32063600位置多態性位點在製備治療強直性脊柱炎的藥物中 的用途。
[0029] 本發明的測定方法測定了來源於人的基因組DNA，樣品來源無限制，如：體液（血 液、腹水及尿液等）、組織細胞（如肝組織）等。通過提取和純化這些樣品可製備基因組 DNA。調整基因組DNA的濃度，使其儘可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴增出含TNXB 基因突變位點的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含TNXB基因變異點的 DNA片段獲得的樣品，特別適於用作測定材料。
[0030] 在進行基因輔助診斷時，本發明優先適用於測定根據TNXB基因的突變類型存在 的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應於用於測定TNXB基 因突變類型的方法。按採用的測定方法來選擇適當的特定試劑，如DNA片段和/或用於PCR 擴增步驟的引物。
[0031] 本發明的優點是：本發明首次闡明了 TNXB基因外顯子區32063600位置多態性位 點與AS的相關性，提供了一種預測AS易感性的方法，該方法可用於AS的預防、輔助診斷和 治療，還可以用於新藥研發。
[0032] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步敘述，以便公眾對
【發明內容】
有更 深入的了解，並非對本發明的限制，凡依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換， 均屬於本發明的保護範圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033] 圖1為TNXB基因結構及其多態性變異位點的示意圖
[0034] 圖2為TNXB基因變異位點經HRM方法的基因分型圖
[0035] 圖3為TNXB基因變異位點的測序圖
【具體實施方式】
[0036] 用於下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下：
[0037] 10XPCR 緩衝液：IOmM Tris-HCI(pH = 8. 3)，500mM 氯化鉀（KCl)，IOmM 氯化鎂 (MgCl2)，0· 01% (W/V)白明膠
[0038] dNTP :脫氧核苷三磷酸
[0039] EDTA :乙二胺四乙酸二鈉
[0040] TE : IOmM Tris-HCl (pH = 7. 5)，ImM EDTA (pH = 8. 0)
[0041] 實施例I :血液樣本收集和基因組DNA的提取：
[0042] - ·病例入選：
[0043] 按紐約1984年的修訂診斷標準入選病例，共選取來自寧夏地區無血緣關係的AS 患者273例（年齡：8-71歲，平均27歲），同地區的健康對照志願者240例（年齡：18-21 歲，平均19歲）。所有受檢者均為漢族且籤署書面知情同意書，這項研究得到衛生部北京醫 院，衛生部老年醫學研究所倫理審核委員會的認可，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》：人 體醫學研究的倫理原則。
[0044] 二·根據下列方法，製備人基因組DNA。
[0045] 1.在已標號的I. 5mLEP管中加 ΙΟΟΟμ L紅細胞裂解液，後加入400μ LEDTA抗凝血 (抗凝血加入前顛倒混勻3-5次），顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；
[0046] 2. 13000rpm離心30秒後，除去上清液；
[0047] 3.在所得沉澱中加480 μ L核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻後加入20 μ L蛋白酶 Κ(用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶Κ)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，（期間不時上下混勻， 確保無凝塊）；
[0048] 4.拿出後降至室溫，加300μ L蛋白沉澱液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm 離心2分鐘；
[0049] 5.將上清液移至新EP管中，加入670 μ L預冷的異丙醇，充分顛倒混勻（10次以 上），可見線狀DNA逐漸形成小團塊，13000rpm離心2分鐘；
[0050] 6.棄上清液並確保沉澱留在EP管中，加入670yL70%乙醇，上下顛倒混勻， 13000rpm離心2分鐘；
[0051] 7.棄上清，使管內乙醇揮發乾淨；
[0052] 8.加入TE溶液（400 μ L)，充分溶解，對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分 析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/ μ L，置於4°C備用，剩餘基因組DNA 置-20°C冰箱保存。
[0053] 實施例2 : SNP的識別鑑定
[0054] 本發明採用PCR-高解析度熔解曲線（HRM)分析法和PCR測序技術同時對TNXB基 因外顯子區32063600位置（其等位位點為A/G)的基因型進行檢測。圖2為TNXB基因變 異位點經HRM方法的基因分型圖、圖3為TNXB基因變異位點的測序圖。
[0055] 一 · PCR-HRM引物的確定
[0056] 從Genebank中查取32063600位置附近的DNA鹼基序列（Seq ID Ns 1)，引物設計 在01 ig〇7. 0軟體下完成。目的片段定位在TNXBB基因外顯子區，全長52bp，特異性引物序 列如下：
[0057] Fl :5, -TTTTACGTGGGCTATGGCGGTGA-3'（SEQ ID No. 2)
[0058] Rl :5, -TTTTTCGAGGCTCTTCCTTCCCGCA-3'（SEQ ID No. 3)
[0059] 二· PCR反應體系及反應條件
[0060] 通過PCR擴增TNXB基因外顯子區部分片段，PCR反應體系為：10 XPCR反應緩衝 液 1 μ L，10mM/LdNTP 0· 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 2 μ L，10pM/L 上遊引物 0· 1 μ L，10pM/L 下遊 引物0. I μ L，IOXLC-Green Plus飽和螢光染料0. 8 μ L，寡核苷酸內參0. 2 μ L(高、低溫寡 核苷酸內參上、下遊引物各0.05 μ L)(序列見表1)，基因組DNAl μ L，加去離子水至10 μ L。 PCR時於每一體系中加入20 μ L石蠟油，防止液體揮發。PCR反應條件為95°C預變性3min， 95°C變性30s，69°C退火30s，72°C延伸4s，總共45個循環，72°C總延伸2min。在進行高分 辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理：95°C 30s，25°C 2min，94°C 30s，24°C 2min。
[0061] 表I :高、低溫寡核苷酸內參引物序列、退火溫度及產物片段長度
[0062]
【權利要求】
1. 一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法，其特徵在於：通過提取宿主細胞的基因組 DNA，測定受試者的TNXB基因外顯子區32063600位置多態性位點的基因型，預測受試者對 強直性脊柱炎的易感性。
2. 根據權利要求1所述的一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法，其特徵在於：TNXB基 因外顯子區32063600位置的基因型為AA時，受試者的易感性最低；攜帶G等位基因時，受 試者的易感性升高。
3. -組檢測強直性脊柱炎易感性的引物，其特徵在於：引物的核苷酸序列分別為序列 表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。
4. 一種檢測強直性脊柱炎易感基因的試劑盒，其特徵在於由以下試劑組成： (1) 10yL10XPCR 緩衝液； (2) 2 μ LlOmMdNTP 混合液； (3) 2 μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/ μ L ; (4) 1 μ L F1引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ; (5) 1 μ L R1引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ; (6) 8 μ L10 X LC-Green Plus 飽和螢光染料； (7) 2 μ L寡核苷酸內參，由4種內參引物各0. 5 μ L組成，濃度為lOpmol/ μ L，其中低溫 寡核苷酸內參上遊引物F為SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內參下遊引物R 為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參上遊引物F為SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參下遊引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； (8) 64 μ L 純水。
5. ΤΝΧΒ基因外顯子區32063600位置多態性位點在製備診斷強直性脊柱炎的試劑中的 用途。
6. ΤΝΧΒ基因外顯子區32063600位置多態性位點在製備治療強直性脊柱炎的藥物中的 用途。
【文檔編號】C12N15/11GK104293958SQ201410547028
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】楊澤, 張玉榮, 趙承孝, 劉銘, 王建業, 孫亮, 史曉紅, 魏東, 朱小泉, 周林, 張耀光, 王娜娜, 惠娟, 趙帆, 楊帆, 張政, 唐雷 申請人:衛生部北京醫院